烤煙陳化與葉面微生物研究綜述

陳強(qiáng) 姜振玲 王玉華 古明光 王德權(quán) 席元肖 杜傳印

摘要 ? ?烤后煙葉表面存在大量微生物，研究表明，微生物對煙葉品質(zhì)的提升有著重要影響。本文分析了煙葉陳化期間品質(zhì)變化及機(jī)理，綜述了煙葉表面微生物種類及動態(tài)變化，并就微生物在改良煙葉品質(zhì)方面的應(yīng)用展開討論，以期為煙草行業(yè)提質(zhì)增效、降焦減害提供參考。

關(guān)鍵詞 ? ?烤煙;微生物;種類;應(yīng)用

中圖分類號 ? ?TS41+4 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2020）20-0203-03 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）

煙草是世界上廣泛種植的經(jīng)濟(jì)作物，其主要收獲器官為葉片。煙草產(chǎn)業(yè)在國民經(jīng)濟(jì)中占有重要的地位。為提升煙葉品質(zhì)，提高烤后煙葉的工業(yè)可用性，并進(jìn)一步提升中國煙草在國際市場上的競爭力，需要進(jìn)一步重視提高煙草及其制品的質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)，煙葉品質(zhì)不僅與品種、生態(tài)[1-2]、管理措施及烘烤工藝等前期各項(xiàng)因素存在相關(guān)性，同時(shí)與烤后煙葉儲存條件存在顯著的相關(guān)性，這其中包括微生物活動。

1 ? ?煙葉陳化期間品質(zhì)變化及機(jī)理

1.1 ? ?煙葉陳化對品質(zhì)的影響

鮮煙葉經(jīng)歷烘烤與打葉復(fù)烤過程后，煙葉質(zhì)量雖有一定的改善與提高[3]，但仍然存在青雜氣過重、刺激性高、香氣質(zhì)單調(diào)和香氣量不足[4]等缺陷，并不能完全滿足卷煙工業(yè)的需求，只有經(jīng)歷陳化過程才能使煙葉品質(zhì)得到進(jìn)一步提升，滿足工業(yè)可用性需求。陳化期間煙葉主要變化表現(xiàn)為：色度變強(qiáng)并且色澤趨向均勻一致，葉片韌性、彈性增加，其物理性狀更加利于制絲加工;還原糖、總糖、致香物質(zhì)及氨基酸等各項(xiàng)化學(xué)成分含量逐漸趨于協(xié)調(diào)。

在煙葉感官評吸質(zhì)量方面，經(jīng)陳化后的煙葉香氣質(zhì)、香氣量、余味、雜氣、刺激性等感官評吸指標(biāo)均顯著提升[5]。

1.2 ? ?煙葉陳化機(jī)理

針對上述變化，前人對煙葉陳化機(jī)理進(jìn)行了較多的研究，對其作用機(jī)理的解釋主要集中在酶作用、微生物作用和化學(xué)作用3個(gè)方面[6]。Koller等最早研究煙葉陳化機(jī)理，他們認(rèn)為雪茄煙葉的陳化是微生物作用的結(jié)果。目前，學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為，煙葉表面微生物在陳化過程中起著極其重要的作用，其作用貫穿煙葉品質(zhì)變化的整個(gè)過程。一方面，通過自身生命活動作用于煙葉陳化;另一方面，其代謝活動產(chǎn)生的酶能夠有效催化煙葉中物質(zhì)轉(zhuǎn)化。具體來講，煙葉表面微生物在自身代謝過程中可將煙葉中的淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸等大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì)，促進(jìn)煙葉品質(zhì)的提升[7-9]。

2 ? ?煙葉表面微生物種類及動態(tài)變化

2.1 ? ?種類

研究表明，煙葉表面微生物種類多、數(shù)量大。目前對煙葉微生物的鑒定方法有傳統(tǒng)的可培養(yǎng)方法[10]和DGGE技術(shù)[11]、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）技術(shù)及16S rDNA克隆文庫測序技術(shù)[12-13]等。孫玉宇[14]、高文霞等[15]研究發(fā)現(xiàn)，1 g葉片中微生物數(shù)量為5萬～8萬個(gè)，按照類別可分為細(xì)菌、霉菌、放線菌和酵母菌四大類。王 ?芳等[16]研究了陳化煙葉表面高溫微生物，結(jié)果表明，高溫微生物總量為103～105個(gè)/g，其中細(xì)菌占絕對優(yōu)勢，真菌較少，放線菌和酵母菌未檢出。徐潔[17]研究了烤后煙葉微生物數(shù)量和種類，發(fā)現(xiàn)煙葉表面微生物主要包括細(xì)菌、真菌和放線菌;細(xì)菌為優(yōu)勢菌屬，比例占90%以上，放線菌占比很小。趙銘欽等[18]對烤煙表現(xiàn)微生物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在煙葉品質(zhì)改善過程中，細(xì)菌中的芽孢桿菌屬、放線菌中的鏈霉菌為優(yōu)勢菌屬，酵母菌為痕量。韓錦峰等[19]研究發(fā)現(xiàn)，煙葉中的微生物優(yōu)勢類群主要包括細(xì)菌、放線菌和霉菌三大類。邱立友等[20]對陳化過程中煙葉表面微生物進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，在發(fā)酵過程中細(xì)菌中芽孢桿菌屬為優(yōu)勢菌屬，而放線菌和霉菌數(shù)量較少。楊金奎等[21]從醇化煙葉表面僅分離出了細(xì)菌和霉菌，同樣芽孢桿菌屬為優(yōu)勢菌屬。

2.2 ? ?動態(tài)變化

較多研究已證明，煙葉表面微生物種群數(shù)量及優(yōu)勢菌屬是動態(tài)變化的。一般來說，在煙葉陳化初期，微生物類群較多，原因可能在于初期煙葉表面有機(jī)物質(zhì)含量較高，微生物可以充分利用，但隨著時(shí)間推移，有機(jī)物質(zhì)及水分含量降低，絕大多數(shù)微生物數(shù)量大量減少。在優(yōu)勢菌屬方面，隨著煙葉陳化的進(jìn)行，煙葉表面微環(huán)境發(fā)生著變化，從而影響到其表面優(yōu)勢菌屬的存在。Di Giacomo等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在陳化初期葡萄球菌科和乳酸桿菌目細(xì)菌為優(yōu)勢菌屬，在陳化后期芽孢桿菌屬成為優(yōu)勢菌屬。究其原因在于隨著陳化時(shí)間的增加，煙葉表面溫度和pH值逐漸升高，此種微環(huán)境更加適宜芽孢桿菌屬微生物生長繁殖。趙銘欽等研究表明，隨著陳化時(shí)間的延長，芽孢桿菌在微生物種類中所占的比例不斷提高，這也佐證了Di Giacomo等的論點(diǎn)。朱大恒等進(jìn)行了細(xì)化研究，發(fā)現(xiàn)在陳化過程中細(xì)菌總數(shù)呈逐漸降低的趨勢。陳福星等[23]發(fā)現(xiàn)，在煙葉陳化后期，數(shù)量最多的是細(xì)菌，其次是放線菌和真菌。

綜上所述，前人研究結(jié)論存在一定的差異性，主要表現(xiàn)為兩方面。一是煙葉中微生物種類存在差異;二是優(yōu)勢菌屬存在差異。如同一部位不同產(chǎn)地?zé)熑~在群落結(jié)構(gòu)方面存在差異的同時(shí)，優(yōu)勢菌屬占比也存在不同，分析原因可能是煙草品種及陳化環(huán)境條件存在差異[24-25]。

3 ? ?微生物在改良煙葉品質(zhì)方面的應(yīng)用

3.1 ? ?微生物與煙葉感官評吸

現(xiàn)有研究已證明，煙葉在陳化過程中品質(zhì)的提升與葉面微生物代謝存在直接或間接的關(guān)系。微生物通過一系列代謝活動，將煙葉中大分子物質(zhì)逐漸轉(zhuǎn)化分解成小分子前體物質(zhì)，對于煙葉品質(zhì)的提升有一定的促進(jìn)作用[26]。其中，芽孢桿菌屬細(xì)菌能降低煙葉中蛋白質(zhì)含量[27]，從而減輕煙葉燃吸過程中的燒焦羽毛的氣味，其作用機(jī)理是將大分子蛋白質(zhì)降解為小分子氨基酸，氨基酸在煙葉燃燒過程中可以參與美拉德反應(yīng)產(chǎn)生香氣物質(zhì)，有利提升煙葉香氣。李 ?寧等[28]利用蠟樣芽孢桿菌處理雪茄煙，煙葉的蛋白質(zhì)較對照組降低13.53%。馮志珍等[29]利用芽孢桿菌（F-Y-11菌株）發(fā)酵煙絲，可使蛋白質(zhì)降解29.32%。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，使用菌劑處理煙葉可以定向改善煙葉中其他化學(xué)成分的含量，使各化學(xué)指標(biāo)更趨協(xié)調(diào)[30]。

目前，微生物在改善煙葉品質(zhì)方面的應(yīng)用研究主要思路為：先從煙葉或其他寄主表面分離微生物，經(jīng)培養(yǎng)篩選后直接或配方施用，用以縮短煙葉陳化用時(shí)、改善煙葉評吸品質(zhì)[31]。黃靜文等[32]利用短小芽孢桿菌Van35開展試驗(yàn)，處理后的煙葉刺激性、雜氣及香氣質(zhì)指標(biāo)明顯改善。瞿嬌嬌等[33]利用從豆豉中分離的芽孢桿菌處理煙葉，煙葉香氣趨于醇和豐滿，煙氣更加細(xì)膩，雜氣、刺激性明顯減輕。此外，研究發(fā)現(xiàn)，泛菌屬微生物可降解煙葉中類胡蘿卜素物質(zhì)，增加類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量，該物質(zhì)為煙葉重要的致香物質(zhì)，有助于提升煙葉的燃吸品質(zhì);部分放線菌可催化阿魏酸生成香蘭;將枯草芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌按一定比例混合使用，可明顯提升煙葉吸食質(zhì)量;利用產(chǎn)香微生物作為發(fā)酵菌株，制備煙草提質(zhì)劑，能有效提升煙葉評吸質(zhì)量;對于煙堿含量較高的煙葉，可以利用特定菌株發(fā)酵達(dá)到降堿的目的。

3.2 ? ?微生物與煙葉安全性

煙葉安全性問題始終是煙葉質(zhì)量研究的重點(diǎn)。目前，微生物在降焦減害方面的研究極為普遍。研究發(fā)現(xiàn)，某些特定微生物可以有效減少煙葉燃吸時(shí)焦油產(chǎn)生量[34]。TSNA是一種煙草特有的有害物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)利用微生物可以在不同程度上減少煙葉和煙氣中TSNA含量，有效提高煙草制品安全性。其機(jī)理在于利用高效反硝化細(xì)菌將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，并進(jìn)一步還原為氣體，從而降低TSNA含量[35]。孫政[36]利用惡臭假單胞菌發(fā)酵液處理烤煙葉片，在溫度28 ℃、相對濕度45%的條件下，陳化14 d時(shí)硝酸鹽降解達(dá)到2.25%，陳化21 d時(shí)亞硝酸鹽降解率達(dá)到19.90%。單宏英等[37]從玉溪煙葉中提取一種熒光假單胞菌（菌株AS97），將其制成發(fā)酵液后以5%接種量噴施，在溫度30 ℃、相對濕度60%的條件下，陳化10 d后檢測硝酸鹽、亞硝酸鹽、TSNA等物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率，分別達(dá)到68.77%、45.57%、45.47%。因此，在煙葉安全性方面，微生物將有較大的研究與應(yīng)用空間。

4 ? ?展望

微生物是自然界中一個(gè)極其龐大的群體，與人類活動息息相關(guān)。目前，微生物在農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)、醫(yī)藥化工及生物能源應(yīng)用等諸多領(lǐng)域已發(fā)揮出重要的作用。在煙草行業(yè)，雖有較多的研究，但多數(shù)成果仍停留在研究層面。針對目前行業(yè)較為關(guān)注的吸煙與健康問題，如何定向篩選出高效、安全的微生物菌株，以實(shí)現(xiàn)降焦（TSNA）減害，成為一個(gè)重要的研究方向。

5 ? ?參考文獻(xiàn)

[1] 韓錦峰，劉維群，楊素勤，等.海拔高度對烤煙香氣物質(zhì)的影響[J].中國煙草，1993（3）：1-3.

[2] 劉國順，王可，劉靜靜，等.不同產(chǎn)地烤煙中性致香物質(zhì)對比分析[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32（1）：31-34.

[3] 李曉，姚光明，穆林，等.煙葉復(fù)烤前后香味成分的變化[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（1）：40-43.

[4] 王潔，曾代龍，符雷，等.晾曬煙葉發(fā)酵研究進(jìn)展[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，43（4）：1-4.

[5] AJANDOUZ E H，PUIGSERVER A.Nonenzymatic browning reaction essential amino acids：effect of pH on caramelization and Maillard reaction kinetics[J].Agric Food Chem，1999（47）：1786-1793.

[6] 朱大恒，陳銳，陳再根，等.烤煙自然醇化與人工發(fā)酵過程中微生物變化及其與酶活性關(guān)系的研究[J].中國煙草學(xué)報(bào)，2001，7（2）：26-30.

[7] 唐麗，周冰，華一崑，等.醇化技術(shù)在改善煙葉品質(zhì)中的研究進(jìn)展[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，25（7）：53-56.

[8] 趙銘欽，李曉強(qiáng).煙葉微生物發(fā)酵機(jī)理及生物制劑應(yīng)用研究進(jìn)展[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，42（6）：84-91.

[9] 金曉艷.復(fù)合生物添加劑對煙草陳化過程中有機(jī)酸和游離氨基酸含量影響分析研究[D].合肥：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)，2006.

[10] 何家亨，賀妮莎，胡君儒，等.陳化煙葉表面可培養(yǎng)寡營養(yǎng)菌多樣性分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（6）：1292-1297.

[11] 伍雪瑩，梁書利，韓雙艷，等.不同陳化期烤煙葉表細(xì)菌的多樣性及發(fā)育分析[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（18）：28-38.

[12] ZHAO M Q，WANG B X，LI F X，et al，Analysis of acterial communities on aging flue-cured tobacco leaves by 16S rDNA PCR-DGGE technology[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2007，73（6）：1435-1440.

[13] SU C，GU W，ZHE W，et al.Diversity and phylogeny of bacteria on Zimbabwe tobaccoleaves estimated by 16S rRNA sequence analysis[J].Applied Microbiology and Biotechno-logy，2011，92（5）：1033-1044.

[14] 孫玉宇.煙草發(fā)酵中微生物研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2014（9）：302-303.

[15] 高文霞，程祖鋅，王峰吉.烤煙發(fā)酵有益細(xì)菌的分離篩選及優(yōu)良菌株的鑒定[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2011（5）：104-109.

[16] 王芳，賴泳紅，米靜，等.不同陳化煙葉葉面高溫微生物多樣性[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2012，18（3）：471-476.

[17] 徐潔.兩個(gè)真菌菌株對烤煙誘香機(jī)理的初步研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[18] 趙銘欽，邱立友，張維群，等.陳化期間烤煙葉片中生物活性變化的研究[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，19（6）：537-542.

[19] 韓錦峰，朱大恒，劉衛(wèi)群，等.陳化發(fā)酵期間烤煙葉面微生物活性及其應(yīng)用研究[J].中國煙草科學(xué)，1997（4）：13-14.

[20] 邱立友，趙銘欽，岳雪梅，等.烤煙發(fā)酵高效菌株的篩選[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，34（3）：232-235.

[21] 楊金奎，段焰青，陳春梅，等.醇化煙葉表面可培養(yǎng)微生物的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析[J].煙草科技，2008（11）：51-55.

[22] DI GIACOMO M，PAOLINO M，SILVESTRO D，et al.Microbial community structure and dynamics of dark fire-cured tobacco fermentation[J].Applied and Environmental Microbiology，2007，73（3）：825-837.

[23] 陳福星，王磊，莫湘濤，等.煙葉微生物發(fā)酵的探討[J].湖南微生物學(xué)通訊，1990（2）：37-39.

[24] 周家喜.不同倉儲環(huán)境微生物群落對煙葉陳化品質(zhì)的影響[D].貴陽：貴州大學(xué)，2017.

[25] 雷麗萍，BUSH L，COOEM S，等.煙葉生長和晾制期間細(xì)菌種群動態(tài)變化：煙草微生物細(xì)菌調(diào)控技術(shù)研究之一[J].中國煙草科學(xué)，2001（3）：4-6.

[26] 劉道全.生物制劑在烤煙自然醇化中的應(yīng)用研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[27] 王穎，馬玲玲，呂欣，等.單一和復(fù)配微生物固態(tài)發(fā)酵對卷煙葉組主要化學(xué)成分的影響[J].煙草科技，2015，48（11）：47-52.

[28] 李寧，汪長國，曾代龍，等.蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）篩選鑒定及在雪茄煙葉發(fā)酵中的應(yīng)用研究[J].中國煙草學(xué)報(bào)，2012，18（2）：65-69.

[29] 馮志珍，陳太春，胡喜懷，等.煙葉表面高效降解蛋白質(zhì)芽孢桿菌的分離篩選及其鑒定[J].中國煙草學(xué)報(bào)，2012， 18（1）：101-105.

[30] 鄭勤安.造紙法再造煙葉生產(chǎn)過程中微生物增質(zhì)劑的應(yīng)用研究[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，32（4）：442-446.

[31] 陳小敏，林影，梁書利.煙葉表面微生物群落結(jié)構(gòu)鑒定及其產(chǎn)酶分析[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2016，35（7）：1760-1766.

[32] HUANG J W，YANG J K，DUAN Y Q，et al.Bacterial diversities on unaged and aging flue-cured tobacco leaves estimated by 16S rRNA sequence analysis[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2010，88（2）：553-562.

[33] 瞿嬌嬌，施鳴，張慶明，等.食品微生物對發(fā)酵煙葉品質(zhì)的影響[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（3）：136-138.

[34] 馬林.利用生物技術(shù)改變煙葉化學(xué)組分提高其吸食品質(zhì)和安全性的研究[J].鄭州工程學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，22（3）：40-45.

[35] 孫榅淑.硝態(tài)氮含量及硝酸鹽清除劑對煙葉高溫貯藏過程中TSNA形成的影響[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[36] 孫政.降低煙草亞硝胺目的菌的篩選及應(yīng)用研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[37] 單宏英，陳德鑫，李晶，等.一株源于醇化煙葉表面高效降解TSNA菌株AS97的分離篩選、鑒定及應(yīng)用[J].微生物學(xué)報(bào)，2011（10）：1326-1333.