等離子體活化水對(duì)希瓦氏菌及鱸魚品質(zhì)的影響

劉舒彥 李海藍(lán) 李湃 吳迪 吳雨晨 鉏曉艷

摘 要：研究等離子體活化水（plasma-activated water，PAW）對(duì)希瓦氏菌及染菌鱸魚塊品質(zhì)的影響。利用比濁法、平板計(jì)數(shù)法研究PAW制備時(shí)間（0、15、30、45、60 min）對(duì)希瓦氏菌生長(zhǎng)的抑制作用。根據(jù)質(zhì)構(gòu)、菌落總數(shù)、總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量和感官評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究PAW浸泡時(shí)間（0、7.5、15.0、22.5、30.0 min）對(duì)染菌鱸魚塊腐敗的抑制作用。結(jié)果表明：PAW對(duì)希瓦氏菌生長(zhǎng)的抑制效果明顯，其中制備時(shí)間60 min組的抑菌率高達(dá)99.9%，顯著高于其他制備時(shí)間組（P<0.05）;PAW60浸泡染菌魚塊30 min時(shí)，魚肉菌落總數(shù)最低降至（3.01±0.02）（lg（CFU/g）），顯著低于其他制備時(shí)間組（P<0.05）;貯藏5 d時(shí)，PAW60處理組魚肉TVB-N含量明顯低于對(duì)照組，貯藏2 d時(shí)，PAW60組魚肉的硬度和黏聚性以及感官指標(biāo)評(píng)分與對(duì)照組相比均顯著提高（P<0.05）。綜上，PAW60浸泡處理30 min對(duì)希瓦氏菌的抑制作用良好，可降低魚肉腐敗，提高其感官和質(zhì)構(gòu)品質(zhì)。

關(guān)鍵詞：加州鱸;等離子體活化水;希瓦氏菌;抑制作用

Abstract： The aim of this study was to investigate the effects of plasma-activated water （PAW） on inhibiting Shewanella growth and on improving the quality of fish meat artificially contaminated with this bacterium. The turbidimetric and plate count methods were used to study the inhibition effect of PAWs prepared at different plasma discharge times （0， 15， 30， 45 and 60 min） on the growth of Shewanella. The inhibitory effect of different PAW immersion times （0， 7.5， 15.0， 22.5 and?30.0 min） on the spoilage of infected fish pieces was studied by monitoring the changes in texture， total number of colonies， total volatile basic nitrogen （TVB-N） content and sensory quality. Results showed that there was an obvious inhibitory effect of PAW on the growth of Shewanella. The inhibition rate of PAW at 60 min of plasma discharge time （PAW60） was up to 99.9%， significantly higher than that of the other groups （P < 0.05）， and after being soaked in PAW60 for 30 min， the total number of colonies in fish meat reduced to the lowest value of （3.01 ± 0.02） （lg（CFU/g））， which was significantly lower than that of the other plasma discharge time groups （P < 0.05）. After 5 days of storage， the TVB-N content of the PAW60 treatment group was significantly lower than that of the control group （P < 0.05）. After 2 days of storage， the hardness， cohesiveness and sensory score of fish meat in the PAW60 group were improved compared with the control group （P < 0.05）. In conclusion， PAW60 treatment for 30 min has a good inhibitory effect on Shewanella and can reduce fish meat spoilage and improve its sensory and texture quality.

Keywords： Micropterus salmoides; plasma-activated water; Shewanella; inhibitory effect

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200805-186

中圖分類號(hào)：TS254.4 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2020）09-0025-06

引文格式：

劉舒彥， 李海藍(lán)， 李湃， 等. 等離子活化水對(duì)希瓦氏菌及鱸魚品質(zhì)的影響[J]. 肉類研究， 2020， 34（9）： 25-30. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200805-186. ? ?http：//www.rlyj.net.cn

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加州鱸（Micropterus salmoides），又稱花鱸、賽花、鱸板、四肋魚等，與黃河鯉魚、鱖魚及黑龍江興凱湖大白魚并稱為“中國(guó)四大淡水名魚”[1]。近年來(lái)，鱸魚養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展，產(chǎn)量逐年遞增，2019年我國(guó)鱸魚養(yǎng)殖產(chǎn)量已達(dá)47.78 萬(wàn)t[2]。鱸魚因其肉質(zhì)鮮美，富含必需氨基酸、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，深受消費(fèi)者歡迎。魚肉在冷藏過(guò)程中易受腐敗微生物的影響，發(fā)生變質(zhì)，其中優(yōu)勢(shì)腐敗菌是魚肉貯藏品質(zhì)好壞的決定性因素[3]。冷藏鱸魚中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌有希瓦氏菌屬和假單胞菌屬，其中希瓦氏菌的致腐能力大于假單胞菌[4]。

等離子體活化水（plasma-activated water，PAW）也稱為等離子體處理水，是指通過(guò)在水中或水表面進(jìn)行等離子體放電而得到的液體[5]。PAW具有良好的滅菌效果，水中積累的大量活性基團(tuán)與細(xì)胞內(nèi)活性氧協(xié)同作用可能是微生物細(xì)胞膜失活的主要原因[6]。在食品工業(yè)中，PAW對(duì)果蔬殺菌保鮮、細(xì)菌生物被膜的失活、肉制品的殺菌保鮮護(hù)色等均具有一定作用[7]。采用PAW處理方法可以有效降低馬鈴薯表面的微生物數(shù)量[8]，有效抑制染菌三文魚片表面單增李斯特菌生長(zhǎng)并減緩總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量和pH值上升[9]。以上研究表明，PAW為農(nóng)產(chǎn)品保鮮提供了一種新型綠色殺菌方式，對(duì)產(chǎn)業(yè)應(yīng)用具有一定的參考和指導(dǎo)作用，但PAW在鱸魚中的應(yīng)用文獻(xiàn)報(bào)道還很少。

本研究以鱸魚肉為研究對(duì)象，通過(guò)研究PAW的物理性質(zhì)，測(cè)定魚肉菌落總數(shù)、TVB-N含量、質(zhì)構(gòu)特性和感官評(píng)價(jià)指標(biāo)等，綜合評(píng)價(jià)PAW對(duì)希瓦氏菌的抑制效果及對(duì)鱸魚肉品質(zhì)的影響，為PAW在鱸魚保鮮中的應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鱸魚購(gòu)買于武漢市洪山區(qū)武商量販（農(nóng)科城店）。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司;無(wú)水乙醇、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸、無(wú)水碳酸鈉、硼酸、硫酸銅、硫酸、酚酞、甲基紅、溴甲酚綠、高氯酸（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FSH-2A可調(diào)高速均質(zhì)機(jī) 常州越新儀器制造有限公司;3K-15冷凍離心機(jī) 德國(guó)希格瑪實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)公司;SW-CJ-K超凈工作臺(tái) 蘇州華宏凈化技術(shù)有限公司;JBQ-ZD全溫振蕩器 常州普天儀器制造有限公司;PG-3000等離子液體處理發(fā)生器 南京蘇曼等離子科技有限公司;CRH-150生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;UH5300分光光度計(jì) 日本日立儀器有限公司;TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)SMS公司;JY/YP電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;PB-10 pH計(jì) 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PAW的制備

選取低溫等離子體實(shí)驗(yàn)裝置上數(shù)字0、1、3、5不同的電源檔位（對(duì)應(yīng)的功率分別為0、0.56、0.90、1.18 kW）處理娃哈哈純凈水，制備PAW。制備過(guò)程中每5 min測(cè)定1 次PAW的溫度和pH值，共測(cè)定1 h，每次平行測(cè)定3 次，結(jié)果取平均值。根據(jù)測(cè)定結(jié)果確定PAW的最佳制備功率。

1.3.2 PAW對(duì)希瓦氏菌的影響

1.3.2.1 希瓦氏菌的培養(yǎng)

挑取1 環(huán)希瓦氏菌于7.5 mL無(wú)菌生理鹽水試管中，用渦旋儀振蕩混勻，取0.1 mL該菌液涂布于PDA平板上，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)15～18 h。

1.3.2.2 原始菌液的制備

挑取1 環(huán)PDA平板上的菌落到7.5 mL PDB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)15～18 h后即為原始菌液。將該菌液進(jìn)行梯度稀釋，選取10-5、10-6、10-7 3 個(gè)梯度進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

1.3.2.3 PAW對(duì)希瓦氏菌菌落生長(zhǎng)的影響

在PAW最佳制備功率下，設(shè)置5 個(gè)放電時(shí)間：0、15、30、45、60 min（所得PAW分別記為PAW0、PAW15、PAW30、PAW45、PAW60）。吸取0.5 mL原始菌液與2 mL上述不同放電時(shí)間（即制備時(shí)間）PAW于10 mL離心管中，混合均勻。再吸取0.1 mL混合液至PDA平板，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況，拍照并計(jì)數(shù)[10]。

1.3.2.4 PAW制備時(shí)間對(duì)希瓦氏菌的抑制效果

將PDB液體培養(yǎng)基分裝為50 mL/瓶，滅菌，按體積比1∶1分別加入PAW0、PAW15、PAW30、PAW45、PAW60后搖勻，再加入3 mL原始菌液，置于轉(zhuǎn)速為90 r/min的恒溫?fù)u床上37 ℃培養(yǎng)18 h。觀察是否有明顯渾濁，在波長(zhǎng)為410 nm條件下用分光光度計(jì)測(cè)定菌液的吸光度，并按式（1）計(jì)算抑菌率[11]。空白管為體積比1∶1的無(wú)菌PDB培養(yǎng)基和PAW。

式中：At為希瓦氏菌經(jīng)不同制備時(shí)間PAW培養(yǎng)18 h后的吸光度;A0為空白管培養(yǎng)18 h后的吸光度。

1.3.3 PAW對(duì)魚肉希瓦氏菌的抑制效果

將新鮮鱸魚背部肌肉切成2 cm×2 cm×2 cm塊狀，分裝入袋，4 kGy條件下輻照殺菌，放入4 ℃冰箱冷藏，待用。將希瓦氏菌原始菌液分裝到50 mL離心管，5 000 r/min、4 ℃離心10 min，取沉淀，用生理鹽水制成菌液，控制其菌體濃度為107 CFU/mL。把預(yù)處理后的魚塊（n=72）分批置于1 000 mL菌液中浸泡3 min，取出瀝干，再分別放入PAW0、PAW15、PAW30、PAW45、PAW60中分別浸泡0、7.5、15.0、22.5、30.0 min。取出經(jīng)PAW處理后的魚塊，瀝干至不滴水狀態(tài)，放入無(wú)菌袋中用10 mL生理鹽水洗脫菌落，所得洗液梯度稀釋至10-3，取0.1 mL涂布平板，放置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h后觀察菌落生長(zhǎng)趨勢(shì)，拍照并計(jì)數(shù)，確定最適的PAW浸泡時(shí)間[10]。菌落總數(shù)測(cè)定參照GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[12]。

1.3.4 PAW對(duì)染菌魚塊品質(zhì)指標(biāo)的影響

染菌魚塊的前處理同1.3.3節(jié)，PAW最適浸泡時(shí)間處理后進(jìn)行加速腐敗實(shí)驗(yàn)[13-14]。魚塊37 ℃貯藏0、1、2、3、4、5 d后，分別測(cè)定TVB-N含量、質(zhì)構(gòu)和感官指標(biāo)。未經(jīng)PAW處理的染菌魚塊作為對(duì)照組。

1.3.4.1 TVB-N含量測(cè)定

參照GB 5009.228—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》[15]，取魚肉10 g，燒杯中加入0.6 mol/L高氯酸溶液90 mL，用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)，裝入50 mL離心管中，5 000 r/min、4 ℃離心10 min，用濾紙過(guò)濾取濾液備用。吸收瓶中加入10 mL 30 g/L硼酸，滴入5 滴甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑。反應(yīng)室加入5 mL濾液、5 mL 30 g/L NaOH和2 滴酚酞指示劑，加水密封。吸收液用0.01 mol/L標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定至淡粉色。同時(shí)做試劑空白，TVB-N含量按式（2）計(jì)算。

式中：V1為樣品消耗鹽酸體積/mL;V2為空白組消耗鹽酸體積/mL;m為樣品質(zhì)量/g;c為鹽酸濃度/（mol/L）。

1.3.4.2 質(zhì)構(gòu)測(cè)定

對(duì)鱸魚塊進(jìn)行質(zhì)地剖面分析，質(zhì)構(gòu)儀設(shè)定參數(shù)為：探頭P/36R，測(cè)前、測(cè)中、測(cè)后速率均為1.00 mm/s，下壓距離6 mm，觸發(fā)力5 g，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次。選取硬度、黏聚性、彈性、咀嚼性4 個(gè)指標(biāo)進(jìn)行分析。

1.3.4.3 感官評(píng)價(jià)

參照Barbosa等[16]的方法，依據(jù)魚肉的色澤、氣味、肌肉紋理和組織彈性進(jìn)行感官評(píng)定，評(píng)定人員由6 名經(jīng)過(guò)專門訓(xùn)練的人員組成，具體評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。采用加權(quán)評(píng)分法，各指標(biāo)的平均分乘以其權(quán)重后相加之和為總評(píng)分值，低于5 分則視為不可接受。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。運(yùn)用單因素方差分析的Duncans程序進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 制備時(shí)間對(duì)PAW pH值和溫度的影響

由圖1可知，功率越高，放電時(shí)間（即制備時(shí)間）越長(zhǎng)，PAW的pH值越低。放電5 min時(shí)1.18 kW組pH值急劇下降至3.21±0.52，60 min時(shí)降至最低點(diǎn)2.04±0.33。原因可能是功率越高，放電時(shí)間越長(zhǎng)，PAW的電離程度越強(qiáng)，溶液中含有的氫離子、酸根離子等越多，導(dǎo)致pH值越低[17]。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)照組PAW溫度保持在（26.6±0.4） ℃;不同功率制備的PAW溫度在前20 min急劇上升，40～60 min時(shí)，各組均達(dá)到最高溫度，其中1.18 kW組溫度超過(guò)儀器使用上限40 ℃?？紤]最佳滅菌效果和儀器使用上限，選擇功率0.90 kW制備PAW，冷卻至室溫后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

2.2 PAW制備時(shí)間對(duì)希瓦氏菌的影響

菌落總數(shù)是反映食品品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)[18-19]。由表2和圖2可知，PAW0（對(duì)照）組希瓦氏菌菌落總數(shù)多不可計(jì)，與其相比PAW組有明顯抑菌作用，且隨PAW制備時(shí)間延長(zhǎng)，PAW組菌落總數(shù)降低，抑菌率顯著上升（P<0.05），抑菌效果與PAW制備時(shí)間呈正相關(guān)。殺菌機(jī)理可能與PAW中含有的大量活性粒子（OH-、H2O2、O3和氮氧化物等）與細(xì)菌肽聚糖發(fā)生氧化作用、破壞微生物細(xì)胞壁[20]，引起菌體表面蛋白的變性和核酸水解，破壞酶類的活性等[21-22]有關(guān)。其中PAW60的抑菌率高達(dá)99.9%，顯著高于其他組（P<0.05），說(shuō)明制備60 min的PAW對(duì)希瓦氏菌的抑菌效果最好。

2.3 PAW對(duì)染菌魚塊菌落總數(shù)的影響

由表3和圖3可知，隨著PAW制備時(shí)間和浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落總數(shù)均顯著減少（P<0.05）。其中PAW制備時(shí)間為60 min、浸泡時(shí)間為30 min時(shí)，染菌魚塊的菌落總數(shù)為（3.01±0.02） （lg（CFU/g）），顯著小于其他各組（P<0.05），與康超娣[23]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明此條件對(duì)染菌魚塊的抑菌效果最好。

因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中以PAW60浸泡30 min為統(tǒng)一條件處理染菌魚塊，魚塊37 ℃貯藏0、1、2、3、4、5 d后進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

2.4 PAW60對(duì)染菌魚塊TVB-N含量的影響

TVB-N含量是評(píng)價(jià)動(dòng)物性食品腐敗程度的重要指標(biāo)之一[24]。由圖4可知，魚塊TVB-N含量隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，貯藏第5天，PAW60浸泡處理30 min后染菌魚塊的TVB-N含量顯著低于對(duì)照組（P<0.05），降幅達(dá)16.83%。TVB-N是蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的氨及胺類等堿性含氮物質(zhì)，與菌落總數(shù)呈正相關(guān)[25]。經(jīng)PAW60浸泡處理30 min后染菌魚塊腐敗程度比對(duì)照組低。

2.5 PAW60對(duì)染菌魚塊質(zhì)構(gòu)的影響

質(zhì)構(gòu)是檢測(cè)肉制品新鮮程度的重要依據(jù)[26-27]。加速腐敗實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，貯藏第4天魚肉完全腐敗，質(zhì)構(gòu)數(shù)據(jù)無(wú)法采集，因此只統(tǒng)計(jì)貯藏前3 d的數(shù)據(jù)。由圖5可知，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，硬度、黏聚性、咀嚼性均先下降后上升，彈性先下降后上升再下降?？赡苡捎谖⑸锏淖饔?，魚肉腐敗程度加深，導(dǎo)致硬度等質(zhì)構(gòu)指標(biāo)數(shù)值下降，貯藏第3天由于魚肉表面水分蒸發(fā)，魚肉變干，硬度等上升。貯藏2 d時(shí)，染菌魚塊除彈性外各指標(biāo)值均降至最低，其中PAW60處理組咀嚼性與對(duì)照組無(wú)明顯差異，硬度和黏聚性明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明PAW60浸泡處理30 min對(duì)染菌魚塊的腐敗及質(zhì)構(gòu)劣變有緩解作用。

2.6 PAW60對(duì)染菌魚塊感官評(píng)分的影響

感官評(píng)價(jià)是一種直接通過(guò)嗅覺(jué)、味覺(jué)來(lái)感受肉品新鮮程度的重要指標(biāo)，是目前消費(fèi)者評(píng)價(jià)肉品新鮮程度的主要方式[28]。由表4可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，染菌魚塊的色澤、氣味、肌肉紋理、組織彈性等感官指標(biāo)評(píng)分均顯著下降（P<0.05），加權(quán)計(jì)算后總評(píng)分也顯著降低（P<0.05）。貯藏3 d后，PAW60處理組和對(duì)照組魚塊的感官總評(píng)分均低于5 分，判定為不可接受。貯藏0～1 d時(shí)，PAW60組總評(píng)分與對(duì)照組無(wú)顯著差異。貯藏2 d時(shí)，PAW60組總評(píng)分顯著高于對(duì)照組（P<0.05）;與對(duì)照組相比，此時(shí)PAW60組魚塊色澤、氣味、肌肉紋理、組織彈性分別提高10.00%、13.87%、6.38%和9.67%?？傮w來(lái)說(shuō)，37 ℃貯藏條件下，PAW60浸泡處理30 min魚塊的感官評(píng)分優(yōu)于對(duì)照組。

3 結(jié) 論

研究PAW對(duì)希瓦氏菌的抑制作用和對(duì)染菌魚塊品質(zhì)的影響。結(jié)果表明：PAW的pH值隨著放電反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，溫度的變化趨勢(shì)相反;功率為0.9 kW、放電60 min時(shí)，PAW的pH值接近于2，溫度接近于40 ℃;放電時(shí)間越長(zhǎng)，PAW對(duì)希瓦氏菌的抑制效果越好，放電反應(yīng)60 min可抑制99.9%的希瓦氏菌，效果最佳;PAW60處理染菌魚塊30 min時(shí)，菌落總數(shù)相較于其他實(shí)驗(yàn)組顯著降低（P<0.05）;PAW60處理后染菌魚塊的TVB-N含量明顯低于對(duì)照組，質(zhì)構(gòu)指標(biāo)和感官指標(biāo)優(yōu)于對(duì)照組。以上結(jié)果說(shuō)明，放電時(shí)間60 min制備的PAW浸泡魚塊30 min能有效抑制鱸魚腐敗并改善其貯藏品質(zhì)。

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