福建省禽源大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

陳秀琴 張世忠 江 斌 林 琳 鄭 敏 林 黃梅清＊

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 福州 350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心 福州 350013）

大腸桿菌普遍存在于環(huán)境中， 包括哺乳動物和禽類的消化道內(nèi)，其中的部分血清型可致病，成為環(huán)境、食品、水等污染的重要指示細(xì)菌[1]。 此外，畜禽源致病大腸桿菌還可傳染人，從而引發(fā)各種疾病[2]。 禽大腸桿菌病是由埃希氏大腸桿菌引起的多種病的統(tǒng)稱，包括大腸桿菌性氣囊炎、腹膜炎、輸卵管炎等[3]。

禽養(yǎng)殖場中普遍使用小劑量抗生素用于促生長和預(yù)防疾病， 但是持續(xù)使用抗生素會導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。大部分抗生素并不能完全在腸道內(nèi)被吸收。有文獻(xiàn)報道給雞飼喂的抗生素高達(dá)90%隨糞便排出體外[4]，從而導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。 據(jù)估計，歐洲每年大約有超過3.3 萬人死于抗生素耐藥感染，到2050 年， 全球每年將有1 000 萬人死于抗生素耐藥[5]。 為了解福建省禽源大腸桿菌的抗生素耐藥性情況， 對若干個發(fā)病養(yǎng)殖場進(jìn)行大腸桿菌分離鑒定及藥物敏感性研究， 以期為福建省禽大腸桿菌病的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料樣品來源 2018-2019 年采集于福建省中大型養(yǎng)禽場。

1.2 培養(yǎng)基與試劑 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏染色液及大腸桿菌IMViC 生化鑒定盒均購自廣東環(huán)凱微生物科技公司， 藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 細(xì)菌分離純化 取病死禽的心、肝直接在麥康凱瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，于37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單個紅色菌落接種于普通營養(yǎng)肉湯，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。 將培養(yǎng)好的菌液置于4 ℃冰箱，用于生化試驗鑒定及藥物敏感性試驗。

1.4 生化試驗 將符合大腸桿菌形態(tài)特征的細(xì)菌，按照說明書要求接種于大腸桿菌IMViC 生化鑒定試管中 （靛基質(zhì)、MR、VP、 枸櫞酸鹽），37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄結(jié)果。

1.5 藥敏試驗 吸取100 μL 經(jīng)鑒定好的大腸桿菌菌液到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，用L 型一次性涂布棒涂抹均勻， 待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后， 選取以下10 種常用抗生素：丁胺卡那霉素、多黏菌素B、復(fù)方新諾明、慶大霉素、頭孢菌素、四環(huán)素、呋喃唑酮、鏈霉素、林可霉素、多西環(huán)素，將藥敏片貼到營養(yǎng)瓊脂表面，37 ℃培養(yǎng)18 h 后，觀察測量抑菌圈的大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離鑒定結(jié)果 分離菌株在麥康凱瓊脂平板上形成紅色、圓形、表面光滑濕潤、邊緣整齊的菌落；該菌落在伊紅美藍(lán)平板上呈紫黑色、表面光滑濕潤并帶有金屬光澤；培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢結(jié)果為革蘭氏陰性、 兩端鈍圓的短桿菌。 根據(jù)以上判斷方法， 從20 份樣品初步分離到15 株禽源大腸桿菌，包括10 株雞源大腸桿菌和5 株鴿源大腸桿菌。

2.2 生化鑒定結(jié)果 將分離的15 株細(xì)菌進(jìn)行大腸桿菌IMViC 生化試驗鑒定， 結(jié)果15 株細(xì)菌靛基質(zhì)試驗和MR 試驗均為陽性，VP 試驗和枸櫞酸鹽試驗均呈陰性。 以上生化試驗結(jié)果均符合經(jīng)典大腸桿菌的生化特征。

2.3 藥敏試驗結(jié)果 對分離的15 株禽源大腸桿菌進(jìn)行藥物敏感性試驗。藥物敏感性的判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：抑菌圈直徑15.1～20 mm 者為高度敏感；直徑10.1～15 mm 者為中度敏感； 直徑在10 mm 及以下者為耐藥[6]。 由表1 可知，大部分菌株對復(fù)方新諾明（13/15）、頭孢菌素（10/15）、四環(huán)素（12/15）、林可霉素（14/15）、多西環(huán)素（10/15）耐藥；部分菌株對多黏菌素 B（9/15）、呋喃唑酮（9/15）中度敏感；大部分菌株對丁胺卡那霉素（10/15）高度敏感。

3 討 論

大腸桿菌是一種條件致病菌， 它廣泛存在于飼料、墊料、空氣中，在動物機體抵抗力下降、冷熱應(yīng)激、 環(huán)境惡劣等情況下可誘發(fā)大腸桿菌病。 所有日齡的禽都可發(fā)病，尤其是雛禽更易發(fā)。禽大腸桿菌病在養(yǎng)殖場中廣泛存在， 容易造成家禽感染發(fā)病甚至死亡，使養(yǎng)殖場遭受經(jīng)濟損失[7]。

本試驗從福建省多個規(guī)模化養(yǎng)殖場分離到15 株禽源大腸桿菌。 通過革蘭氏染色結(jié)果為革蘭氏陰性菌； 在麥康凱瓊脂選擇培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)鑒別培養(yǎng)基上培養(yǎng)，結(jié)果均符合大腸桿菌的特性；生化試驗結(jié)果表明，所分離的15 株細(xì)菌均為大腸桿菌。 藥物敏感性試驗結(jié)果表明，大部分菌株對復(fù)方新諾明、頭孢菌素、四環(huán)素、林可霉素、多西環(huán)素耐藥；部分菌株對多黏菌素B 和呋喃唑酮中度敏感；大部分菌株對丁胺卡那霉素高度敏感。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，由于大量無規(guī)范地使用抗生素， 且大量的抗生素隨動物排泄物排到環(huán)境中，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性不斷加強[8]。 因此，養(yǎng)殖場應(yīng)加強對大腸桿菌耐藥性的監(jiān)測， 使用敏感藥物治療，避免盲目使用抗生素。

表1 分離菌株藥敏試驗結(jié)果