一例小型肉雞傳染性腺胃炎的實(shí)驗(yàn)室診斷

摘 ?要：山東東阿某養(yǎng)殖場(chǎng)25日齡小型肉雞，出現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩、糞便過(guò)料、病雞消瘦、死淘率增加等情況。通過(guò)病雞剖檢和病原學(xué)核酸檢測(cè)，結(jié)果表明該雞場(chǎng)存在雞傳染性貧血病毒（Chicken anemia virus，CAV）和圓圈病毒3型（Gyrovirus 3，GyV3）的混合感染。經(jīng)采取綜合防控措施后，本次疫情得到控制。

關(guān)鍵詞：雞;傳染性貧血病毒;圓圈病毒3型;混合感染

雞傳染性貧血是由傳染性貧血病毒（Chicken anemia virus，CAV）感染雞而引起，CAV最早于1979年在日本受污染的疫苗中被發(fā)現(xiàn)[1]，目前在全世界范圍廣泛傳播[2-5]。14～27日齡小雞的患病率最高，其臨床多表現(xiàn)為貧血、全身淋巴組織萎縮和免疫機(jī)能損害，易出現(xiàn)其他病原的并發(fā)或繼發(fā)感染，尤其是當(dāng)出現(xiàn)多種免疫抑制病共同感染時(shí)，會(huì)互相增強(qiáng)致病力，在免疫抑制上出現(xiàn)明顯的協(xié)同效應(yīng)[6]。此外，近年來(lái)在雞體上分離到了一種與CAV基因結(jié)構(gòu)相似的病毒，被命名為圓圈病毒屬3型（Gyrovirus 3，GyV3）[7]，GyV3是一種環(huán)狀單鏈DNA病毒，2012年在智利患急性腸胃炎的兒童的糞便中首次被發(fā)現(xiàn)[8]，2014年該病毒又從雪貂糞便中被檢出[9]。2018年袁世玉等首次從患有傳染性腺胃炎的商品肉雞組織中利用高通量測(cè)序的方法檢測(cè)到GyV3，并且通過(guò)基因序列分析確定該病毒屬于細(xì)環(huán)病毒科圓圈病毒屬gyrovirus的A分支[10]。該病毒可感染不同品種的蛋雞和肉雞，流行較廣，主要引起免疫抑制、貧血以及腺胃腫大等癥狀，感染雞群發(fā)病率一般為 7%～28%，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)較大危害[11]。本實(shí)驗(yàn)室從山東東阿某雜交肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病雞群中檢測(cè)到CAV和GyV3顯示該雞場(chǎng)存在這兩種病毒的雙重感染?，F(xiàn)將診療情況報(bào)告如下：

1 ?發(fā)病情況及臨床癥狀

山東東阿某養(yǎng)殖場(chǎng)25日齡小型雜交肉雞，出現(xiàn)精神沉郁、雞冠蒼白、生長(zhǎng)遲緩、糞便稀薄、含有未消化飼料等情況，病雞極度消瘦，病死率10%左右，將發(fā)病雞送本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)。

2 ?剖檢病變

發(fā)病雞剖檢可見(jiàn)腺胃腫脹呈球形，腺胃乳頭腫脹甚至消失，脾臟、法氏囊、胸腺明顯萎縮，見(jiàn)圖1。

3 ?實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1 ?材料與方法

3.1.1 ?檢測(cè)所用試劑及儀器 ?BioSpin膠回收試劑盒、BioSpin組織細(xì)胞DNA/RNA共提取試劑盒均購(gòu)自杭州博日科技有限公司; StarPrep Plasmid Miniprep Kit、2×Taq PCR StarMix with Loading Dye均購(gòu)自北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司;DL2000 DNA Marker購(gòu)自TakaRa公司;凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自濟(jì)南東岱科學(xué)器材有限公司;普通PCR儀、離心機(jī)購(gòu)自Thermo公司;電泳儀購(gòu)自北京市六一儀器廠。

3.1.2 ?引物設(shè)計(jì) ?CAV的引物參考從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載已有的序列，通過(guò)Megalign進(jìn)行序列比對(duì)后，根據(jù)保守區(qū)域的序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，最后選取CAV F/R和GyV-1s/a[12]兩對(duì)引物用于檢測(cè)CAV和雞GyV3，引物序列如下：

CAV F： 5' GGACCATCAACGGTGTTCAG 3'

CAV R： 5' CCTCAAGTCCGGCACATTCT 3'，擴(kuò)增片段為200 bp;

GyV-1s： 5' TGGTCGTGCGTGGAAAC 3'

GyV-1a： 5' GGTATGAATACGAGCCCTTG 3'，擴(kuò)增片段為336 bp。

3.1.3 ?病毒檢測(cè) ?取病雞組織按1∶5加入pH 7.2的磷酸緩沖鹽溶液（PBS） 混合研磨，反復(fù)凍融3～5次，12，000 r/min離心10 min;取上清液200 μL用BioSpin組織細(xì)胞DNA/RNA共提取試劑盒提取病毒核酸，利用PCR方法進(jìn)行CAV，GyV3及其他雞常見(jiàn)病毒的檢測(cè)。按如下反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù)進(jìn)行：總體積為20 μL的反應(yīng)體系，包含2×Taq PCR StarMix 10 μL、10 μM 上下游引物0.5 μL、模板DNA 2.0 μL、dd H2O補(bǔ)充至20 μL。

循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 3 min，95 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，最后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察、拍照及記錄結(jié)果。

3.2 ?結(jié)果

3.2.1 ?CAV的PCR檢測(cè)結(jié)果 ?利用3.1.2病毒檢測(cè)中的CAV的檢測(cè)引物，按照上述反應(yīng)體系及循環(huán)參數(shù)進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果4份組織均擴(kuò)增出200 bp左右的條帶，與預(yù)期的目的條帶大小相符，見(jiàn)圖2。

3.2.2 ?雞GyV3的PCR檢測(cè)結(jié)果 ?利用3.1.2病毒檢測(cè)中的GyV3的檢測(cè)引物，按照上述反應(yīng)體系及循環(huán)參數(shù)進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果4份組織均擴(kuò)增出336 bp左右的條帶，與預(yù)期的目的條帶大小相符，見(jiàn)圖3。

3.2.3 ?雞常見(jiàn)病毒的PCR檢測(cè)結(jié)果 ?雞的其他常見(jiàn)病毒，包括禽流感病毒（AIV）、新城疫病毒（NDV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）、腺病毒（FADV）、傳染性法氏囊炎病毒（IBDV）、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒（REV）、白血病病毒（ALV）和馬立克氏病毒（MDV）PCR檢測(cè)結(jié)果均為陰性，見(jiàn)圖4。

結(jié)合雞群發(fā)病情況、剖檢病變及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，確診該病例為CAV與雞GyV3的混合感染。

4 ?防治措施

雞CAV和GyV3都屬于免疫抑制性病原，一旦感染會(huì)使雞體的抵抗力下降，容易引發(fā)其他疾病的混合感染。因此對(duì)此類疾病的預(yù)防與診斷十分重要。平時(shí)應(yīng)提高雞舍的飼養(yǎng)管理水平，要保證雞群日糧中含有豐富的氨基酸、微量元素和維生素，提高機(jī)體免疫力[13]。在日常管理過(guò)程中，定期對(duì)雞舍、周圍環(huán)境以及用具等進(jìn)行消毒。對(duì)雞群定期進(jìn)行檢疫，及時(shí)淘汰發(fā)病雞，通過(guò)疫苗接種提高雞群特異性抵抗力。

5 ?討論

雞傳染性腺胃炎是一種在家禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中較為常見(jiàn)的一類疫病，以雞群生長(zhǎng)不良、消瘦、大小不均、糞便過(guò)料等癥狀為特征，剖檢病變可見(jiàn)腺胃腫大，胸腺、法氏囊、脾臟等免疫器官萎縮，該病可發(fā)生于不同品種的蛋雞和肉雞，常見(jiàn)于雛雞和青年雞。由于該病能嚴(yán)重影響家禽的生產(chǎn)性能，給養(yǎng)殖業(yè)造成了較大危害。根據(jù)之前的報(bào)道，傳染性法氏囊炎病毒、傳染性支氣管炎病毒、腺胃壞死病毒、禽白血病病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒、呼腸孤病毒等均可能與傳染性腺胃炎有關(guān)[14-19]。目前，多數(shù)學(xué)者都認(rèn)為，傳染性腺胃炎是一種病因較為復(fù)雜的疾病，除病毒以外，細(xì)菌、霉菌毒素等可能都是誘發(fā)腺胃炎的重要因素。

本次實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)根據(jù)臨床發(fā)病癥狀及病理剖檢特征，對(duì)該病雞場(chǎng)所送病料進(jìn)行CAV和雞GyV3的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該雞場(chǎng)存在這兩類病毒的雙重感染。CAV作為一種免疫抑制性病毒會(huì)侵害家禽的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致機(jī)體更容易出現(xiàn)其他病原的并發(fā)或繼發(fā)感染，尤其是當(dāng)出現(xiàn)多種免疫抑制病共同感染時(shí)，會(huì)互相增強(qiáng)致病力，在免疫抑制上出現(xiàn)明顯的協(xié)同效應(yīng)[6]。近年來(lái)，CAV在雞群內(nèi)蔓延嚴(yán)重，一旦發(fā)病，立即隔離病雞，清理雞舍中的污染物和排泄物，對(duì)雞舍進(jìn)行帶雞消毒，對(duì)可能受威脅雞群通過(guò)免疫弱毒凍干苗進(jìn)行預(yù)防。特別要注意的是CAV很容易污染疫苗，有研究表明，CAV感染會(huì)顯著降低禽流感滅活疫苗和活疫苗的免疫效果，對(duì)活疫苗的免疫效果影響更大，CAV感染會(huì)降低馬立克氏病的疫苗免疫功能[20-22]。因此一定要加強(qiáng)疫苗的監(jiān)管，避免人為造成雞傳染性貧血病的傳播。

GyV3最早是從患有胃腸炎兒童和腹瀉患者糞便中檢測(cè)到[8，23]，2018年Li等首次從患有腺胃炎的病雞腺胃中鑒定出GyV3[11]。袁世玉等[7]對(duì)336份腺胃炎病例進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，其中陽(yáng)性病例為42例，占比12.5%，說(shuō)明GyV3與腺胃炎具有一定的相關(guān)性。刁治君等[24]報(bào)道了CAV和GyV3共同感染導(dǎo)致的肉雞腺胃炎病例，病雞表現(xiàn)消化不良、糞便過(guò)料、均勻度差等癥狀，與本文病例情況基本一致。對(duì)于GyV3來(lái)說(shuō)，因?yàn)槭墙瓴旁陔u群中發(fā)現(xiàn)，目前還沒(méi)有特異性的疫苗來(lái)預(yù)防，應(yīng)以加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和提高雞體抵抗力等措施為注意防控措施。

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