牛源莢膜血清A1型溶血性曼氏桿菌的分離鑒定及生物學(xué)特性研究

汪 陽(yáng)，薛 晶，趙潔雅，汪 萍，沈辰峰，苗書(shū)魁，梁紀(jì)元，馬文戈，張 楊，夏 俊*，杜 瑋*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆畜牧科學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000)

溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica)原名溶血性巴氏桿菌(Pasteurellahaemolytica)，棲息在鼻咽部與宿主保持一種共生的關(guān)系[1-2]，是引起運(yùn)輸熱(shipping fever)即牛呼吸道疾病綜合征(bovine respiratory disease complex，BRDC)的病原之一，具有全球分布性[3]。溶血性曼氏桿菌是一種機(jī)會(huì)致病菌，當(dāng)宿主因運(yùn)輸、環(huán)境等應(yīng)激或感染呼吸道病毒或支原體(Mycoplasma bovis，M.bovis)導(dǎo)致抵抗力下降時(shí)，該菌會(huì)通過(guò)呼吸道漿液性和黏液性分泌物從共生狀態(tài)被釋放出[4]，從而侵襲宿主肺部引起呼吸道疾病[2,5]。近年來(lái)由溶血曼氏桿菌引起牛、羊急性肺炎及敗血癥不斷增多，給牛、羊養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)較大危害。2019年10月，新疆某規(guī)?；?chǎng)陸續(xù)發(fā)生了由于長(zhǎng)途運(yùn)輸導(dǎo)致牛運(yùn)輸綜合征的疑似病例，此批牛在運(yùn)輸途中及到場(chǎng)后發(fā)病死亡，病牛體溫升高至41～41.5 ℃、咳嗽、呼吸困難、流鼻涕，病程短、死亡快(1～5 d)，先后死亡10余頭。剖檢急性死亡?？梢?jiàn)心外膜、心冠脂肪出血，肺臟嚴(yán)重充血、出血，纖維素性肺炎，肝臟、膽囊腫大，但脾臟不腫大。為了確定引起該病的病原，本研究無(wú)菌采集了病死牛心臟、肺臟等病變組織進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定，并對(duì)分離菌的生物學(xué)特性進(jìn)行分析，為進(jìn)一步探討溶血曼氏桿菌的致病機(jī)制提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 心血及肺臟組織，采自新疆某牛場(chǎng)新購(gòu)進(jìn)的病死牛。

1.1.2 主要試劑 腦心浸液肉湯(BHI)購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；革蘭氏染色液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 18～22 g健康巴貝斯小鼠購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)疫病預(yù)防與控制中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離 取心血及肺臟病變組織在無(wú)菌環(huán)境下接種于BHI液體培養(yǎng)基上，置于37 ℃水平搖床(150 r/min)進(jìn)行增菌培養(yǎng)，并將肺臟病變組織于無(wú)菌條件下切取一小塊涂抹于BHI固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h。24 h后將菌液進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，然后將固體平板上的單菌落挑出再接種于BHI液體培養(yǎng)基上，置于37 ℃水平搖床(150 r/min)進(jìn)行培養(yǎng)并觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況，分離株命名為XJMA1-1。

1.2.2 生化鑒定試驗(yàn) 無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)將生化鑒定管上端用砂輪劃痕折斷，與酒精燈火焰消毒，然后用接種環(huán)將純化的細(xì)菌培養(yǎng)物接種于 D-葡萄糖、D-麥芽糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-乳糖、D-木糖、靛基質(zhì)、脲酶、吲哚等微型生化鑒定管，置滅菌平皿內(nèi)或小試管架上，放于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，按規(guī)定時(shí)間觀察記錄結(jié)果。

1.2.3 PCR鑒定 所用引物為溶血性曼氏桿菌鑒定引物，以及溶血性曼氏桿菌血清型A1型引物、A2型引物、A6型引物進(jìn)行PCR鑒定，PCR反應(yīng)體系50 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增：

其中2×Taq PCR Master Mix 25 μL，引物各2 μL，模板2 μL，超純水補(bǔ)至50 μL[6]，離心混合均勻后置PCR擴(kuò)增儀中。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃循環(huán)變性30 s，56 ℃退火復(fù)性30 s，72 ℃延伸40 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，最后4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，參照標(biāo)準(zhǔn)DNA 2000 Marker，對(duì)待檢樣品目的DNA片段進(jìn)行鑒定。用瓊脂凝膠回收試劑盒將PCR產(chǎn)物回收后，送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 毒力因子檢測(cè) 對(duì)分離株進(jìn)行16SRNA、core、9s6、lkt、lk、p1p、Hy、dna、T、fbp、tbp等毒力基因檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系及方法同1.2.3。

1.2.5 致病性試驗(yàn) 選取健康的巴貝斯小鼠，試驗(yàn)前7 d，觀察小鼠食欲、精神狀況，確保小鼠食欲、精神正常的情況下將分離株分別腹腔注射200 μL 4只小鼠，另外4只小鼠作為空白對(duì)照，并隨時(shí)觀察小鼠的食欲和精神狀況。

1.2.6 藥敏試驗(yàn) 按常規(guī)紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌形態(tài)及培養(yǎng)特性

在病料及培養(yǎng)物涂片后，革蘭氏鏡檢可見(jiàn)球狀或桿狀、兩端鈍圓，呈單個(gè)、成對(duì)散在排列的革蘭氏陰性球桿菌(圖1)。從心血、肺臟分離的菌株在BHI固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落呈圓形、光滑、濕潤(rùn)、灰白色的小菌落(圖2)。

圖1 革蘭氏染色鏡檢

圖2 BHI固體培養(yǎng)基

2.2 生化鑒定試驗(yàn)結(jié)果

生化試驗(yàn)結(jié)果(表1)顯示，分離菌能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、阿拉伯糖、甘露醇、甘露糖、乳糖、木糖等碳水化合物，不發(fā)酵脲酶和吲哚，產(chǎn)生少量酸而不產(chǎn)氣，符合溶血曼氏桿菌生化特性。

表1 生化鑒定試驗(yàn)結(jié)果

2.3 PCR鑒定結(jié)果及分析

用曼氏桿菌鑒定引物，以及曼氏桿菌血清型A1型引物、A2型引物、A6型引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，4株菌均為曼氏桿菌A1型(圖3)。

圖3 PCR擴(kuò)增結(jié)果圖

2.4 毒力因子檢測(cè)結(jié)果及分析

用16SRNA、core、9s6、lkt、lk、p1p、Hy、dna、T、fbp、tbp基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，該菌株在16SRNA、9s6、lkt、lk、Hy、dna、fbp基因擴(kuò)增出600、170、440、180、440、170、160的條帶(圖4)，與預(yù)期片段相符。

圖4 溶血性曼氏桿菌毒力基因檢測(cè)

2.5 致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

攻毒后小鼠連續(xù)觀察4 h后，出現(xiàn)精神沉郁，被毛粗亂，18 h后小鼠陸續(xù)死亡(圖5)。

圖5 溶血性曼氏桿菌小鼠攻毒試驗(yàn)

2.6 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溶血性曼氏桿菌分離株對(duì)左氧氟沙星、氟本尼考、替米考星高度敏感，對(duì)頭孢曲松鈉、阿奇霉素、乳酸環(huán)丙沙星中度敏感，對(duì)硫酸阿米卡星、鹽酸林可霉素、克林霉素、硫酸慶大霉素不敏感。

3 討論

溶血性曼氏桿菌是引起牛運(yùn)輸熱的主要病原之一[7-8]。近年來(lái)，隨著新疆養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，各地頻繁調(diào)運(yùn)牛，由運(yùn)輸應(yīng)激引發(fā)病原感染造成調(diào)運(yùn)牛死亡病例日趨增多，給牛的調(diào)運(yùn)帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)損失[9-10]。但由溶血性曼氏桿菌引發(fā)調(diào)運(yùn)牛發(fā)病死亡的確診報(bào)道及對(duì)病原的生物學(xué)特性分析在新疆鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)從發(fā)生急性敗血癥死亡牛的病變組織中分離到革蘭氏陰性短桿菌，病料涂片瑞氏染色可見(jiàn)兩極濃染及明顯的莢膜，細(xì)菌在腦心浸液肉湯(BHI)固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落呈圓形、光滑、濕潤(rùn)、灰白色小菌落。生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、阿拉伯糖、甘露醇、甘露糖和木糖等碳水化合物，不發(fā)酵脲酶和吲哚，與馮旭飛等[11]報(bào)道基本一致，符合溶血性曼氏桿菌的生化反應(yīng)特性。通過(guò)PCR鑒定試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分離菌與溶血性曼氏桿菌的同源性高達(dá)99%，表明分離株均為溶血性曼氏桿菌。溶血性曼氏桿菌共有12個(gè)血清型，其中A1和A2血清型是優(yōu)勢(shì)菌株，A1血清型是牛運(yùn)輸熱的主要病原，A2血清型是引起綿羊發(fā)病的最常見(jiàn)的血清型，也有報(bào)道認(rèn)為其他血清型的菌株也與疾病的發(fā)生有關(guān)。通過(guò)血清型基因序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，分離菌與A1型溶血曼氏桿菌的同源性高達(dá)98%以上，表明分離株為A1型溶血曼氏桿菌。國(guó)內(nèi)對(duì)血清型鑒定菌株的研究極少。因此有必要進(jìn)一步研究該分離株的致病性，為牛、羊感染溶血性曼氏桿菌的控制提供依據(jù)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)引起牛運(yùn)輸熱的病原進(jìn)行分離鑒定，經(jīng)細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)該菌為兩端鈍圓，呈單個(gè)或成對(duì)散在排列的革蘭氏陰性球桿菌；生化鑒定結(jié)果顯示該菌不發(fā)酵脲酶和吲哚，產(chǎn)生少量酸而不產(chǎn)氣，符合曼氏桿菌的生化特性。經(jīng)形態(tài)觀察、培養(yǎng)特性和生化鑒定、PCR鑒定及PCR分型鑒定確定該分離菌株為A1型溶血性曼氏桿菌。使用藥敏紙片，將該分離菌株進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)左氧氟沙星、氟本尼考、替米考星高度敏感，對(duì)頭孢曲松鈉、阿奇霉素、乳酸環(huán)丙沙星中度敏感，對(duì)硫酸阿米卡星、鹽酸林可霉素、克林霉素、硫酸慶大霉素不敏感。小鼠致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明該菌株對(duì)健康小鼠有一定的致病能力。