IL-17和IL-38在三陰性乳腺癌中的表達(dá)及意義

巫姜 葉骉飛 孟慶杰

[摘要] 目的 檢測IL-17和IL-38在TNBC患者中的表達(dá)，并探討他們?cè)谄浒l(fā)病中可能存在的作用。 方法 選擇2017年11月—2019年3月空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的71例乳腺癌患者為研究對(duì)象，其中三陰性乳腺癌（TNBC）組36例，導(dǎo)管原位癌（DCIS）組35例，選取同期就診的33例纖維腺瘤患者為對(duì)照組。Real-time RT-PCR檢測組織標(biāo)本中白細(xì)胞介素（IL）-17 mRNA和IL-38 mRNA的表達(dá);免疫組化法檢測組織標(biāo)本中IL-17和IL-38蛋白的表達(dá);并進(jìn)一步分析TNBC組IL-17 mRNA和IL-38 mRNA表達(dá)的相關(guān)性。 結(jié)果 TNBC組和DCIS組IL-17 mRNA表達(dá)高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）;TNBC組和DCIS組IL-38 mRNA表達(dá)均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。TNBC組IL-17蛋白陽性表達(dá)強(qiáng)于DCIS組及對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。TNBC組和DCIS組IL-38蛋白陽性表達(dá)弱于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。TNBC患者IL-17 mRNA與IL-38 mRNA的相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（r = -0.685，P < 0.01）。 結(jié)論 IL-17在TNBC中表達(dá)增高，IL-38則表達(dá)降低，IL-17 mRNA與IL-38 mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，他們?cè)赥NBC發(fā)病過程中可能起相反的作用。

[關(guān)鍵詞] 白細(xì)胞介素-17;白細(xì)胞介素-38;三陰性乳腺癌;乳腺癌

[中圖分類號(hào)] R737.9? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）10（b）-0085-05

[Abstract] Objective To detect the expression of IL-17 and IL-38 in triple negative breast cancer （TNBC） patients， and to explore their possible role in the pathogenesis of breast cancer. Methods From November 2017 to March 2019， 71 cases with breast cancer admitted to Xijing Hospital （“our hospital”for short） were selected as study subjects， including 36 cases in the TNBC group and 35 cases in the ductal carcinoma in situ （DCIS） group， and 33 patients with fibroadenoma who admitted to our hospital at the same time were selected as the control group. The expression of interleukin （IL-17） mRNA and IL-38 mRNA in tissue samples were detected by real-time RT-PCR; and the protein expression of IL-17 and IL-38 were detected by immunohistochemistry. The correlation between IL-17 mRNA expression and IL-38 mRNA expression in the TNBC group was further analyzed. Results The expression IL-17 mRNA in TNBC group and DCIS group were higher than those in control group， and the differences were statistically significant （all P < 0.05）. While the expression of IL-38 mRNA in TNBC group and DCIS group were lower than those in control group， and the differences were statistically significant （all P < 0.05）. The protein positive expression of IL-17 in TNBC group was higher than that in DCIS group and control group， and the differences were statistically significant （all P < 0.05）. While the protein positive expression of IL-38 in TNBC group and DCIS group were lower than those in control group， and the differences were statistically significant （all P < 0.05）. The relative expression of IL-17 mRNA and IL-38 mRNA was negatively correlated in TNBC（r = -0.685， P < 0.01）. Conclusion The expression of IL-17 is increased and IL-38 is decreased in TNBC. There is a negative correlation between IL-17 mRNA and IL-38 mRNA. They may play an opposite role in the pathogenesis of TNBC.

[Key words] Interleukin-17; Interleukin-38; Triple negative breast cancer; Breast cancer

2019年的一項(xiàng)最新研究結(jié)果顯示[1]，乳腺癌為美國女性中最常見的癌癥之一，是繼肺癌之后第二大致女性死亡的癌癥。三陰性乳腺癌（TNBC）具有獨(dú)特的臨床表現(xiàn)，如發(fā)病年齡更輕、生存期更短、惡性程度更高、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及死亡率更高等特點(diǎn)[2-3]，其發(fā)病率占乳腺癌總數(shù)的15%～20%[4]。王國慶等[5]發(fā)現(xiàn)人類乳腺癌腫瘤中存在白細(xì)胞介素（IL）-17的表達(dá)。IL-17R敲除和IL-17/γ-干擾素（γ-IFN）雙敲的小鼠具有抑制腫瘤生長的能力[6]，提示IL-17具有促進(jìn)腫瘤的作用。IL-38及其受體IL-36R mRNA在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，且呈正相關(guān)，提示其參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展[7]，也與炎癥及肺癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有關(guān)[8-9]。

目前IL-17在TNBC發(fā)病過程中的具體機(jī)制尚不清楚，而IL-38在乳腺癌中報(bào)道甚少，本研究旨在檢測TNBC組織中二者的表達(dá)情況，初步探明他們?cè)赥NBC發(fā)病中可能存在的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年11月—2019年3月空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）就診的71例乳腺癌患者為研究對(duì)象。其中TNBC組36例，年齡26～58歲，平均（47.00±12.68）歲;導(dǎo)管原位癌（DCIS）組35例，年齡29～54歲，平均（41.00±14.27）歲。選取同期于我院就診的33例纖維腺瘤患者為對(duì)照組，年齡24～53歲，平均（36.00±13.38）歲。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，征得受試者同意并簽署知情同意書。三組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理確診為TNBC、DCIS及纖維腺瘤;②初次診治;③女性患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①入組前已行放化療及免疫治療者;②實(shí)驗(yàn)期間出現(xiàn)重度感染者;③因其他因素使用免疫抑制/調(diào)節(jié)劑者;④伴自身免疫性疾病、免疫缺陷病及其他惡性腫瘤者。

1.3 主要試劑與儀器

Trizol（Thermo Fisher，IS10007）;SYBR GreenⅠRealtime PCR Master Mix（Sino Biological，E090）;反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara Bio，RR037A）;DEPC（Thermo Fisher，1210019），PCR產(chǎn)物純化試劑盒（北京TIANGEN，DP214-02）;兔抗人多克隆抗體一抗工作液：IL-17（Abcom，ab9565）和IL-38（Santa-Cruz，QYA04878）;羊抗兔二抗（Abcom，ab97051）;DAB染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ZLI-9019）。

超低溫高速離心機(jī)（Thermo Fisher，sorvall stratos）;核酸蛋白測定儀（Thermo Fisher，NanoDrop1000）;PCR儀（BIO-RAD，C1000TM）;Real-time RT-qPCR儀（BIO-RAD，7900HT）;蛋白電泳儀（Thermo Fisher，NanoDropOneC）;凝膠成像儀（Thermo Fisher，E-Gel Imager）。

1.4 方法

1.4.1 標(biāo)本采集及處理? 超聲引導(dǎo)粗針穿刺或手術(shù)過程中取腫瘤組織或纖維腺瘤瘤旁正常腺體，一分為二，一份迅速液氮冷凍后轉(zhuǎn)至超低溫冰箱中保存，另一份于10%甲醛溶液固定。

1.4.2 Real-time RT-PCR檢測IL-17 mRNA和IL-38 mRNA表達(dá)? 在防RNA酶污染的條件下采用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，分別檢測IL-17和IL-38的表達(dá)，引物由大連TaKaRa公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見表1。反應(yīng)體系：SYBR GreenⅠ染料10 μL、上下游引物各1 μL、dNTP 1μL、Taq聚合酶2 μL、IL-17或IL-38 cDNA 5 μL、ddH2O 30 μL，總體積 50 μL。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95.0℃ 5 min，變性95.0℃ 15 s，退火30 s，IL-17、IL-38和β-actin退火溫度分別72.2℃、67.6℃和53.9℃，分別為40和42個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[7，11]。采用2-ΔCt進(jìn)行相對(duì)定量，Ct值為熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（管家基因）。

1.4.3 免疫組化檢測IL-17和IL-38蛋白的表達(dá)? 取福爾馬林固定好的組織標(biāo)本，石蠟包埋組織，完成切片，分別進(jìn)行IL-17和IL-38免疫組化染色[12]。本研究同時(shí)設(shè)置陰性和陽性對(duì)照。由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)高年資醫(yī)生采取雙盲法在400倍鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)不重復(fù)的視野，IL-17和IL-38蛋白的表達(dá)陽性時(shí)細(xì)胞漿和/或細(xì)胞膜被染成棕黃色或黃色，記錄免疫組化染色深度（0分為陰性，1分弱陽性，2分中等強(qiáng)度陽性，3分為強(qiáng)陽性）和面積（0分：<5%，1分：5%～25%，2分：>25%～50%，3分：>50%～75%，4分：>75%）。將染色深度和面積賦分的乘積大于1分者定義為陽性[12]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn);相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組IL-17 mRNA表達(dá)比較

TNBC組和DCIS組IL-17 mRNA表達(dá)高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。TNBC組與DCIS組IL-17 mRNA表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖1、表2。

3 討論

乳腺癌的發(fā)病率從20世紀(jì)80年代開始在全球及我國均呈上升趨勢(shì)[13-14]。雖其病因尚不清楚，但已明確其發(fā)病存在一定的規(guī)律性，且不同分子分型的乳腺癌具有不同的臨床特點(diǎn)、危險(xiǎn)因素及預(yù)后特點(diǎn)，其中TNBC對(duì)廣大女性生命健康的危害與其他亞型有較大的差異[15]。目前研究TNBC的發(fā)病、轉(zhuǎn)移、耐藥等仍然是熱點(diǎn)[16]。

IL-17主要是由Th17細(xì)胞產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，具有強(qiáng)大的招募中性粒細(xì)胞作用，并能促進(jìn)多種細(xì)胞因子的釋放，在乳腺癌的發(fā)病過程中起著重要的作用[17]。同時(shí)，IL-17在非小細(xì)胞性肺癌、胃癌、結(jié)腸癌及卵巢癌等許多腫瘤性疾病中都有表達(dá)[12，17-18]。IL-17R敲除小鼠和IL-17/IFN-γ雙敲小鼠抑制腫瘤生長[6]，提示IL-17具有促進(jìn)腫瘤生長作用;Chen等[19]研究顯示，乳腺癌腫瘤微環(huán)境中能夠產(chǎn)生IL-17的細(xì)胞增多成為乳腺癌預(yù)后不良的因素。IL-38與多種炎性疾病密切相關(guān)，能與IL-36R結(jié)合，抑制念球菌誘導(dǎo)的IL-22和IL-17的產(chǎn)生，進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中發(fā)揮作用[20-22]。

本研究結(jié)果顯示，TNBC組和DCIS組IL-17 mRNA表達(dá)高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）;而TNBC組和DCIS組IL-38 mRNA表達(dá)低于對(duì)照組（均P < 0.05）。TNBC組IL-17蛋白陽性表達(dá)高于DCIS組和對(duì)照組，而TNBC組、DCIS組IL-38蛋白陽性表達(dá)低于對(duì)照組（均P < 0.05）。提示IL-17及IL-38可能參與TNBC的發(fā)生。張黎等[23]研究顯示乳腺癌患者術(shù)前血清IL-38含量顯著低于健康女性，但術(shù)后卻明顯高于術(shù)前;術(shù)前IL-22和IL-17顯著高于健康女性，術(shù)后則顯著降低;進(jìn)一步研究顯示，IL-38能抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7的活力、促進(jìn)其凋亡，而IL-22和IL-17則起著促進(jìn)作用。這些可能是通過調(diào)控增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、凋亡促進(jìn)基因（bax）和B細(xì)胞淋巴瘤-2基因（Bcl-2）等途徑實(shí)現(xiàn)的[23]。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清IL-38及IL-17呈負(fù)相關(guān)[22]，IL-38能夠通過抑制IL-17和IL-22的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用[7]。本研究顯示TNBC患者IL-17 mRNA與IL-38 mRNA的相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（P < 0.01）。因此，TNBC中IL-38與IL-17發(fā)揮著相反的作用。

綜上所述，IL-17和IL-38在多種炎性疾病及乳腺癌等多種腫瘤疾病中都有參與。本研究顯示，IL-17及IL-38可能參與了TNBC的發(fā)生發(fā)展，且二者呈負(fù)相關(guān)。因此，IL-17及IL-38有望成為TNBC研究的新靶點(diǎn)，但其確切機(jī)制仍需更深入的研究與探討得以明確。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? DeSantis CE，Ma J，Gaudet MM，et al. Breast Cancer Statistics，2019 [J]. CA Cancer J Clin，2019，69（6）：438-451.

[2]? Chen W，Zheng R，Baade PD，et al. Cancer statitics in China，2015 [J]. CA Cancer J Clin，2016，66（2）：115-132.

[3]? Escórcio-Dourado CS，Martins LM，Simpl cio-Revoredo CM，et al. Bcl-2 antigen expression in luminal A and triple-negative breast cancer [J]. Med Oncol，2017，34（9）：161.

[4]? Khosravi-Shahi P，Cabezón-Gutiérrez L，Custodio-Cabello S. Metastatic triple negative breast cancer：Optimizing treatment options，new and emerging targeted therapies [J]. Asia Pac J Clin Oncol，2018，14（1）：32-39.

[5]? 王國慶，劉燕，高鴻霞.IL-17A在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中表達(dá)及對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的作用[J].北華大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2018，19（5）：616-618.

[6]? He D，Li H，Yusuf N，et al. IL-17 promotes tumor development through the induction of tumor promoting microenvironments at tumor sites and myeloid-derived suppressor cells [J]. J Immunol，2010，184（5）：2281-2288.

[7]? 張瑜，金建軍，田笑笑.IL-38及其受體IL-36R mRNA在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2018，27（12）：1383-1385.

[8]? Takada K，Okamoto T，Tominaga M，et al. Clinical implications of the novel cytokine IL-38 expressed in lung adenocarcinoma：Possible association with PD-L1 expression [J]. PLoS One，2017，12（7）：e0181598.