養(yǎng)殖塘底泥中溶藻細(xì)菌的分離及16S rRNA序列分析

黃晶晶，陳 敏

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311121)

近年來，有害藻類水華的爆發(fā)日趨頻繁，不僅使水環(huán)境遭受嚴(yán)重破壞，更直接影響人們的飲用水源及公共衛(wèi)生健康，同時(shí)也給水產(chǎn)資源和養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的危害和損失[1].因此，積極探索藻類水華的發(fā)生規(guī)律以及經(jīng)濟(jì)有效的防治方法，無疑具有非常重要的科學(xué)意義和應(yīng)用前景[2].

目前，災(zāi)害性水華治理措施主要包括營養(yǎng)限制、直接除藻和生物治理技術(shù).其中營養(yǎng)限制是治理的主要目標(biāo)，但往往要經(jīng)過若干年才能取得成效，因此對于水華爆發(fā)的直接控制要求而言具有局限性.直接除藻包括化學(xué)藥品殺藻和機(jī)械撈藻等措施，一般能在短時(shí)間內(nèi)發(fā)揮作用，但在人力和物力方面耗資巨大，并且不可避免地對水環(huán)境產(chǎn)生不利影響，也不能從根本上解決富營養(yǎng)化問題.而生物治理技術(shù)被認(rèn)為是能短時(shí)控藻同時(shí)又作用顯著的生態(tài)治藻策略[2-3].生物控藻主要是利用具有除藻作用的植物、動物或微生物來控制藻類生長的一類方法，其中以溶藻細(xì)菌的除藻研究最為深入[4-5].本研究從杭州某養(yǎng)殖塘底泥中直接分離細(xì)菌，從中篩選溶藻活力強(qiáng)的菌株，以期為富營養(yǎng)化水環(huán)境的藻類治理提供理論基礎(chǔ)和應(yīng)用參考.

1 材料與方法

1.1 藻種

銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)，購于中國科學(xué)院水生生物研究所藻種保藏中心.

1.2 樣品

從杭州某水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘挖取底泥，裝于無菌塑料離心管中，4 ℃暫時(shí)保存.帶回實(shí)驗(yàn)室后立即用于菌種分離.

1.3 培養(yǎng)基

BG-11培養(yǎng)基：NaNO31.5 g·L-1，K2HPO40.04 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.075 g·L-1，CaCl2·7H2O 0.036 g·L-1，Na2CO30.02 g·L-1，檸檬酸0.006 g·L-1，檸檬酸鐵0.006 g·L-1，氨芐青霉素50 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，pH 7.1.

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，氯化鈉10 g·L-1，瓊脂粉15 g·L-1， pH 7.0～7.2.

1.4 藻種培養(yǎng)

按10%的接種量將藻種接入裝有BG-11培養(yǎng)基的三角瓶中，用無菌透氣膜封口，放入25 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，光照強(qiáng)度3 000 lx，光暗周期比14 h∶10 h，每天搖晃4次.培養(yǎng)14 d左右，至葉綠素a的質(zhì)量濃度達(dá)到0.7 mg·L-1[6].

1.5 溶藻細(xì)菌的分離

稱取10 g底泥樣品，加入100 mL無菌水充分振蕩，靜止后取上清液，按10%的比例接入銅綠微囊藻培養(yǎng)液(葉綠素a質(zhì)量濃度為0.7 mg·L-1)中，25 ℃光照強(qiáng)度3 000 lx，光暗周期比14 h∶10 h，培養(yǎng)7 d.每天定時(shí)搖晃三角瓶4次，并觀察有無黃化現(xiàn)象.以藻液中加入等量蒸餾水為對照組.

取有明顯黃化現(xiàn)象的培養(yǎng)液，經(jīng)適當(dāng)稀釋后涂布LB培養(yǎng)基平板，放入37 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)24～48 h，用接種環(huán)挑選不同的單菌落進(jìn)行劃線分離純化，4 ℃冰箱保存[7].

1.6 溶藻活性測定

將上述分離的菌株分別接入到LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至每毫升含菌108個(gè).將銅綠微囊藻藻種活化后接種于BG-11培養(yǎng)基，置于25 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，光照強(qiáng)度3 000 lx，光暗周期比14 h∶10 h，至藻液葉綠素a質(zhì)量濃度為0.7 mg·L-1.分別取5 mL菌液和50 mL藻液均勻混合，放入37 ℃、180 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)，48 h后取樣測定葉綠素a質(zhì)量濃度[7].

1.7 葉綠素a質(zhì)量濃度及去除率的計(jì)算

用葉綠素a質(zhì)量濃度表征溶藻效果.采用丙酮提取分光光度法測定葉綠素a質(zhì)量濃度：將藻液搖勻后，取30 mL加入到離心管中，4 000 r/min離心10 min，吸去上清液，再加入10 mL 90%丙酮溶液，黑暗中提取24 h，4 000 r/min離心10 min，取上清，用722型分光光度計(jì)測定OD664[8].葉綠素a的去除率按下式計(jì)算：

R=(C0-Ce)/C0×100.

式中，R為葉綠素a的去除率(%)；C0為對照組藻葉綠素a的質(zhì)量濃度(mg·L-1)；Ce為處理組藻葉綠素a的質(zhì)量濃度(mg·L-1).

1.8 細(xì)菌16S rRNA基因測序

16S rRNA基因擴(kuò)增參見文獻(xiàn)[9].PCR產(chǎn)物送交上海英俊生物技術(shù)公司進(jìn)行序列測定.

1.9 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將測序結(jié)果提交到GenBank中得到基因序列登錄號，并利用EzTaxon server 2.1[10]查找與該菌株相似性較高的模式菌株的16S rRNA基因序列.采用MEGA5.0軟件包中的Kimura 2-Parament model及Neiggbor-Joining法進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹.

2 結(jié)果與分析

2.1 溶藻細(xì)菌的分離和篩選

將底泥樣品接入銅綠微囊藻藻液中，經(jīng)7 d光照培養(yǎng)，出現(xiàn)了藻液的黃化現(xiàn)象，而加蒸餾水的對照組未觀察到黃化現(xiàn)象.這表明加了底泥樣品的藻液中藻細(xì)胞被破壞，可能存在溶藻細(xì)菌.取黃化液進(jìn)行稀釋并涂布平板，根據(jù)菌落的顏色、大小和形狀，共分離到20株菌株.將純化后的菌株進(jìn)行溶藻活性測定，結(jié)果表明，20株菌株中共有14株顯示出強(qiáng)弱不同的溶藻活性，其余的6株無溶藻活性(表1).有9株菌株(MS7、MT27、MH1、AT39、AT62、AT9、MT22、AS6、MH2)的葉綠素a去除率達(dá)到了50%以上，其中MS7和MT22的葉綠素a去除率分別達(dá)到了91.0%和 73.7%，溶藻活性較強(qiáng).

表1 溶藻細(xì)菌的篩選Tab.1 The isolation of algicidal bacteria

2.2 16S rRNA基因測序和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

對有溶藻效果的14株菌株進(jìn)行16S rRNA基因測序.測序結(jié)果提交到GenBank中得到基因序列登錄號，并利用EzTaxon server 2.1查找與該菌株相似性較高的模式菌株的16S rRNA基因序列.比對結(jié)果如表2所示.

表2 溶藻細(xì)菌16S rRNA基因測序比對結(jié)果Tab.2 Results of the best march to known species of algicidal bacteria

結(jié)果表明，除了AT菌株以外，其他13株均歸為芽孢桿菌屬(Bacillus)，其中有2株菌株與蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)的同源性分別為99.6%和99.7%；有4株菌株與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的同源性在99.7%～99.9%；有1株菌株與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethy-lotrophicus)的同源性達(dá)到99.7%；另有3株菌株與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的同源性達(dá)到99%以上；其他各有1株菌株分別與蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、高地芽孢桿菌(Bacillusaltitudinis)和死亡谷芽孢桿菌(Bacillusvallismortis)的同源性達(dá)到99.9%、99.8%和99.6%.AT菌株是唯一不屬于芽孢桿菌的細(xì)菌，與墨西哥微小桿菌(Exiguobacteriummexicanum)的同源性達(dá)到了99.9%.

從 Genbank數(shù)據(jù)庫中搜索與溶藻細(xì)菌相對應(yīng)的模式菌株的16S rRNA 序列，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果如圖1所示.

圖1 溶藻菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 The phylogenetic tree of algicidal bacteria

3 討論

溶藻細(xì)菌是指能夠通過直接或間接方式抑制或殺死藻細(xì)胞，從而導(dǎo)致藻細(xì)胞溶解的一類細(xì)菌，對水華的控制和維持藻類的生物量平衡有非常重要的作用，已經(jīng)引起越來越多的關(guān)注.溶藻細(xì)菌一般從水體直接分離，具有很好的生態(tài)安全性.本研究以養(yǎng)殖塘底泥為分離源，采用稀釋涂布法從藻類黃化液中分離得到細(xì)菌20株，通過溶藻活性的初步研究，有 14株顯示出強(qiáng)弱不同的溶藻活性，其中MS7和MT22的葉綠素a去除率分別達(dá)到了91.0%和 73.7%，是2株溶藻活性較強(qiáng)的菌株.

目前，已被分離和報(bào)道的溶藻細(xì)菌主要有芽孢桿菌屬、交替單胞菌屬(Alteromonas)、纖維弧菌屬(Cellvibrio)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、哈赫拉菌(Hahellachejuensis)、放線菌(Actinobacteria)、交替假單胞菌屬(Pseudoalteromonas)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)和弧菌屬(Vibrio)等[4].其中芽孢桿菌是國內(nèi)外近年來研究較多的一類溶藻細(xì)菌，對水生生態(tài)系統(tǒng)的生物修復(fù)有很重要的意義[11]，已報(bào)道的具有溶藻作用的芽孢桿菌主要有蠟狀芽孢桿菌[12]、解淀粉芽孢桿菌[13]、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)[14]和梭形芽孢桿菌(B.fusiformis)[15]等.本研究分離的14株溶藻細(xì)菌，經(jīng)16S rRNA基因測序，除1株為微小桿菌屬(Exiguobacteriu)外，其余13株皆為芽孢桿菌屬，可見養(yǎng)殖池中本身存在大量的對于銅綠微囊藻有抑制作用的芽孢桿菌，這對于利用土著細(xì)菌重建水體良性的生態(tài)系統(tǒng)有重要的參考價(jià)值.同時(shí)，研究結(jié)果為新型生物殺藻劑的深入研究和開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ).