應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測江蘇省水稻苗期與成株期的惡苗病病菌

王曉莉 李哲 楊紅福

摘要：為了解2018年江蘇省田間水稻苗期和成株期的惡苗病病菌組成，應(yīng)用可特異性識別藤倉鐮孢、層出鐮孢、擬輪枝鐮孢和Fusarium andiyazi的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測疑似水稻惡苗病樣本47份。結(jié)果表明，苗期與成株期檢測到的惡苗病病菌組成不同，29份苗期樣本中檢測到藤倉鐮孢、層出鐮孢2種水稻惡苗病病菌的檢出率分別為8966%、27.59%;18份成株期樣本中4種惡苗病菌均有檢出，藤倉鐮孢、擬輪枝鐮孢、層出鐮孢和F. andiyazi的檢出率分別為88.89%、50.00%、27.78%、16.67%。結(jié)果表明，藤倉鐮孢是江蘇省水稻苗期與成株期惡苗病病原菌的優(yōu)勢種。

關(guān)鍵詞：水稻惡苗病;苗期;成株期;環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)

中圖分類號：S435.111.4+4?? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2020）20-0110-04

水稻惡苗病是水稻重要的病害之一，對世界各地的水稻均造成了不同程度的危害，嚴重可造成水稻減產(chǎn)50%[1]。水稻惡苗病對我國水稻也造成了不容忽視的危害，江蘇省水稻種植區(qū)在不同年份均發(fā)生過惡苗病大流行[2]。水稻惡苗病在整個發(fā)育期均可發(fā)生，其中苗期和成株期是最易發(fā)病的2個時期。苗期受害的典型癥狀為秧苗徒長、莖細長、葉片褪綠、須根不發(fā)達，有些受害秧苗表現(xiàn)為褪綠或矮化，受害嚴重的出現(xiàn)整株枯死。成株期水稻受害后癥狀與苗期相似，也會表現(xiàn)徒長，有些在莖間或節(jié)間倒生不定根，根部和莖基部腐爛，嚴重的整株枯死[3]。水稻惡苗病病原菌主要通過種子傳播[4]。由于我國尚未發(fā)現(xiàn)對惡苗病高抗的水稻品種，因此，目前有效的防治手段是使用化學(xué)藥劑進行防治，處理的最佳時期為播種前浸種[5]。

在已知的4種水稻惡苗病病原菌中，對水稻致病力最強的是藤倉鐮孢（Fusarium fujikuroi），其次是層出鐮孢（F. proliferatum）、擬輪枝鐮孢（F. verticilliodes）、F. andiyazi[6]。它們的寄主非常廣泛，包括水稻、玉米、高粱、大豆等重要作物[7-9]。上述病原菌可分泌次生代謝物，如赤霉素、鐮孢菌素和伏馬菌素等。赤霉素為促生長素，可促進細胞快速伸長、細胞間隙增大，使植株節(jié)間伸長表現(xiàn)徒長現(xiàn)象;其他代謝物可引起葉片褪綠、植株矮化、死苗等癥狀[10]。在上述4種病原菌中，藤倉鐮孢菌引起的水稻惡苗病為系統(tǒng)侵染，病菌在發(fā)病水稻全株組織內(nèi)均有分布，其他3種病原菌為局部侵染，僅在發(fā)病植株的根部和莖基部有分布[11] 。

水稻惡苗病在江蘇省稻區(qū)廣有發(fā)生，但對在田間引起該病的病原菌組成及發(fā)生頻率知之甚少。本研究應(yīng)用筆者所在實驗室研發(fā)的可特異性識別藤倉鐮孢、層出鐮孢、擬輪枝鐮孢、F. andiyazi的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）檢測技術(shù)對2018年來自江蘇省不同地區(qū)采集的水稻苗期和成株期惡苗病疑似發(fā)病樣本進行檢測，以期了解當前江蘇省水稻苗期和成株期引起水稻惡苗病的病原菌組成及其出現(xiàn)頻率。旨在為該病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試樣本

2018年6月從江蘇省淮安、鹽城、南通、鎮(zhèn)江、南京、常州、無錫和蘇州等地采集水稻惡苗病疑似發(fā)病樣本29份（表1），2018年9—10月從江蘇省鹽城、淮安、南通、南京、鎮(zhèn)江、無錫、常州和蘇州等地采集水稻成株期疑似惡苗病樣本18份（表3）。將收集來的樣本裝袋，記錄信息并進行編號。

1.2 病組織DNA的提取

在每份疑似稻田發(fā)病樣本中選取10株發(fā)病癥狀明顯的植株剪取其根莖部，長度為5 mm左右，放進無菌培養(yǎng)皿內(nèi)混勻，其中一半病組織用來提取DNA，另一半用來分離病原菌。將植物組織放進滅菌的研缽中，用液氮研磨后，參照DNA提取試劑盒說明的步驟進行DNA提取，采用天根生化科技（北京）有限公司的新型植物基因組DNA提取試劑盒DNAsecure Plant Kit。提取好的DNA放-20 ℃冰箱保存。

1.3 水稻惡苗病病菌的LAMP檢測

采用筆者所在實驗室研發(fā)的4個分別可特異性檢測藤倉鐮孢、層出鐮孢、擬輪枝鐮孢和F. andiyazi的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測技術(shù)[12-14]，以從疑似惡苗病組織提取的DNA為模板進行檢測。

LAMP反應(yīng)體系為2.5 μL 10×ThermoPol Buffer [0.1% Trion-X，20 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L KCl，10 mmol/L （NH4）SO4，pH值=88]，4 μL MgSO4（50 mmol/L），4 μL 甜菜堿（5 mol/L），3.5 μL dNTPs（10 mmol/L），內(nèi)引物FIP和BIP（20 μmol/L）各2 μL，外引物F3和B3（10 μmol/L）各0.5 μL，環(huán)引物LF和LB（10 μmol/L）各1 μL，2 μL HNB（2.4 mmol/L），1 μL Bst DNA 聚合酶（8 U/μL）以及2 μL模板（從惡苗病組織中提?。〥NA。由反應(yīng)結(jié)束后的顏色直接判定結(jié)果，藍色為陽性，紫色為陰性。

1.4 水稻惡苗病病原菌的分離與驗證

為進一步驗證水稻惡苗病病菌的LAMP檢測結(jié)果，選取部分LAMP結(jié)果呈陽性的水稻惡苗病樣本的根莖部進行病原菌分離。用70%乙醇消毒 30 s，2%次氯酸鈉消毒2.5 min，無菌水沖洗3次，用滅菌濾紙片吸去表面自由水后放置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）培養(yǎng)基平板上，在25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)48 h。從長出的菌落邊緣切取2 mm×2 mm菌絲塊移至新的PDA培養(yǎng)基上純化。純化后的分離物根據(jù)形態(tài)和堿基序列比對進行鑒定。分離物DNA提取采用天根生化科技（北京）有限公司的新型植物基因組DNA提取試劑盒，通過擴增TEF-1α基因序列及序列比對進行惡苗病病菌菌種的鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 苗期水稻疑似惡苗病樣本的LAMP檢測結(jié)果

4個LAMP檢測體系對來自蘇州市鳳凰鎮(zhèn)的武運粳30稻苗的疑似發(fā)病樣本的檢測結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，可特異性識別藤倉鐮孢（4號反應(yīng)管）和層出鐮孢（5號反應(yīng)管）的LAMP檢測結(jié)果呈陽性，判定武運粳30稻苗發(fā)病樣本中包含藤倉鐮孢和層出鐮孢2種水稻惡苗病病菌，說明該樣本混合有由藤倉鐮孢或?qū)映鲧犳咔秩景l(fā)病的病苗，或是由兩者復(fù)合侵染引起的。其他2種病原菌（2號和3號反應(yīng)管）的LAMP檢測結(jié)果呈陰性，表明武運粳30的樣本中不含擬輪枝鐮孢和F. andiyazi。

供試29份苗期水稻惡苗病疑似樣本的檢測結(jié)果（表1）顯示，有26份檢測到藤倉鐮孢，檢出率達89.66%;8份樣本檢出層出鐮孢，檢出率為2759%;有3份未檢測出惡苗病病菌。

在上述26份陽性樣本中，有18份僅檢測到藤倉鐮孢，說明上述發(fā)病樣本是由該病原菌單獨侵染的;另有8份樣本同時檢測到藤倉鐮孢和層出鐮孢，說明這8份發(fā)病樣本由兩者復(fù)合侵染引起。結(jié)果表明，藤倉鐮孢是2018年江蘇省水稻苗期惡苗病的優(yōu)勢病原菌。

2.2 苗期樣本的病原菌分離

為驗證苗期LAMP檢測結(jié)果的可靠性，選擇5份LAMP檢測陽性的秧苗樣本進行分離，包括武運粳30、2份來自蘇州市不同地域的南粳5055、南京市的1個未知品種，以及1份未檢測到惡苗病病菌的武運粳30稻苗樣本（表2）。分離結(jié)果表明，與LAMP的檢測結(jié)果一致，說明本研究的LAMP檢測結(jié)果是可靠的。

2.3 成株期疑似水稻惡苗病樣本的LAMP檢測結(jié)果與分離

由表3可知，有16份樣本檢測出藤倉鐮孢，檢出率達88.89%;擬輪枝鐮孢、層出鐮孢和F. andiyazi的陽性樣本數(shù)分別為9、5、3份，檢出率依次為50.00%、27.78%、16.67%。與苗期樣本的檢出率相比，擬輪枝鐮孢、層出鐮孢、F. andiyazi的檢出率有所升高。

在16份LAMP檢測陽性樣本中，有7個樣本僅檢測出藤倉鐮孢，說明這7份樣本是由藤倉鐮孢單獨侵染引起發(fā)病。另有9份樣本中檢測出2種或2種以上水稻惡苗病病菌，占總樣本的50.00%，表明這些發(fā)病樣本可能是由2種及2種以上惡苗病病菌復(fù)合侵染引起。在上述9份樣本中有2份樣本檢出4種惡苗病病菌，4份樣本中檢出3種惡苗病病菌（其中檢出藤倉鐮孢、層出鐮孢、擬輪枝鐮孢的樣本有3份，檢出藤倉鐮孢、擬輪枝鐮孢、F. andiyazi的有1份），3份樣本檢測出2種惡苗病病菌（均為藤倉鐮孢和擬輪枝鐮孢）。在供測的所有樣本中，未發(fā)現(xiàn)由層出鐮孢、擬輪枝鐮孢或F. andiyazi單獨侵染發(fā)病的樣本。

進一步對檢測陽性樣本進行病原菌分離，有14份樣本分離出藤倉鐮孢，7份樣本分離出層出鐮孢，1份樣本分離出F. andiyazi，所有樣本均未分離到擬輪枝鐮孢。需要指出的是，7份分離出層出鐮孢的樣本亦同時分離出藤倉鐮孢。病原菌分離與鑒定結(jié)果表明，藤倉鐮孢是江蘇省水稻成株期引起水稻惡苗病的優(yōu)勢種，其他3種惡苗病病菌亦有不同程度出現(xiàn)，但僅起輔助作用。關(guān)于擬輪枝鐮孢檢出率較高（50.00%）而分離率為零的原因尚不清楚?？赡茉蛑粸樘賯}鐮孢為強勢致病菌株，而擬輪枝鐮孢可能僅起伴隨侵染作用，并在發(fā)病組織中處極弱勢地位。

3 結(jié)論與討論

對2018年采集自江蘇省8個不同地區(qū)的47份水稻惡苗病疑似樣本進行LAMP檢測的結(jié)果表明，已知的4種惡苗病病菌在江蘇省均有分布，其中藤倉鐮孢是當前江蘇省稻區(qū)引起水稻惡苗病的優(yōu)勢種，其他3種惡苗病病菌也有檢測到，但罕有單獨侵染引起惡苗病的病例，而似多與藤倉鐮孢復(fù)合侵染引起發(fā)病，提示上述3種病原菌在江蘇省水稻惡苗病的發(fā)生中可能起輔助作用。本研究結(jié)果對了解當前江蘇省稻區(qū)水稻惡苗病病原菌組成具有重要價值，也可為該病的防治提供參考。

LAMP檢測技術(shù)是21世紀初建立的一種快速分子檢測技術(shù)，與傳統(tǒng)PCR方法相比，該檢測技術(shù)特異性更強、靈敏度更高（是傳統(tǒng)PCR的10～100倍）、檢測所需時間更短（完成1個樣本的檢測僅需2 h左右）。該檢測技術(shù)不需要昂貴的儀器設(shè)備，對模板DNA的質(zhì)量要求不高，可以從發(fā)病組織提取的DNA中特異性識別目標病原菌的靶標序列，因此可以在快速診斷病害的同時完成病原菌的鑒定[15]。本研究采用的4個惡苗病病菌的LAMP檢測技術(shù)體系，不僅可以用于惡苗病的快速診斷，也可用于種子攜帶惡苗病病菌的檢測和土壤帶菌檢測[11]。

種子攜帶惡苗病病菌是該病的重要傳播途徑。有報道指出，水稻種子主要攜帶藤倉鐮孢和層出鐮孢[16]，本研究對發(fā)病秧苗的檢測結(jié)果與袁詠天等的研究結(jié)果[16]基本一致。該病在大田成株期的病原菌組成較苗期復(fù)雜，提示擬輪枝鐮孢和F. andiyazi的主要侵染可能來自秧苗移植后的稻田田間。

參考文獻：

[1]Desjardins A E，Manandhar H K，Plattner R D，et al. Fusarium species from nepalese rice and production of mycotoxins and gibberellic acid by selected species[J]. Applied and Environmental Microbiology，2000，66（3）：1020-1025.

[2]秦玉金，劉學(xué)儒，楊 進，等. 水稻惡苗病重發(fā)原因淺析及防治對策[J]. 上海農(nóng)業(yè)科技，2013（5）：111，95.

[3]韓煥忠，朱 萍，王曉艷. 青岡縣水稻常見病害的發(fā)病癥狀及防治措施[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2018（1）：120，123.

[4]Matic S，Gullino M L，Spadaro D. The puzzle of bakanae disease through interactions between Fusarium fujikuroi and rice[J]. Frontiers in Bioscience，2017，9（2）：333-344.

[5]彭小林，王 軍，王遠堅. 2016年永新縣水稻惡苗病的發(fā)生特點及防治對策[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2018（8）：128，130.

[6]Wulff E G，Sürensen J L，Lübeck M，et al. Fusarium spp. associated with rice Bakanae：ecology，genetic diversity，pathogenicity and toxigenicity[J]. Environmental Microbiology，2010，12（3）：649-657.

[7]任 旭，朱振東，李洪杰，等. 輪枝鐮孢SSR標記開發(fā)及在玉米分離群體遺傳多樣性分析中的應(yīng)用[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（1）：52-66.

[8]Arias M M，Munkvold G P，Leandro L F. First report of Fusarium proliferatum causing root rot on soybean （Glycine max） in the United States[J]. Plant Disease，2011，95（10）：1316.

[9]Marasas W O，Rheeder J P，Lamprecht S C，et al. Fusarium andiyazi sp. nov.，a new species from sorghum[J]. Mycologia，2001，93（6）：1203-1210.

[10]Niehaus E M，Kim H K，Münsterktter M，et al. Comparative genomics of geographically distant Fusarium fujikuroi isolates revealed two distinct pathotypes correlating with secondary metabolite profiles[J]. PLoS Pathogens，2017，13（10）：e1006670.

[11]戎振陽. 應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)快速診斷水稻惡苗病[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018：43-52.

[12]Rong Z Y，Yuan Y T，Ye W W，et al. Rapid diagnosis of rice bakanae caused by Fusarium fujikuroi and F. proliferatum using loop-mediated isothermal amplification assays[J]. Journal of Phytopathology，2018，166（4）：283-290.

[13]曾丹丹，戎振洋，袁詠天，等. LAMP快速診斷由擬輪枝鐮孢引起的水稻惡苗病[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2018，41（2）：286-292.

[14]戎振洋，袁詠天，曾丹丹，等. 基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)快速診斷由Fusarium andiyazi引起的水稻惡苗病[J]. 植物病理學(xué)報，2018，48（2）：256-262.

[15]王芝涵，王春偉，高海馨，等. 引起玉米穗腐病的禾谷鐮刀菌LAMP快速檢測方法的建立[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2019，35（3）：581-585.

[16]袁詠天，戎振洋，葉文武，等. 應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測江蘇水稻種子攜帶的水稻惡苗病菌[J]. 中國水稻科學(xué)，2018，32（5）：493-500.宋兆欣，曹坳程，李 林，等. 50%草除靈懸浮劑防除稻旱輪作油菜田1年生闊葉雜草及其作物安全性評價[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（20）：114-117.