樺褐孔菌多酚抑菌活性分析研究

戴航宇，滕春瑩，張榮濤

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省科學(xué)院 自然與生態(tài)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

隨著生活水平的提高，以多酚為原料的健康產(chǎn)品的研發(fā)越來(lái)越受到重視。目前國(guó)內(nèi)外多酚產(chǎn)品主要源于綠色植物，其強(qiáng)大的抗氧化活性在疾病預(yù)防和治療方面有良好的表現(xiàn)。我國(guó)是食用菌生產(chǎn)大國(guó)，對(duì)食用菌天然活性物質(zhì)如多酚類物質(zhì)的提取純化和生物活性分析，有助于食用菌在功能性食品和醫(yī)藥保健品的應(yīng)用和開發(fā)。樺褐孔菌（Inonotus obliquus）是生長(zhǎng)在樺樹上的一種食藥用真菌，其子實(shí)體中含有200多種活性物質(zhì)，具有抗癌、抗炎、抗氧化、降血脂、降血糖、延緩衰老、提高免疫力、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)、抑菌等多種生理功能[1-2]。目前關(guān)于樺褐孔菌活性物質(zhì)報(bào)道較多的是其多糖和三萜類物質(zhì)，關(guān)于樺褐孔菌多酚抗細(xì)菌活性較少報(bào)道[3-4]。研究表明，多酚中如鞣酸、黃酮類等成分具有抗菌性能[5]。酚類物質(zhì)對(duì)多種細(xì)菌都有抑制作用，如對(duì)霍亂菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等常見致病菌抑制能力更強(qiáng)，同時(shí)多酚類并不影響生物體本身的生長(zhǎng)發(fā)育[6]。SHIN Y S等[7]研究發(fā)現(xiàn)，多酚可以有效的抑制一些微生物的毒性，比如說(shuō)致病性的病毒、真菌和細(xì)菌等。麝香葡萄（Vitis rotundifolia）含有的兒茶素和表兒茶素、槲皮素、山奈酚和反式白藜蘆醇已被證明有很好的抑菌活性[8]。張慧麗等[9]研究花生紅衣提取物黃酮酚類、單寧類等多酚類物質(zhì)，并證明其對(duì)大腸桿菌、葡萄球菌等均有一定的抑制活性。鐘秀宏等[10]報(bào)道了蘋果中多酚類物質(zhì)對(duì)細(xì)菌具有一定的抑制作用，且多酚濃度與抑菌活性呈量效關(guān)系。本研究通過(guò)抑菌圈試驗(yàn)確定樺褐孔菌（Inonotusobliquus）多酚的抑菌譜，探究pH、溫度、紫外照射、鹽濃度對(duì)樺褐孔菌多酚抑菌活性的影響，通過(guò)細(xì)菌生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)、紫外吸收、電導(dǎo)率及細(xì)胞形態(tài)變化研究樺褐孔菌多酚的抑菌活性。

目前關(guān)于樺褐孔活性物質(zhì)報(bào)道較多的是多糖和三萜類物質(zhì)，關(guān)于樺褐孔菌多酚的提取純化及生物活性分析較少報(bào)道。本研究以樺褐孔菌子實(shí)體為原材料，提取樺褐孔菌多酚類物質(zhì)，對(duì)其抗細(xì)菌活性進(jìn)行了初步探索。為樺褐孔菌多酚在生物醫(yī)藥產(chǎn)品食品防腐劑等領(lǐng)域的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樺褐孔菌（Inonotus obliquus）子實(shí)體：哈爾濱貝加爾泰生物工程有限公司；無(wú)水、正丁醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、鐵氰化鉀、抗壞血酸（均為分析純）：上海生物化學(xué)試劑公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、Tris（均為分析純）：美國(guó)Sigma公司。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)固體培養(yǎng)基：10 g 胰蛋白胨，5 g 牛肉膏，10 g NaCl，15 g瓊脂，1 L蒸餾水，pH 7.0；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液體培養(yǎng)基：10 g 胰蛋白胨，5 g 牛肉膏，10 g NaCl，1 L蒸餾水，pH 7.0。121.3 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后，自然冷卻備用。

1.2 儀器與設(shè)備

SU1510掃描電鏡：日本日立高新技術(shù)公司；TP-2000E電子天平：湘儀天平儀器設(shè)備有限公司；AUTOCLAVEMLS-3020不銹鋼滅菌鍋：日本三洋公司；SG-81電熱恒溫干燥箱：日本雅瑪拓公司；M-CENTRIFUGE小型離心機(jī)：杭州柏恒科技有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮儀器廠；EZ550Q冷凍干燥儀：美國(guó)FTSSystems公司。

1.3 方法

1.3.1 樺褐孔菌多酚的提取

樺褐孔菌子實(shí)體于65 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量后，粉碎至粉末狀，準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的樺褐孔菌子實(shí)體粉末放入一定體積的乙醇溶液中，提取條件為料液比1∶20（g∶mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間90 min。浸提處理得上清液，經(jīng)無(wú)水乙醇醇沉、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)、有機(jī)溶劑萃取、離心及冷凍干燥后測(cè)定多酚提取率。采用經(jīng)過(guò)部分修改的福林酚（Folin-Ciocalteu）法測(cè)定樺褐孔菌中多酚的含量[11]。

1.3.2 菌懸液的制備

需要檢測(cè)的菌株首先使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為220 r/min、37 ℃、12 h過(guò)夜，然后再將需要檢測(cè)的菌株重新接種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為220 r/min、37 ℃、2～4 h，使得菌株增長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，OD600nm值校正到0.3～0.5之間。待檢測(cè)的微生物數(shù)量級(jí)調(diào)整為約105CFU/mL[12]。

1.3.3 抑菌圈的測(cè)定

首先把提前準(zhǔn)備好的濾紙制作成直徑為15 mm的圓形紙片，放入培養(yǎng)皿內(nèi)。然后在超凈臺(tái)上，使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基將枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、單增李斯特菌進(jìn)行培養(yǎng)。然后在培養(yǎng)皿中加入5 mL過(guò)膜后的10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL的多酚溶液，充分浸泡2 h后，用無(wú)菌鑷子貼在培養(yǎng)基上，濾紙片一貼就不能再拿起，于37 ℃培養(yǎng)24 h。以無(wú)菌水做空白對(duì)照，觀察抑菌圈直徑大小，平行三次試驗(yàn)，取平均值。當(dāng)抑菌圈直徑大于6 mm時(shí)表示其具有抑菌活性。

1.3.4 最低抑菌濃度的測(cè)定

用試管二倍稀釋法確定待測(cè)樣品的最低抑菌濃度（minmum inhibitory concentration，MIC）[13]：培養(yǎng)液含菌量105CFU/mL，待測(cè)樣品用無(wú)菌水連續(xù)稀釋最終質(zhì)量濃度為0、0.1562mg/mL、0.3150mg/mL、0.625 0mg/mL、1.250 0mg/mL、2.500 0 mg/mL、5.000 0 mg/mL、10.000 0 mg/mL。在37 ℃培育18～24 h后，150 r/min搖床培養(yǎng)，每個(gè)濃度平行做三次測(cè)試，以試管中無(wú)菌生長(zhǎng)的最低濃度作為最小抑制濃度。以無(wú)菌水作為空白對(duì)照。

1.3.5 樺褐孔菌多酚抑菌活性的影響因素

（1）pH值對(duì)樺褐孔菌多酚抑菌活性的影響

用1 mol/L的NaOH溶液和1 mol/L的HCl溶液，調(diào)節(jié)5 mg/mL質(zhì)量濃度下的樺褐孔菌多酚溶液的pH值分別為3、4、5、6、7、8、9共7個(gè)梯度進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，以金黃葡萄球菌為指示菌，按照濾紙片法觀察pH對(duì)多酚抑菌活性的影響，以無(wú)菌水作空白對(duì)照，重復(fù)3個(gè)平板。

將5 mg/mL質(zhì)量濃度下的樺褐孔菌多酚溶液分別在40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃、121 ℃5個(gè)溫度下處理一定時(shí)間，以金黃葡萄球菌為指示菌，同樣采用濾紙片法觀察溫度對(duì)多酚抑菌活性的影響，以無(wú)菌水作空白對(duì)照，重復(fù)3個(gè)平板。

（3）鹽濃度對(duì)樺褐孔菌多酚抑菌活性的影響

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%氯化鈉溶液。以金黃葡萄球菌為指示菌，按照濾紙片法觀察鹽濃度對(duì)多酚抑菌活性的影響，以含同等濃度氯化鈉的無(wú)菌水作空白對(duì)照組，重復(fù)3個(gè)平板。

（4）紫外輻射對(duì)樺褐孔菌多酚抑菌活性的影響

樺褐孔菌多酚溶液使用紫外光滅菌，滅菌時(shí)間分別為0、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，以金黃色葡萄球菌為指示菌，同樣采用濾紙片法觀察紫外輻射對(duì)多酚抑菌活性的影響，以無(wú)菌水作空白對(duì)照，重復(fù)3個(gè)平板。1.3.6 樺褐孔菌多酚抑菌機(jī)制

（1）細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制

在制備細(xì)菌菌懸液中分別加入2.5 mg/mL和5.0 mg/mL樺褐孔菌多酚溶液，于30 ℃、160 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)。在0、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h 分別取樣，以金黃葡萄球菌為指示菌，在波長(zhǎng)630 nm處測(cè)定其吸光度值。然后繪制生長(zhǎng)曲線，另外以不加樺褐孔菌多酚溶液的為對(duì)照組。

采用焊接電流70～110A，電弧電壓10～16V，焊接速度40～95mm/min，層間溫度＜58℃的工藝進(jìn)行焊接。焊接接頭根部焊道使用?2.4mm的焊絲打底，填充及蓋面層焊道使用?1.6～?2.4mm的焊絲打底。熱輸入量要小，不得超越工藝規(guī)程中熱輸入量的要求，填充、蓋面時(shí)的熱輸入量不得高于打底時(shí)的熱輸入量。

（2）樺褐孔菌對(duì)多酚細(xì)胞膜通透性的影響

根據(jù)PARK Y K等[14]的方法，將金黃葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、單增李斯特菌、沙門氏菌分別接入液體培養(yǎng)基中，按照上述菌懸液的制備方法，使細(xì)菌數(shù)調(diào)整為大約105CFU/mL左右。將質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL樺褐孔菌多酚溶液等體積加入懸菌液，在37 ℃、150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)。用蒸餾水代替供試菌種作為對(duì)照組，分別于0、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h 測(cè)定懸菌液的電導(dǎo)率值，每樣重復(fù)3次。

（3）樺褐孔菌多酚對(duì)細(xì)胞泄漏的影響

具體檢測(cè)參照崔鶴松等[15]方法。

（4）樺褐孔菌多酚對(duì)細(xì)胞完整性的影響

將0.2 mL細(xì)菌菌懸液加入到牛肉膏蛋白棟固體培養(yǎng)基中，5 mg/mL樺褐孔菌多酚溶液處理濾紙片，按照濾紙片進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)觀察至出現(xiàn)明顯的抑菌圈，取抑菌圈部位和沒有抑菌圈部位。用雙面刀片切成2 mm×5 mm的小條，按照掃描電鏡生物樣品制備方法，固定、沖洗、脫水、置換、干燥、粘樣、鍍膜于掃描電鏡下觀察菌體形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化，以沒有抑菌圈部位的固體培養(yǎng)基作為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 樺褐孔菌多酚抑菌譜的測(cè)定

樺褐孔菌多酚抑菌效果的定性試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可知，樺褐孔菌多酚對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、單增李斯特菌、沙門氏菌均具有一定的抑制活性，且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌效果強(qiáng)于革蘭氏陰性菌。樺褐孔菌多酚的濃度和抑菌圈大小具有正相關(guān)的劑量關(guān)系，當(dāng)多酚質(zhì)量濃度從2.5 mg/mL升高到5 mg/mL時(shí)，抑菌圈直徑增加11.9%～28.3%，而多酚質(zhì)量濃度進(jìn)一步升高至10 mg/mL時(shí)，抑菌直徑增加34.5%～51.0%。在本實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著樺褐孔菌多酚質(zhì)量濃度的增大抑菌圈越大，抑制效果越明顯。通過(guò)比較每個(gè)抑制圈的大小，發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌多酚對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果最好，10 mg/mL時(shí)最大抑菌圈直徑為（19.5±0.15）mm，比同濃度下枯草芽孢桿菌、單增李斯特菌、大腸桿菌和沙門氏菌分別高23.4%、8.9%、18.2%和40.2%，因此選用金黃色葡萄球菌為后續(xù)試驗(yàn)的指示菌。

表1 樺褐孔菌多酚抑菌活性定性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Qualitative test results of the antimicrobial activity of Inonotus obliquus polyphenols

2.2 最低抑菌濃度的測(cè)定

由表2可知，樺褐孔菌多酚對(duì)金黃葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌、單增李斯特菌均具有抑制生長(zhǎng)的作用，但抑菌能力因濃度不同而不同，對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC最低，MIC為1.25 mg/mL，MIC越小說(shuō)明抑菌效果越好，對(duì)單增李斯特菌和大腸桿菌的MIC 低于2.5 mg/mL，對(duì)枯草芽孢桿菌和沙門氏菌的MIC低于5 mg/mL，樺褐孔菌多酚對(duì)枯草芽孢桿菌和沙門氏菌的抑制活性低于其他幾種供試菌。進(jìn)一步說(shuō)明了在供試菌中，樺褐孔菌多酚對(duì)金黃葡萄球菌的抑菌效果最好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣品對(duì)細(xì)菌的抑制能力具有選擇性，對(duì)金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和枯草芽孢桿菌（革蘭氏陽(yáng)性菌）的抑制能力優(yōu)于大腸桿菌和沙門氏菌（革蘭氏陰性菌）。對(duì)照樣品對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和沙門氏菌沒有抑菌性。

表2 樺褐孔菌多酚抑菌的最低抑菌濃度的測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of minimum inhibitory concentration of Inonotus obliquus polyphenols

2.3 不同因素對(duì)樺褐孔菌多酚抑菌活性的影響

2.3.1 pH對(duì)樺褐孔菌多酚抑菌的影響

圖1 pH值對(duì)樺褐孔菌多酚抑菌活性的影響Fig.1 Effect of pH value on the antimicrobial activity of Inonotus obliquus polyphenols

由圖1可知，不同pH值樺褐孔菌多酚溶液的抑菌活性有一定改變。隨著pH升高，抑菌圈直徑呈先升高后降低的趨勢(shì)，在pH值為3～6范圍處理后，抑菌圈直徑隨著pH升高而增大，在pH值為6時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大值為18.36 mm，當(dāng)pH值＞6處理后，抑菌圈直徑降低較明顯，抑菌效果變?nèi)?。這說(shuō)明樺褐孔菌多酚在強(qiáng)酸強(qiáng)堿下具有顯著的抑菌效果，而且酸性條件下的抑菌效果要顯著強(qiáng)于堿性條件。

2.3.2 溫度對(duì)樺褐孔菌多酚抑菌的影響

圖2 溫度對(duì)樺褐孔菌多酚抑菌活性的影響Fig.2 Effect of temperature on the antibacterial activity of Inonotus obliquus polyphenols

由圖2可知，多酚提取液在40～121 ℃范圍處理后，抑菌圈直徑大小變化不明顯，說(shuō)明樺褐孔菌多酚抑菌熱穩(wěn)定性較好，當(dāng)溫度＞80 ℃處理后，其抑菌圈直徑雖有變小但減小不明顯，仍有很好的抑菌效果。可能原因是高溫使提取液中的抑菌物質(zhì)發(fā)生了化學(xué)變化，致使其在高溫高壓條件下仍然具有一定的抑菌效果。

2.3.3 氯化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)樺褐孔菌多酚抑菌的影響

圖3 氯化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)樺褐孔菌多酚抑菌活性的影響Fig.3 Effect of NaCl concentration on the antibacterial activity of Inonotus obliquus polyphenols

由圖3可知，隨著氯化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，抑菌圈直徑逐漸增大，當(dāng)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%時(shí)，抑菌圈直徑最大為18.66 mm，與未添加鹽的抑菌圈直徑相比增加顯著，低濃度的鹽對(duì)樺褐孔菌多酚的抑菌效果具有一定的促進(jìn)作用，抑菌圈大小隨著氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈正相關(guān)。

2.3.4 紫外輻射時(shí)間對(duì)樺褐孔菌多酚抑菌的影響

由圖4可知，隨著紫外輻射時(shí)間增加，抑菌圈直徑變化不明顯，說(shuō)明紫外輻射在試驗(yàn)條件下，多酚對(duì)金黃葡萄球菌抑菌效果不明顯。當(dāng)紫外輻射后抑菌圈直徑較未經(jīng)紫外輻射的抑菌圈變化微弱。說(shuō)明紫外照射沒有對(duì)樺褐孔菌多酚對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制活性產(chǎn)生影響。

圖4 紫外輻射對(duì)樺褐孔菌多酚抑菌活性的影響Fig.4 Effect of UV radiation on the antibacterial activity of Inonotus obliquus polyphenols

2.4 樺褐孔菌多酚抑菌機(jī)制

2.4.1 樺褐孔菌多酚對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制

采用生長(zhǎng)曲線法[16]鑒定抑菌效果，結(jié)果見圖5。由圖5可知，經(jīng)樺褐孔菌多酚處理的實(shí)驗(yàn)組的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線與正常培養(yǎng)的對(duì)照組存在明顯的變化。未添加樺褐孔菌多酚處理的金黃葡萄球菌隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加具有典型的生長(zhǎng)特征，生長(zhǎng)狀況較好。對(duì)照組中，金黃葡萄球菌在0～5 h內(nèi)呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，5 h之后開始進(jìn)入穩(wěn)定期；樺褐孔菌多酚處理組均隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，OD600nm值初始增殖緩慢，在4 h到達(dá)增殖頂點(diǎn)，4 h后趨于穩(wěn)定，之后出現(xiàn)小幅度下降，且多酚質(zhì)量濃度為5 mg/mL處理組較2.5 mg/mL處理組OD600nm值小。說(shuō)明經(jīng)多酚處理后的金黃葡萄球菌的生長(zhǎng)受到抑制，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期縮短、甚至無(wú)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且抑制效果與多酚濃度呈正相關(guān)趨勢(shì)。

圖5 樺褐孔菌多酚對(duì)金黃葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig.5 Effect of Inonotus obliquus polyphenols on growth curve of Staphylococcus aureus

可能原因是多酚抑菌物質(zhì)沒有起到明顯作用，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間處理后，細(xì)菌生長(zhǎng)開始受到抑制，但是并沒有完全殺死細(xì)菌，表明其進(jìn)入衰亡期。并且細(xì)菌生長(zhǎng)情況隨著樺褐孔菌多酚質(zhì)量濃度的增加變得緩慢，但是整體變化趨勢(shì)相同。

2.4.2 樺褐孔菌多酚對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響

細(xì)胞膜是細(xì)菌的保護(hù)屏障，當(dāng)細(xì)菌遇到強(qiáng)抑菌劑，細(xì)胞膜遭到破壞時(shí)，菌體的保護(hù)屏障被打破，使其內(nèi)部電解質(zhì)外泄至培養(yǎng)液中，進(jìn)而使培養(yǎng)液的電導(dǎo)率上升。因此，菌液電導(dǎo)率的變化反映了細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的變化[17]。

圖6 樺褐孔菌多酚處理對(duì)細(xì)菌電導(dǎo)率的影響Fig.6 Effect of treatment of Inonotus obliquus polyphenols on conductivity of bacteria

由圖6可知，將1 mg/mL的樺褐孔菌多酚提取液作用于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)液，電導(dǎo)率較未經(jīng)處理的對(duì)照組存在明顯的變化，多酚作用細(xì)菌組的電導(dǎo)率明顯高于未處理組電導(dǎo)率。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、大腸桿菌培養(yǎng)液的電導(dǎo)率高于枯草芽孢桿菌、沙門氏菌，且均呈持續(xù)上升趨勢(shì)。處理1 h后金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌的電導(dǎo)率值分別為6.79 mS/cm、6.53 mS/cm、6.39 mS/cm、6.04 mS/cm、5.77 mS/cm，處理4 h后分別增加到7.134 mS/cm、6.79 mS/cm、6.653 mS/cm、6.35 mS/cm、5.97 mS/cm。處理4 h后金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、單增李斯特菌、沙門氏菌與對(duì)照相比電導(dǎo)率分別變大。作用4 h后，所有樣品的電導(dǎo)率值變化不明顯。這說(shuō)明經(jīng)過(guò)樺褐孔菌多酚溶液處理的菌體細(xì)胞細(xì)胞膜發(fā)生破壞而失去其選擇滲透性功能，使電解質(zhì)的滲出量不斷增大，因此導(dǎo)致菌液中電導(dǎo)率增加，可能原因是首先破壞細(xì)胞膜的完整性，增加了細(xì)胞膜的通透性，促使內(nèi)容物快速滲出，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性被破壞，從而起到抑菌作用。對(duì)照組的電導(dǎo)率開始0～1 h 內(nèi)略微上升，可能是由于測(cè)量時(shí)環(huán)境溫度的變化引起的，1 h后基本無(wú)變化。

2.4.3 樺褐孔菌多酚對(duì)細(xì)胞泄漏的影響

細(xì)胞膜是細(xì)胞完整的主要組成部分，可以使得細(xì)胞行使正常的生理活性。細(xì)菌細(xì)胞壁的口徑很小，只能夠通過(guò)1 nm大小的分子，大分子物質(zhì)就無(wú)法通過(guò)細(xì)胞壁[18]。一旦細(xì)菌遭受到破壞，例如遭受到抑菌物質(zhì)的影響后，細(xì)胞膜的功能會(huì)破壞，導(dǎo)致細(xì)菌結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，使細(xì)胞的功能喪失[19]。由于核酸在波長(zhǎng)260 nm處的釋放有強(qiáng)吸收，因此OD260nm值被廣泛用作評(píng)價(jià)細(xì)胞膜完整性的指標(biāo)[20]。

圖7 樺褐孔菌多酚處理對(duì)金黃葡萄球菌紫外吸收的影響Fig.7 Effects of treatment of Inonotus obliquus polyphenols on ultraviolet absorption of Staphylococcus aureus

由圖7可知，樺褐孔菌多酚對(duì)金黃葡萄球菌的抑制率具有顯著影響。未經(jīng)多酚處理組的OD260nm值隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加變化不明顯，說(shuō)明細(xì)菌處于穩(wěn)定的生長(zhǎng)情況。經(jīng)多酚處理組的OD260nm值隨著作用時(shí)間的增加呈顯著上升趨勢(shì)。0～4 h范圍內(nèi)OD260nm值隨著多酚作用時(shí)間增加顯著增大，作用4～6 h后OD260nm值緩慢增加。當(dāng)作用6 h后OD260nm值呈穩(wěn)定趨勢(shì)。且OD260nm值與多酚作用濃度呈正相關(guān)。說(shuō)明樺褐孔菌多酚可是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的核酸大量滲出，且樺褐孔菌多酚的濃度越大核酸泄露越明顯。

2.5 樺褐孔菌多酚對(duì)細(xì)胞完整性的影響

大腸桿菌經(jīng)樺褐孔菌多酚作用后，其掃描電鏡圖（scanningelectron microscopy，SEM）結(jié)果見圖8。

圖8 樺褐孔菌多酚處理大腸桿菌的掃描電鏡圖Fig.8 Scanning electron microscopy image of Escherichia coli treated with Inonotus obliquus polyphenols

由圖8A可知，正常的大腸桿菌菌體保持完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞表面光滑均勻、飽滿完整；由圖8B可知，經(jīng)過(guò)多酚抑菌處理后的部分菌體形態(tài)受到損壞，有不規(guī)則的突起，有輕微褶皺，個(gè)別菌體的形狀發(fā)生改變；放大倍數(shù)后可以清晰地看出菌體形態(tài)的扭曲、變形，個(gè)別甚至出現(xiàn)有黑色孔洞。多酚類是親水的物質(zhì)，可以通過(guò)大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生的形態(tài)學(xué)變化證明了樺褐孔菌多酚破壞了細(xì)菌細(xì)胞膜表面的光滑結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜出現(xiàn)孔隙，導(dǎo)致菌體自身裂解，細(xì)胞中的物質(zhì)滲出，代謝功能不平衡，從而對(duì)抗菌抑菌效果起到重要的作用。SEM 從形態(tài)學(xué)角度驗(yàn)證了樺褐孔菌多酚的抑菌機(jī)制，與以上微生物生長(zhǎng)曲線、電導(dǎo)率變化及紫外吸收推測(cè)的結(jié)果吻合一致。

3 討論

抑菌活性研究結(jié)果表明，樺褐孔菌多酚提取物對(duì)供試菌具有廣譜抑菌效果。對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌效果強(qiáng)于革蘭氏陰性菌的抑菌效果。可能是由于兩種細(xì)菌細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)的差異。研究發(fā)現(xiàn)，革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁含有大量的肽聚糖，因此，多酚能與肽聚糖作用可以自由進(jìn)出細(xì)胞。與革蘭陽(yáng)性菌相比，革蘭氏陰性菌由于其細(xì)胞壁有外膜覆蓋，不利于酚類物質(zhì)與肽聚糖脂多糖作用，滲透進(jìn)細(xì)胞壁[21]。陳崗[22]研究發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌核提取物可以抑制某些革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的數(shù)量和活性。曲詞等[23]在對(duì)海黍子多酚的抑菌活性研究時(shí)證明多酚對(duì)革蘭氏陰性、陽(yáng)性菌均有很好的抑制作用，且對(duì)金黃葡萄球菌抑菌效果最好。最低抑菌濃度與抑菌活性的測(cè)定同時(shí)證明以金黃葡萄球菌為指示菌，進(jìn)行抑菌因素的影響是可行的。與文獻(xiàn)[24]描述相一致，在對(duì)樺褐孔菌多酚抑菌活性影響因素試驗(yàn)可知，樺褐孔菌多酚在pH為6時(shí)抑菌活性達(dá)到最大。多酚類在自然條件下處于酸性物質(zhì)，物質(zhì)極其不穩(wěn)定，當(dāng)外界環(huán)境處于堿性條件下易發(fā)生反應(yīng)，多酚提取物中的抑菌物質(zhì)被破壞，所以導(dǎo)致其抑菌能力變?nèi)酢＿@與沈夢(mèng)薇[25]報(bào)道相一致，樺褐孔菌多酚經(jīng)低鹽濃度處理后，其抑菌活性增加，可能是由于低鹽本身是細(xì)菌生長(zhǎng)的有利條件，低鹽濃度對(duì)樺褐孔菌多酚提取物沒有影響。與董周永等[26]關(guān)于石榴提取物中多酚類物質(zhì)的存在結(jié)果相一致，儀淑敏[27]關(guān)于茶多酚對(duì)魚糜制品的冷藏保鮮作用及抑菌機(jī)理的研究也表明細(xì)菌在低鹽濃度條件下生長(zhǎng)良好。樺褐孔菌多酚提取物經(jīng)升溫和紫外照射后，其抑菌圈變化不明顯，仍然存在很強(qiáng)的抑菌能力，說(shuō)明樺褐孔菌多酚對(duì)加熱和紫外照射具有很好的穩(wěn)定性，可能原因與樺褐孔菌多酚結(jié)構(gòu)有關(guān)，經(jīng)鑒定樺褐孔菌多酚具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，在紫外區(qū)具有強(qiáng)吸收峰，結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定不至于受影響，從而保證了抑菌活性的穩(wěn)定。

目前對(duì)多酚抑菌機(jī)理有有以下幾點(diǎn)[28]，多酚通過(guò)作用于細(xì)菌的內(nèi)外細(xì)胞膜，來(lái)破壞細(xì)胞膜的流動(dòng)性及半透性功能致使細(xì)胞膜破裂促使胞內(nèi)內(nèi)溶物外泄。多酚通過(guò)作用于細(xì)菌的細(xì)胞壁而發(fā)揮其抑菌作用；多酚通過(guò)影響細(xì)菌的生物大分子合成，如脫氧核糖核酸（deoxyribonucleosides，DNA）、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）、蛋白質(zhì)等，從而影響細(xì)菌遺傳表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)菌形態(tài)改變。樺褐孔菌多酚對(duì)金黃葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的具有一定的抑制作用，且與濃度呈劑量關(guān)系。此研究與胡公義等[29]對(duì)茶多酚對(duì)空腸彎曲菌抑菌機(jī)理研究相符合，紫外吸收和DNA條帶的變化表明樺褐孔菌多酚可能影響細(xì)菌DNA而完成抑菌作用，這與唐正偉[30]對(duì)廣藿香酮及其衍生物對(duì)抗菌機(jī)理的研究相符合。樺褐孔菌多酚作用細(xì)菌電導(dǎo)率的變化與高愿軍等[31]研究的結(jié)果趨勢(shì)一致。說(shuō)明樺褐孔菌多酚影響了細(xì)胞膜的通透性。掃描電鏡觀察樺褐孔菌多酚處理過(guò)的大腸桿菌的形態(tài)變化與趙艷霞等[32]用掃描電鏡觀察得到相同的結(jié)論。說(shuō)明樺褐孔菌多酚可改變細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性。樺褐孔菌多酚其本身無(wú)毒性，可以使其作為一種天然抑菌劑，可作為防腐劑應(yīng)用于食品生產(chǎn)中。

4 結(jié)論

樺褐孔菌多酚具有廣譜抑菌效果，且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制能力優(yōu)于革蘭氏陰性菌，對(duì)大腸桿菌（G-）、金黃色葡萄球菌（G+）、單增李斯特菌（G+）、沙門氏菌（G-）和枯草芽孢桿菌（G+）最小抑菌濃度分別為2.50 mg/mL、1.25 mg/mL、2.50 mg/mL、5.00 mg/mL和5.00 mg/mL。在pH值為6、鹽濃度為0.8%時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達(dá)到最大值，分別為18.36 mm、18.66 mm。樺褐孔菌多酚抑菌在40～121 ℃熱穩(wěn)定性較好，并且對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，10 mg/mL時(shí)最大抑菌圈直徑為（19.5±0.15）mm，比同濃度下枯草芽孢桿菌、單增李斯特菌、大腸桿菌和沙門氏菌分別高23.4%、8.9%、18.2%和40.2%。