誘導脂肪干細胞成軟骨分化的研究進展

賴仲宏 鐘佳寧 徐房添

【關鍵詞】 脂肪干細胞;生長因子;成軟骨分化;軟骨缺損;組織工程

中圖分類號：R68 ? 文獻標志碼：A ? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.10.012

由于創(chuàng)傷、腫瘤、骨關節(jié)炎等原因常導致軟骨組織缺損，軟骨組織缺損是骨科領域最具挑戰(zhàn)性的難題之一[1]。軟骨組織由于缺乏營養(yǎng)血管、神經(jīng)和淋巴回流，常導致軟骨自我修復能力差、增殖活性和再生能力低[2]。近年來，軟骨組織工程的發(fā)展為軟骨組織缺損修復提供了新的思路，軟骨組織工程主要包括三方面：種子細胞、生長因子、生物支架[3]。脂肪干細胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）作為理想的種子細胞具有組織來源豐富、取材容易、免疫原性低、增殖速度快和具有多向分化潛能等優(yōu)點，已成為軟骨組織工程研究的熱點。ADSCs在不同的誘導條件下可向脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞等方向分化[4]?；贏DSCs具有成軟骨分化特性，軟骨組織工程為軟骨缺損修復提供了新的治療方法。本文將從脂肪干細胞的特性、ADSCs成軟骨分化的主要影響因素和當前現(xiàn)狀及展望等方面進行綜述。

1 脂肪干細胞的起源和特點

ADSCs起源于細胞的中胚層，是一種具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細胞。2001年，ZUK等[5]從脂肪組織中分離出成纖維母樣細胞，并發(fā)現(xiàn)在不同的誘導條件下可向脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞等方向分化。在后續(xù)的研究中，通過對 PLA的克隆形成能力研究和多譜系分化能力的鑒定，發(fā)現(xiàn)PLA具有干細胞的特性，并首次將分離的細胞命名為ADSCs。ADSCs與骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow stem cells，BMSCs）同屬于間充質(zhì)干細胞，生物學特性基本相似，在分子表型上，都能夠陽性表達CD29、CD44、CD90及CD105，陰性表達CD31、CD45、HLA-DR，同時2種細胞都能陽性表達Nanog、Oct-4、SOX-2等干細胞相關轉錄因子[6]。ADSCs除了具有間充質(zhì)干細胞的共性外，還具有以下優(yōu)勢：脂肪組織來源豐富、取材方便還具有免疫抑制作用。因此，ADSCs作為種子細胞已成為軟骨組織工程的研究熱點。

2 ADSCs誘導成軟骨分化

脂肪干細胞作為組織工程中常用的種子細胞，在不同的誘導環(huán)境下可向脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、神經(jīng)細胞等方向分化。目前，有學者提出誘導ADSC成軟骨細胞分化的方式主要有5種：生長因子、基因修飾、共培養(yǎng)體系、生長因子與共培養(yǎng)結合、生物支架材料[7]。

2.1 外源性生長因子

2.1.1 轉化生長因子-β（TGF-β） TGF-β是一組多功能蛋白質(zhì)，它能影響各種細胞的生長、增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等功能。TGF-β家族包含TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，TGF-β被認為是誘導ADSCs成軟骨分化最重要的生長因子之一。TGF-β主要和TGF-β受體結合即激活素受體激酶-5（ALK-5）磷酸化，進而激活Smad通路，啟動軟骨特異性基因的轉錄，促進軟骨細胞產(chǎn)生Ⅱ型膠原（COL-Ⅱ）及軟骨聚集蛋白聚糖（GAGS）表達，最終促進ADSC成軟骨分化[8]。王洪林等[9]使用脂質(zhì)體介導法把TGF-β1成功轉染ADSCs，轉染后成軟骨分化的特異性軟骨細胞外基質(zhì)表達增多，進一步了證實了轉染TGF-β1可以促進ADSCs向成軟骨細胞方向分化。TGF-β2作為TGF-β家族成員，在多種細胞的生長和分化過程中都起重要作用，TGF-β2可以誘導間充質(zhì)干細胞轉化為軟骨細胞，促進軟骨細胞的生長、增殖、分化和細胞外基質(zhì)合成[10]。有學者提出聯(lián)合使用10 ng/mL TGF-β3和10 ng/mL BMP-6是誘導ADSCs成軟骨分化的“黃金搭檔”，與單獨使用TGF-β3相比，更能有效地增強ADSCs成軟骨分化潛能[11]。但是，也有學者提出TGF-β1和TGF-β3的誘導效應并無明顯差異[12～13]。TGF-β已經(jīng)被證實可以有效地誘導ADSCs成軟骨分化形成，但其刺激ADSCs成軟骨分化的分子生物學機制還有待進一步研究。

2.1.2 骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP） BMP是一組結構相似、高度保守的功能蛋白，可以刺激DNA合成和細胞復制，從而促進間充質(zhì)干細胞向骨細胞和軟骨細胞定向分化。目前，BMP被認為是ADSCs成軟骨分化的另一個重要生長因子。當前研究表明，在BMP家族成員中，BMP-2、4、7、9、14在ADSCs成軟骨分化中發(fā)揮重要作用[14]。有學者發(fā)現(xiàn)，在軟骨細胞中添加外源性BMP-2可以刺激Ⅱ型膠原的表達和合成，從而促進軟骨細胞表型的擴展[15]。也有學者提出單獨應用BMP-2誘導作用并不明顯，誘導的軟骨容易發(fā)展為肥大[5]。HOBEN等[16]認為BMP-4僅增加了細胞的增殖和刺激膠原的產(chǎn)生。BMP-7對間充質(zhì)干細胞產(chǎn)生趨化作用，并促進其向軟骨細胞分化，同時能夠促進軟骨細胞分泌產(chǎn)生軟骨特異性的細胞外基質(zhì)（蛋白多糖和Ⅱ型膠原）[17]。BMP-9也稱生長分化因子2（GDF-2），在胎兒發(fā)育過程中主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟中表達，但在成人中主要表達于肝臟。BMP-9和BMP-2在促進間充質(zhì)干細胞成軟骨分化過程中比較相似，有數(shù)據(jù)[14]表明BMP-9在誘導軟骨分化方面比BMP-2的效力高50～200倍。BMP-9是一種有效的體外軟骨細胞增殖分化的調(diào)節(jié)劑，相信在往后的研究中會受到更多的關注。

BMP-14又稱軟骨衍生蛋白1或GDF-5，被認為是目前誘導ADSCs成軟骨分化過程中最強的生長因子之一，在早期軟骨形成以及在后面多個階段中都發(fā)揮著重要作用。同時，GDF-5能夠促進ACAN表達，又能夠抑制COL X表達。通過GDF-5目的基因真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1（+）/GDF-5轉染入鼠ADSC，能顯著增加Ⅱ型膠原、軟骨蛋白聚糖（GAGS）的表達，誘導ADSCs成軟骨細胞方向分化。ADSCs經(jīng)GDF-5誘導后，發(fā)現(xiàn)蛋白聚糖合成能力增強，可促進細胞基質(zhì)內(nèi)GAGS合成增多，有利于ADSCs向軟骨方向分化。此外，BMP-6也在ADSC成軟骨分化的過程中發(fā)揮重要作用。在三維培養(yǎng)環(huán)境中，高濃度的BMP-6可以促進軟骨特異性成分COL2A1及AGC1表達，同時，還能抑制肥大軟骨細胞標志物COL10A1表達[18]?？傊?，BMP家族在軟骨修復治療策略中的應用已被廣泛研究，并且取得了一些突破性的進展。然而，在將這些研究轉化為治療軟骨損傷和骨關節(jié)炎的新療法之前，仍有許多問題需要研究。

2.1.3 胰島素樣生長因子1（IGF-1） IGF-1是一組能夠促進生長的多肽類物質(zhì)，被認為是誘導軟骨形成、調(diào)節(jié)細胞生長代謝最關鍵的細胞因子之一。IGF-1可以增強軟骨細胞中COL Ⅱ和ACAN的表達，并且能夠促進軟骨細胞SOX9的表達，形成COL2A1;同時，通過抑制蛋白酶的生成和釋放來減少ACAN的降解[19]。ZHOU等[20]研究證實IGF-1具有單獨誘導ADSCs成軟骨細胞分化的潛能，并在體內(nèi)外與TGF-β1共同作用誘導成軟骨細胞分化。

2.1.4 堿性成纖維細胞生長因子（FGF） FGF是一組可以促進細胞有絲分裂的重要因子，在胚胎發(fā)育中參與細胞的增殖、分化和遷移等活動。NASRABADI等[21]研究發(fā)現(xiàn)FGF2降低了ALP和COL X的表達，以及通常在TGFβ/BMP中增加的促軟骨標志物，促進成軟骨分化。然而，也有學者提出與生長因子聯(lián)合誘導過程中FGF-2抑制了BMP-6誘導成軟骨分化的能力[22]。目前對FGF-2誘導軟骨形成方面尚存在爭議，還需要進一步的研究。

2.2 基因修飾 又稱基因工程（Genetic engineering），是將軟骨生長因子的基因通過載體轉入靶細胞內(nèi)或者將攜帶軟骨生長因子的載體附著于生物支架上，使其能夠適時、穩(wěn)定、持續(xù)地表達，促使脂肪干細胞向軟骨細胞方向增殖、分化[23]。阮世強等[24]通過聚乳酸/聚羥基乙酸共聚物支架復合BMP-2基因轉染ADSCs，發(fā)現(xiàn)顯著促進透明軟骨的形成和軟骨組織的修復。馬洪斌等[25]用腺病毒攜帶BMP-14基因成功轉染ADSCs，發(fā)現(xiàn)修復軟骨缺損的能力得到大幅提升。目前，基因工程作為軟骨損失修復的一種新途徑，是以后軟骨組織工程研究的新趨勢。

2.3 共培養(yǎng) 是一組誘導一種細胞向另一種細胞增殖分化和調(diào)控的培養(yǎng)體系。通過ADSCs和軟骨細胞共培養(yǎng)的生物誘導模式，能夠誘導ADSCs向軟骨細胞方向分化。SHI等[26]使用ADSCs和軟骨細胞共培養(yǎng)，證實了在共培養(yǎng)體系下的關節(jié)軟骨細胞增殖分化，并且發(fā)現(xiàn)可以抑制軟骨細胞的凋亡，從而促進ADSCs向成骨和成軟骨方向分化。也有學者通過ADSCs替代一半的軟骨細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)可以獲得相似的ECM和COL Ⅱ的表達，同時降低了COL Ⅰ、COL X和TNF-α的表達，表現(xiàn)出相似的新生軟骨形成能力[27]。共培養(yǎng)體系可以促進ADSCs向軟骨細胞分化，并且有助于改善新生軟骨的凋亡、肥大和纖維化等問題。

2.4 生長因子與共培養(yǎng)聯(lián)合 生長因子與共培養(yǎng)聯(lián)合也是近年來比較常用的培養(yǎng)方法。有學者利用HADSCs和TGF-β3共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)人耳軟骨細胞和生長因子在誘導HADSCs成軟骨分化、提高細胞活力、上調(diào)成軟骨基因表達等方面具有積極的作用[28]。袁虹等人[29]用BMP-14成功轉染ADSCs后與軟骨細胞共培養(yǎng)，實驗證實生長因子與共培養(yǎng)聯(lián)合能誘導并促進兔ADSCs向軟骨細胞分化，同時兩者之間還具有協(xié)同作用。

2.5 支架材料 近年來隨著科技的發(fā)展，生物支架材料已成為軟骨組織工程研究的熱點。生物支架材料主要包括人工合成的高分子材料和天然來源的生物大分子蛋白[30]。GRIFFIN等[31]使用氬氣等離子體修飾納米復合聚氨酯支架，發(fā)現(xiàn)可提供適當?shù)谋砻婢€索，以增強ADSC向骨和軟骨的方向分化。合適的生物支架材料能夠在軟骨組織工程中發(fā)揮積極作用，如何構建一種合適的支架材料，仍是目前軟骨組織工程的難點。

3 其他影響脂肪干細胞成軟骨分化因素

在誘導ADSCs成軟骨分化的過程中，還受到諸多因素的影響，如供體的年齡、取材部位、低氧、細胞代數(shù)、細胞數(shù)量等[32]。年齡對ADSCs誘導成軟骨分化能力的影響尚有爭議，大部分學者認為ADSCs成軟骨分化的能力隨著年齡的增加而下降[33～34]，然而也有部分學者認為年齡對人脂肪干細胞成軟骨分化的能力影響不大[35]。目前，大多數(shù)研究的首選部位是皮下脂肪，如大網(wǎng)膜、腹部和臀部等[36～37]，不同部位取得的脂肪干細胞對成軟骨分化也有差異。在低氧條件下可以誘導因子穩(wěn)定表達，促進軟骨相關基因表達，抑制YAP表達的同時不影響HIF-1α信號通路的表達，但會抑制由低氧引起的SOX9表達的上調(diào)。HIF-1α/YAP信號軸可能在促進軟骨細胞分化和維持軟骨細胞的表型中起重要作用[38]。文獻報道體外傳代數(shù)在2～5代之間比較合適，此時細胞增殖、分化能力較強[39～41]。也有學者研究發(fā)現(xiàn)不同的細胞濃度也會影響ADSCs成軟骨分化，體外及動物實驗均表明ADSCs復合在高濃度誘導的細胞支架上成軟骨分化的效果較好[42]。此外，誘導脂肪干細胞成軟骨分化的過程中可能還受生物力學、動態(tài)環(huán)境和電磁場刺激等因素的影響。

4 展望

脂肪干細胞作為軟骨組織工程中理想的種子細胞，在軟骨組織工程研究及應用方面前景廣闊。ADSCs在成軟骨分化治療軟骨缺損方面取得了初步進展，但目前還處于動物試驗階段，少數(shù)已進入臨床階段。誘導脂肪干細胞成軟骨分化的條件有很多，其中生長因子復合生物支架是目前研究的新趨勢。當前ADSCs成軟骨分化的實驗研究都還存在許多挑戰(zhàn)，比如：（1）ADSCs成軟骨分化過程中細胞生長因子是如何調(diào)控的分子機制還有待進一步研究。（2）如何將種子細胞、生長因子、生物支架三者完美結合，形成最優(yōu)分化條件。（3）誘導ADSCs成軟骨分化的臨床安全性、致瘤性以及對同種異體移植的免疫反應等問題還有待進一步的研究。相信隨著軟骨組織工程和其他學科的發(fā)展，誘導脂肪干細胞成軟骨分化能為軟骨組織缺損的治療提供新的希望。

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（收稿日期：2020-05-21 修回日期：2020-09-28）

（編輯：潘明志）