胎盤(pán)生長(zhǎng)因子在視網(wǎng)膜血管發(fā)育中的作用

劉燕妮 劉濤

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factorVEGF)又稱(chēng)為血管通透性因子(vascular permeability factor,VPF)，其主要生物功能為增加血管通透性和誘導(dǎo)血管生成。胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(placental growth factor,PlGF)是VEGF家族中的一員，PlGF在胚胎早期血管形成和病理?xiàng)l件下的血管生成尤為重要，而在正常生理過(guò)程中作用微乎其微[1]。研究表明PlGF協(xié)同VEGF在眼部發(fā)育和視網(wǎng)膜血管形成以及病理?xiàng)l件下新生血管的生成具有重要的調(diào)節(jié)作用[2]。

一、PlGF概述

1.PlGF基因定位、結(jié)構(gòu)及亞型 1991年Maglione[3]在胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)現(xiàn)PlGF表達(dá)，隨后人PlGF基因定位于14q24上，由跨度13.7 kb的7個(gè)外顯子構(gòu)成，不包括上下游調(diào)控序列。被選擇性mRNA剪接產(chǎn)生四種亞型：按分子大小排序分別為PlGF-1(PlGF 131)、PlGF-2(PlGF 152)、PlGF-3(PlGF 203)和PlGF-4(PlGF 224)，不同亞型在分泌特性和結(jié)合親和力方面不盡相同。PlGF-1和PlGF-3是非肝素結(jié)合，而PlGF-2和PlGF-4具有肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域[4]。

PlGF是一種糖基化同二聚體，結(jié)構(gòu)特征為每個(gè)單體由六個(gè)半胱氨酸殘基結(jié)合形成三個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵，生成一個(gè)胱氨酸結(jié)基序的三維結(jié)構(gòu)[5]。PlGF-1是分子量為46kDa的二聚蛋白，每個(gè)單體有131個(gè)氨基酸殘基，由兩個(gè)α螺旋和七個(gè)β折疊股組成，它們以反平行方式由兩個(gè)鏈間二硫鍵共價(jià)連接[5]，結(jié)構(gòu)和突變分析表明位于β3-β4環(huán)(Asp72和Glu73)中的兩個(gè)帶負(fù)電荷的殘基對(duì)受體結(jié)合至關(guān)重要[6]。VEGF與PlGF-1三維蛋白結(jié)構(gòu)相似，二者間有42%的氨基酸同源序列[7]，然而在氨基端和羧基端殘基上觀察到兩者之間差異，這種結(jié)構(gòu)上的差異也許可以解釋PlGF結(jié)合于與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-1(vascular Endothelial Growth Factor receptor-1，VEGFR-1)而不是VEGFR-2[8]；PlGF-2 有170個(gè)氨基酸殘基，在羧基末端區(qū)域插入的高堿性21個(gè)氨基酸使其與肝素結(jié)合的親和力增強(qiáng)，并能夠與共受體神經(jīng)纖毛蛋白-1和神經(jīng)纖毛蛋白-2(neuropilin，NP-1和NP-2)結(jié)合(7)；PlGF-3由72個(gè)氨基酸序列構(gòu)成，位于外顯子4和5之間；PlGF-4由與PlGF-3相同的序列外加一個(gè)肝素結(jié)合區(qū)組成，該結(jié)合區(qū)以前被認(rèn)為只存在于PlGF-2中[9]。

2.PlGF受體 1991年P(guān)ersico[9]發(fā)現(xiàn)并確定VEGF受體家族中VEGFR-1作為PlGF的受體。VEGF受體家族屬于蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK)，包括三種蛋白酪氨酸激酶受體：VEGFR-1(Flt 1)、VEGFR-2(Flk 1/KDR)和VEGFR-3(FLT 4)，除此之外有兩種共受體NP-1和NP-2[10]。人VEGFR-1由1338個(gè)氨基酸組成，可分為細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(758個(gè)氨基酸)、跨膜結(jié)構(gòu)域(22個(gè)氨基酸)、酪氨酸激酶(tyrosine kinase,TK)結(jié)構(gòu)域和羧基末端區(qū)域(558個(gè)氨基酸)[11]。胞外結(jié)構(gòu)域攜帶7個(gè)類(lèi)免疫球蛋白樣(Ig-like)結(jié)構(gòu)域，配體結(jié)合區(qū)域位于第2和第3結(jié)構(gòu)域[12]。胞外免疫球蛋白樣亞結(jié)構(gòu)域具有三種功能：(1)形成配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；(2)在配體結(jié)合后或與之伴隨的受體二聚化中起輔助作用；(3)在沒(méi)有配體的情況下維持受體的單體狀態(tài)[13]。神經(jīng)纖毛蛋白質(zhì)是跨膜糖蛋白，為信號(hào)蛋白/膠原家族成員的共受體，是神經(jīng)引導(dǎo)負(fù)性介質(zhì)[8]。VEGFR涉及蛋白酪氨酸激酶的胞內(nèi)信號(hào)通路是控制大多數(shù)細(xì)胞信號(hào)傳遞過(guò)程的關(guān)鍵。

3.PlGF/VEGFR1下游信號(hào)傳導(dǎo) 大量文獻(xiàn)報(bào)道在缺血缺氧的環(huán)境下刺激VEGF高表達(dá)，然而VEGF的表達(dá)與低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)密切相關(guān)。HIF-1α作為VEGF基因的轉(zhuǎn)錄因子，低氧環(huán)境下通過(guò)HIF-1α激活轉(zhuǎn)錄并增強(qiáng)VEGF的穩(wěn)定性，同時(shí)上調(diào)sVEGFR-1的表達(dá)，PlGF與sVEGFR-1結(jié)合可阻止PlGF與VEGFR-1結(jié)合，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖或遷移起抑制作用[14]。VEGFR的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域磷酸化后通過(guò)下游信號(hào)傳導(dǎo)通路產(chǎn)生細(xì)胞效應(yīng)。VEGFRs下游信號(hào)效應(yīng)的相互作用主要通過(guò)Src同源性2(src homologue 2，SH2)和磷酸化絡(luò)氨酸結(jié)合(phosphotyrosine-binging，PTB)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)[13]。SH2和PTB結(jié)構(gòu)域通過(guò)識(shí)別靶分子中的磷酸酪氨酸或特定氨基酸序列傳遞信息形成信號(hào)通路，從而產(chǎn)生調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞形狀和運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞存活等細(xì)胞效應(yīng)[15]。

磷酸化VEGFR與含有SH2結(jié)構(gòu)域的下游信號(hào)分子結(jié)合，通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)通路引起細(xì)胞效應(yīng)。例如與連接蛋白Grb2結(jié)合，Grb2是由單個(gè)SH2域構(gòu)成，SH2域兩側(cè)分別有兩個(gè)SH3域。Grb 2的N端SH3結(jié)構(gòu)域是Sos相互作用的主要位點(diǎn)，并與Sos(RAS的鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子)中富含脯氨酸的區(qū)域結(jié)合，介導(dǎo)的Grb2- Sos復(fù)合物與酪氨酸磷酸化受體或?qū)拥鞍捉Y(jié)合，誘導(dǎo)Sos接觸并活化Ras，從而導(dǎo)致Ras/MAPK(絲裂原激活蛋白激酶)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，控制細(xì)胞增殖和分化以響應(yīng)各種細(xì)胞外刺激[16]。Grb2的C端SH3結(jié)構(gòu)域可同時(shí)與連接蛋白Gab1中的富含脯氨酸的區(qū)域結(jié)合，因此Grb2也將其引入活化的受體絡(luò)氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)。Gab1酪氨酸磷酸化后，為磷酸肌醇3激酶(phosphoinpsitide 3-kinase,PI3K)的p85調(diào)控亞基的SH2結(jié)構(gòu)域生成額外的結(jié)合位點(diǎn)(在Gab1中)，將P85蛋白導(dǎo)入Gab 1，導(dǎo)致PI3K的激活和抗凋亡PI3K/Akt依賴(lài)的細(xì)胞存活通路的激活[17]。VEGFR1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Y1169、Y1213、Y1242、Y1327、Y1333)中的一些酪氨酸殘基已被鑒定為自磷酸化位點(diǎn)，其中Y1169的磷酸化允許磷脂酶C(phospholipase C，PLC)γ1通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)途徑結(jié)合和活化調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖[18]。PLCγ1通過(guò)SH2結(jié)構(gòu)域與磷酸化T細(xì)胞活化連接劑(linker for activation of T cell，LAT)結(jié)合，并通過(guò)其SH3結(jié)構(gòu)域與含76 kDa白細(xì)胞蛋白的Sh2結(jié)構(gòu)域(SH2-domain cintaining leukocyte protein of 76kDa，SLP76)中的富含脯氨酸區(qū)域相互作用，由LAT酪氨酸磷酸化形成的LAT-PLCγ1-SLP76膜連接復(fù)合物對(duì)由T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)介導(dǎo)的PLCγ1活化、細(xì)胞內(nèi)Ca+2釋放和MAPK的刺激是必要的[19]。PLCγ1水解磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(phosphatidylinositol-4,5 bosphosphate，PIP2)，生成肌醇1,4,5-三磷酸(inositol 1,4,5-trisphosphate，IP3)和二酰甘油(diacylglycerol，DAG)，分別激動(dòng)2個(gè)信號(hào)傳遞途徑 ，即IP3/Ca2+和DAG/蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)途徑 。IP3通過(guò)作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上特異的受體使其內(nèi)部、Ca2+釋放 ，引起胞內(nèi)Ca2+水平的增加 ，從而啟動(dòng)胞 內(nèi)Ca2+信號(hào)系統(tǒng) ，即通過(guò)依賴(lài)Ca2+、鈣結(jié)合蛋白的酶類(lèi)活性變化調(diào)節(jié)和控制一系列的生理過(guò)程。DAG和Ca2+協(xié)同激活PKC，以磷酸化的形式對(duì)許多蛋白質(zhì)和酶類(lèi)進(jìn)行修飾 ，從而調(diào)節(jié)和控制另外一系列的生理過(guò)程[20]。Ca2+活化內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase， eNOS) ，導(dǎo)致一過(guò)性NO的生成，NO可降低PKC-σ活性誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增生。VEGF家族與其受體通過(guò)多種通路之間的相互作用共同產(chǎn)生其生物學(xué)效應(yīng)，調(diào)控血管的形成及生成。

二、PlGF在血管發(fā)育中的作用

1.PlGF與胚胎發(fā)育 早在1996年Khaliq A等[21，22]研究證實(shí)胎盤(pán)組織中PlGF mRNA的表達(dá)，通過(guò)免疫組化顯示胎盤(pán)血管合胞膜和胎盤(pán)絨毛大血管中膜均有PlGF的存在，提示PlGF可作為在胎盤(pán)血管生成過(guò)程中作為血管形成的旁分泌介質(zhì)，也可能以自分泌的方式作用于滋養(yǎng)層細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。Ahmed等發(fā)現(xiàn)Flt-1蛋白表達(dá)于滋養(yǎng)層細(xì)胞[33]，F(xiàn)ong等也已經(jīng)證明Flt-1在胚胎血管形成過(guò)程中至關(guān)重要[34]，提示PlGF與Flt-1對(duì)血管生成的作用。

胎盤(pán)的正常發(fā)育和功能需要滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入母體蛻膜，隨后豐富的血管組織化生長(zhǎng)[24]，由于滋養(yǎng)層細(xì)胞在侵入母體蛻膜過(guò)程中取代了母體血管內(nèi)皮細(xì)胞，因此認(rèn)為滋養(yǎng)層細(xì)胞具有內(nèi)皮細(xì)胞樣特性[21]，同時(shí)表明PlGF在滋養(yǎng)細(xì)胞侵入母體蛻膜過(guò)程中起著重要作用[24]，提示PlGF可能直接或通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF與Flt-1的相互作用而介導(dǎo)血管發(fā)生[21]。研究表明與卵黃囊和胎盤(pán)相關(guān)的滋養(yǎng)層巨細(xì)胞是PlGF和VEGF的來(lái)源，且PlGF基因高表達(dá)，滋養(yǎng)層巨細(xì)胞分泌PlGF和VEGF可能是在胚胎發(fā)生早期啟動(dòng)和協(xié)調(diào)蛻膜與胎盤(pán)血管化的信號(hào)，為血管形成起誘導(dǎo)作用、引導(dǎo)血管生長(zhǎng)，從而在母胎之間建立有效的信號(hào)通路[25]。

2.PlGF與視網(wǎng)膜血管發(fā)育 低氧誘導(dǎo)VEGF的產(chǎn)生可能是在發(fā)育過(guò)程中促進(jìn)血管生成的動(dòng)力。視網(wǎng)膜血管的生長(zhǎng)以星形膠質(zhì)細(xì)胞為支架生成，隨著星形膠質(zhì)細(xì)胞與現(xiàn)有血管系統(tǒng)之間的距離增加而需氧量增加，處于相對(duì)的缺氧狀態(tài)，進(jìn)一步誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生VEGF促進(jìn)血管生成[26]。Susan A等通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察小鼠出生后視網(wǎng)膜的發(fā)育情況，使用定量PCR檢測(cè)到VEGF和PlGF的表達(dá)，觀察到視網(wǎng)膜血管在出生后(postnatal)第1天從視盤(pán)向外擴(kuò)展到視網(wǎng)膜周?chē)?；在P3和P5，大血管繼續(xù)向視網(wǎng)膜周?chē)由?，毛?xì)血管生長(zhǎng)開(kāi)始延伸至大血管之間的區(qū)域，而在P7到P9，表層毛細(xì)血管叢開(kāi)始形成；P9時(shí)，表層毛細(xì)血管網(wǎng)重塑，深層毛細(xì)血管密度增加；P11時(shí)，表層毛細(xì)血管叢形成完整，深層毛細(xì)血管網(wǎng)形成良好[27]。在視網(wǎng)膜淺表血管系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，PlGF在動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和生長(zhǎng)的毛細(xì)血管芽中表達(dá)最明顯。通過(guò)實(shí)驗(yàn)顯示PlGF和VEGF在血管形成的過(guò)程中起著共同作用，曾有報(bào)道PlGF和VEGF在血管形成方面有著協(xié)同作用，且在早期階段起著不同的作用，通過(guò)體外研究表明VEGF促使內(nèi)皮細(xì)胞增殖并形成管狀結(jié)構(gòu)，PlGF的主要是調(diào)節(jié)血管生長(zhǎng)和成熟[28，29]。為進(jìn)一步了解PlGF和VEGF間的作用關(guān)系，Cheung等通過(guò)評(píng)估PlGF基因缺失對(duì)正常視網(wǎng)膜血管發(fā)育的影響，在P6，PlGF敲除小鼠的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)顯示出較不完全的視網(wǎng)膜覆蓋，表明視網(wǎng)膜血管生長(zhǎng)速度降低，但與野生型胎鼠相比視網(wǎng)膜毛細(xì)血管密度增加。與此同時(shí)進(jìn)行了氧誘導(dǎo)缺血性視網(wǎng)膜病變(oxygen-induced ischemic retinopathy，OIR)小鼠模型的血管硬化和新生血管形成的實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)PlGF敲除小鼠在P12血管硬化減少和P17在病理的新血管形成減少[30]。這一實(shí)驗(yàn)表明PlGF與VEGF的協(xié)同作用不僅顯示在正常視網(wǎng)膜血管發(fā)育中，同時(shí)也表明在病理情況。研究表明在新生血管生成的疾病中PlGF對(duì)VEGF有協(xié)同作用，在增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)患眼的玻璃體和房水中檢測(cè)到PlGF與VEGF水平均升高，給予Conbercept治療(抗PlGF)后，二者水平均有下降[31，32，33]。在PlGF基因敲除研究中Hassan Akrami等采用實(shí)時(shí)PCR和ELISA法檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染后36h VEGF轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和蛋白分泌的變化，發(fā)現(xiàn)PlGF下降90%后，VEGF轉(zhuǎn)錄和蛋白量分別減少到73%和33%[32]，表明PlGF在病理性條件下對(duì)新生血管的形成有調(diào)節(jié)作用。PlGF與VEGF同時(shí)參與了糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制，關(guān)于對(duì)抗VEGF治療是否接受的活動(dòng)期PDR患者的玻璃體PlGF水平的比較研究表明，活動(dòng)性PDR抗VEGF治療后VEGF水平降低，而PlGF水平抗VEGF治療前后對(duì)比無(wú)顯著差異，且PlGF和VEGF水平存在顯著的相關(guān)性；非活動(dòng)性PDR中治療后PlGF水平明顯降低，表明PlGF在活動(dòng)性PDR中的病理作用，抗PlGF可能更有益于疾病的治療[2]。

抗VEGF治療是抗新生血管性疾病的主要方式，在眼部新生血管性疾病中檢測(cè)到VEGF濃度和PlGF濃度均升高，然而在臨床抗VEGF治療存在應(yīng)答不良和無(wú)應(yīng)答現(xiàn)象[33]，敲除PlGF基因研究表明了PlGF在對(duì)新生血管形成的重要作用，因此PlGF可能也是血管生成治療的新靶點(diǎn)。Huang等通過(guò)PlGF敲除小鼠實(shí)驗(yàn)提示PlGF缺失可保護(hù)視網(wǎng)膜免受糖尿病帶來(lái)的損傷，其保護(hù)機(jī)制可能與Akt激活與HIF-1α-VEGF通路抑制有關(guān)[34]，表明PlGF在糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生發(fā)展中有的重要作用。將PlGF作為血管生成治療的靶點(diǎn)，影響其與受體的結(jié)合，阻斷 VEGFR 下游信號(hào)通路，抑制新生血管生成和減少血管滲漏?？筕EGF治療藥物中，近幾年Conbercept(抗PlGF)多靶點(diǎn)抗VEGF機(jī)制廣受熱議，其結(jié)構(gòu)為VEGFR-1的免疫球蛋白樣區(qū)域2和VEGFR-2的免疫球蛋白樣區(qū)域3、4 融合到人IgG的 Fc段所組成的融合蛋白，通過(guò)抑制VEGFR2、PlGF和PI3K的表達(dá)，抑制SRC、AKT和ERK的活化，阻止視網(wǎng)膜內(nèi)屏障被破壞而減少視網(wǎng)膜血管滲漏[35]。通過(guò)對(duì)PlGF與VEGFR-1結(jié)合經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)通路產(chǎn)生的細(xì)胞效應(yīng)作為研究重點(diǎn)，了解PlGF/VEGFR-1在眼部血管發(fā)育中及病理?xiàng)l件下新生血管形成的機(jī)制，為治療視網(wǎng)膜新生血管性疾病發(fā)現(xiàn)作用靶點(diǎn)。

三、展望

本文回顧了VEGF家族成員PlGF關(guān)于眼部在正常發(fā)育和疾病中作用的相關(guān)文獻(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)在眼部新生血管性疾病中玻璃體和房水的VEGF和PlGF高表達(dá)，且PlGF對(duì)VEGF有著協(xié)同作用。在隨后研究中，關(guān)注抗VEGF治療的同時(shí)，更需要關(guān)注抗PlGF治療，以治療與異常血管化相關(guān)的眼部疾病。需要深入了解血管生成的分子機(jī)制和生理機(jī)制對(duì)藥物的未來(lái)發(fā)展具有重要意義，同時(shí)關(guān)于藥物應(yīng)答不良或應(yīng)答無(wú)效等問(wèn)題，還需要更多探索，對(duì)眼部病理性血管生成患者會(huì)有更好的治療效果。