紫荊皮提取物抗類風濕性關節(jié)炎作用的研究

胡 誠，賈益群

（上海中醫(yī)藥大學科技實驗中心，上海 201203）

類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis,RA）是一種以關節(jié)炎癥為主的慢性反復發(fā)作的全身性疾?。?-4］。我國傳統(tǒng)中醫(yī)學認為RA是以虛實兼雜為主要表現(xiàn)的虛損性疾病,根據(jù)臨床表現(xiàn)屬于中醫(yī)學“痹癥” 的范疇?！秲冉?jīng)》 中列出了關于痹癥的專論——《痹論》 《周痹》 中最早提出了風寒濕邪與機體外內相合致痹的觀點：“風寒濕三期雜至合而為痹也”；“所謂痹者,多以其時重感風寒濕之氣也”。這些理論與當代醫(yī)學對RA發(fā)病機制的認識頗為相符。目前治療RA的藥物如布洛芬、依托度酸、糖皮質激素長期服用具有毒性,表現(xiàn)為肝腎功能損害、高血壓、骨質疏松等。而中藥雷公藤［5-6］、青風藤、馬錢子、烏頭［7-8］等治療RA的中藥也均存在高毒性和免疫抑制作用。

紫荊皮具有活血行氣、清熱解毒、消腫止痛等功效,臨床用于治療風寒濕痹、婦女經(jīng)閉、血氣疼痛、癰腫、跌打損傷、蛇蟲咬傷等病癥。李時珍論紫荊皮活血消腫解毒之功：“紫荊氣寒味苦,色紫性降,入手足厥陰血分。寒勝熱,苦走骨,紫入營,故能活血消腫,利小便而解毒。楊清叟《仙傳方》 有沖和膏,以紫荊為君,蓋得此意也。”據(jù)文獻報道,紫荊皮煎劑灌注對二甲苯所致小鼠耳腫脹及角叉菜膠所致小鼠足腫脹均有顯著抑制作用,并能明顯抑制醋酸所致小鼠扭體次數(shù)［9-10］。因此,紫荊皮是一個潛在的、安全無毒的治療RA的藥物,并對其進行研究。大鼠佐劑型關節(jié)炎模型能夠在一定程度上模擬人RA的發(fā)病機制,具有許多相似特征,常用作研究RA的病理模型［11-13］。

1 材料

1.1 儀器 1290-6530液相串聯(lián)飛行時間質譜聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）；N-1001型旋轉蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；BSA 224S電子天平（德國賽多利斯科學儀器有限公司）；HHS型恒溫水浴鍋（上海博迅實業(yè)有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海精宏儀器有限公司）。

1.2 藥物與試劑 紫荊皮藥材（上海虹橋飲片廠）；乙腈（色譜純,美國Fisher公司）；超純水（美國Millipore公司）；甲酸（色譜級,Mreda technology公司）；吲哚美辛（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；二甲苯、0.6%醋酸溶液（國藥集團化學試劑有限公司）；完全弗氏佐劑（CFA）（美國Sigma公司）。

1.3 動物 ICR小鼠,體質量（20±2）g,雄性,100只；雄性Wistar大鼠,清潔級,體質量（150±20）g,上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心,動物生產合格證SCXK （滬）2018-0005,動物倫理編號為PZSHUTCM190315014。

2 方法

2.1 提取方法 取紫荊皮藥材10 kg,分別使用水、75%乙醇和95%乙醇回流提取2次,每次2 h,濾過,合并濾液,減壓回收溶劑,于真空恒溫干燥箱中80 ℃干燥3 h至恒重,計算浸膏得率。

2.2 提取物UPLC-Q-tof全掃圖譜 分別取出相當于1 g藥材的3種供試品浸膏：（1）水提浸膏0.143 g；（2）75%乙醇提取浸膏0.201 g；（3）95%乙醇提取浸膏0.181 g,使用10 mL甲醇定容,15 000 r/min離心10 min后取上清,進樣1 μL分析。分析條件為色譜柱C18Hypersil （100×2.1 mm,1.9 μm）；流動相0.05% 甲酸水溶液 （A）-0.05%甲酸乙腈溶液（B）,梯度洗脫（0～1 min,5% B；1～7 min,5%～50% B；7～15 min,50%～60% B；15～20 min,60%～70% B；20～25 min,70%～80% B；25～28 min,80%～95%B）；體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃。質譜條件為采用電噴霧電離離子源（ESI）,參數(shù)設置如下,毛細管電壓為3.0 kV （ES+）、2.9 kV （ES-）,m/z范圍為50～1 000；錐孔電壓40 kV；離子源溫度100 ℃；脫溶劑溫度450 ℃；脫溶劑氣體流速900 L/h；錐孔氣流量50 L/h；V模式檢測；甲酸鈉校正。通過MassLynx V4.1質譜工作站（Waters）采集數(shù)據(jù)和輸出數(shù)據(jù)。

2.3 小鼠急性抗炎藥效初篩 取ICR小鼠50只,隨機分為5組,每組10只。各組小鼠按5 g生藥/kg灌胃給藥,陽性藥給予吲哚美辛,10 mg/kg,連續(xù)3 d。末次給藥30 min后分別精密吸取均勻二甲苯涂布于各鼠右耳上、下兩面,劑量為20 μL,左耳不涂作對照。于涂耳30 min后,處死小鼠,沿耳廓基線剪下兩耳,采用6 mm直徑打孔器于左右耳對稱部位打下耳片,用精密電子天平稱取各鼠耳質量,并計算鼠耳腫脹率［腫脹率=（右耳質量-左耳質量）/左耳質量×100%］。

2.4 醋酸扭體法鎮(zhèn)痛活性研究 取小鼠50只,隨機分為5組,每組10只,按“2.3” 項中相同方式給藥連續(xù)3 d。末次給藥30 min后,每只小鼠腹腔注射0.6% 醋酸溶液0.2 mL,記錄小鼠30 min內扭體反應次數(shù)。

2.5 紫荊皮總提物抗類風濕關節(jié)炎研究

2.5.1 大鼠造模及給藥 將30只大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、甲氨蝶呤組、水提物組、75% 醇提物組,每組6只。大鼠適應性飼養(yǎng)1周后,在大鼠（正常組除外）右后足跖部皮內注射完全弗氏佐劑0.1 mL/每只致炎,并于第2天進行預防性灌胃給藥,紫荊皮提取物劑量均為5 g生藥/kg,陽性藥甲氨蝶呤（MTX）,以0.5%CMCNa水溶液配成混懸液,劑量為3 mg/kg,模型組、正常組給予等劑量蒸餾水。每日1次,給藥4周。

2.5.2 大鼠外觀評估及體質量變化 給藥后觀察大鼠皮毛光澤度和精神狀態(tài),于第1、7、14、21、28天測定大鼠體質量,做好記錄。

2.5.3 大鼠關節(jié)炎指數(shù)評分 從致炎后每隔3 d觀察并記錄各組大鼠后足關節(jié)及繼發(fā)病變程度,每3天1次。每只足爪的關節(jié)炎指數(shù)評分標準：0為正常,無腫脹；1為踝關節(jié)輕微腫脹并出現(xiàn)紅斑；2為踝關節(jié)到跖關節(jié)或掌關節(jié)輕微腫脹并出現(xiàn)紅斑；3為踝關節(jié)到跖趾關節(jié)或掌關節(jié)中度腫脹并出現(xiàn)紅斑；4為踝關節(jié)到趾關節(jié)重度腫脹并出現(xiàn)紅斑。每只大鼠最多評12分。

2.5.4 大鼠足腫脹度的觀察 用足容積測量儀測量每個大鼠左后足（非致炎側）容積；致炎后于14、21、28 d測量左后足容積,求出繼發(fā)側足爪腫脹度。

2.5.5 胸腺和脾臟指數(shù)測定 胸腺和脾臟作為機體重要的免疫器官,其指數(shù)在一定程度上能反映機體免疫功能的強弱。于給藥28 d后處死大鼠,取出器脾臟和胸腺,剔除脂肪和筋膜,擠盡血液,用濾紙吸干表面的液體并精密稱量,分別計算其占體質量的比例（mg/g）。

2.5.6 血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含有量檢測28 d后,取大鼠血漿靜置2 h后,3 000 r/min離心10 min分離血清,分別按TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10試劑盒方法檢測血清中上述指標含有量。

3 結果

3.1 紫荊皮提取物研究 結果發(fā)現(xiàn)使用水、75% 乙醇和95% 乙醇提取的浸膏得率分別為14.28%、20.12%、18.13%。質譜分析結果發(fā)現(xiàn)2種醇提方法得到的化學成分類似,且明顯多于水提組。正負離子模式下總離子流圖見圖1。

3.2 紫荊皮提取物抗炎藥效初篩 小鼠耳腫脹及醋酸扭體實驗結果見圖2,結果表明紫荊皮具有抗炎鎮(zhèn)痛效果（P＜0.01）,且醇提物效果均好于水提物組。

3.3 紫荊皮總提物抗類風濕關節(jié)炎評價

3.3.1 大鼠外觀評估 造模后大鼠精神萎靡、毛發(fā)暗淡、后足紅腫,行動受限,24 h后足爪明顯腫脹,12 d后模型組大鼠出現(xiàn)對側足爪發(fā)生繼發(fā)性病變,18 d后模型足大鼠普遍出現(xiàn)足爪紅腫。給藥組大鼠精神較好,進食正常,毛色有光澤,與正常組相似,原發(fā)性與繼發(fā)性足均有輕微的紅腫,其中以甲氨蝶呤組最輕,紫荊皮75%醇提物組次之。

3.3.2 大鼠體質量變化 造模后,大鼠體質量增長明顯下降,與正常組比較具有顯著性差異（P＜0.01）。給藥后3周開始,甲氨蝶呤、紫荊皮水提物和醇提物組體質量增長與模型組比較均有顯著性差異（P＜0.01）,但仍不及正常組。見圖3A。

3.3.3 炎癥指數(shù)評價 造模后,模型組炎癥指數(shù)隨病程延長而明顯增加,于第12天開始明顯高于正常組 （P＜0.01）；甲氨蝶呤、紫荊皮水提物和75% 醇提物組炎性指數(shù)增長較緩慢,與模型組比較均有顯著性差異（P＜0.01）,但仍不及正常組。見圖3B。

3.3.4 大鼠足腫脹程度 造模后大鼠足腫脹程度明顯上升,在第14、21、28天對大鼠足容積的測量中發(fā)現(xiàn),模型組大鼠足腫脹程度與正常組比較均有顯著性差異 （P＜0.01）；給藥組對大鼠足腫脹程度均有回調趨勢 （P＜0.01）,其中以甲氨蝶呤組效果最好,紫荊皮75% 醇提物組比水提物組效果好。見圖3C。

圖1 3種提取浸膏的正負模式總離子流圖

圖2 紫荊皮提取物抗炎鎮(zhèn)痛評價（n=8）

3.4 免疫器官指數(shù)評價 造模后大鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著性上升,與正常組比較有顯著性差異（P＜0.01）；甲氨蝶呤治療后給胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著性降低（P＜0.01）,而紫荊皮的水提物和醇提物組僅下調了脾臟指數(shù)（P＜0.01）,對胸腺指數(shù)下調不明顯（P＞0.05）。見圖4。

3.5 炎癥因子檢測 大鼠血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平見圖5。模型組中TNF-α、IL-1β、IL-6均顯著性升高,IL-10顯著性降低,與正常組比較均有差異（P＜0.01）。給藥后,甲氨蝶呤、紫荊皮水提物和75% 醇提物組均回調了模型組中升高的TNF-α、IL-1β、IL-6和降低的IL-10水平,且均具有顯著性差異（P＜0.05,P＜0.01）,其中以甲氨蝶呤效果最好。

4 討論

RA病因機制不明,無理想療法［2-3］。本研究發(fā)現(xiàn),紫荊皮提取物具有較好的抗炎鎮(zhèn)痛活性,能夠顯著抑制二甲苯引起的小鼠耳腫脹和醋酸導致的小鼠扭體反應。進一步以大鼠佐劑型關節(jié)炎為研究模型,發(fā)現(xiàn)其還具有抗AA的作用。根據(jù)紫荊皮提取物的浸膏得率測定和UPLC-Q-TOFMS指紋圖譜研究發(fā)現(xiàn),紫荊皮醇提物化學成分明顯多于水提物,這可能是其抗炎效果較好的原因。同時,紫荊皮醇提物對大鼠佐劑型關節(jié)炎模型的原發(fā)性和繼發(fā)性足病變有顯著抑制作用。此外,已有大量研究報道致炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和抑炎因子IL-10在類風濕性關節(jié)炎中具有重要作用［14-16］,傳統(tǒng)的類風濕關節(jié)炎治療藥物主要通過使用TNF-α、IL-1β、IL-6阻滯劑,干擾炎癥和破壞性反應的疾病進程,以防止長期殘疾［17-20］。本研究發(fā)現(xiàn)紫荊皮醇提物能有效地回調失衡的細胞炎癥因子,使其趨于正常水平。綜上所述,紫荊皮是一味有效且低毒的治療RA的潛在藥物,以期本研究結果為紫荊皮作為抗RA藥物的開發(fā)利用提供藥效藥理依據(jù),為其藥效物質基礎研究和作用機制的深入研究奠定基礎。

圖3 大鼠佐劑型關節(jié)炎評價（n=8）

圖4 免疫器官指數(shù)（n=8）

圖5 炎癥因子含有量檢測（n=8）