鴨跖草鎮(zhèn)痛活性部位篩選及作用機(jī)制研究

李祖成，王 月，趙 峰，王原超，楊 茗，李淑翠，王垣芳*

（1.濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東煙臺 264003；2.濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，“方劑效應(yīng)與臨床評價(jià)”國家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室，山東煙臺 264003；3.濱州醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，山東煙臺 264003）

疼痛是許多疾病的常見癥狀,也是機(jī)體在受到傷害性刺激或損傷時(shí)產(chǎn)生的一種保護(hù)性的病理反應(yīng)。劇烈的疼痛不僅給患者造成痛苦,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致生理功能紊亂,甚至引起休克。目前臨床應(yīng)用的鎮(zhèn)痛藥主要包括非甾體類抗炎藥和阿片類藥物,非甾體類抗炎藥主要適用于治療輕、中度的慢性疼痛,但長期應(yīng)用消化道不良反應(yīng)發(fā)生率較高,有些新型的非甾體類抗炎藥物甚至可引起嚴(yán)重的皮膚反應(yīng)和急性心血管不良事件；阿片類鎮(zhèn)痛藥鎮(zhèn)痛活性強(qiáng),但因易導(dǎo)致依賴性、成癮性,其臨床應(yīng)用受到嚴(yán)格限制,主要用于治療急性劇烈疼痛和晚期癌癥疼痛。因此,尋找和研發(fā)毒副作用小的鎮(zhèn)痛藥是多年來醫(yī)藥界關(guān)注的重要課題,從傳統(tǒng)中藥中尋找鎮(zhèn)痛活性成分也成為近年來的熱點(diǎn)之一。

中藥鴨跖草為鴨跖草科植物鴨跖草 （Commelina communisL.）的全草,其性寒,味甘、淡,具有清熱解毒、利水消腫之功效,用于治療跌打損傷、筋骨疼痛、小便淋漓作痛、風(fēng)熱感冒、高熱不退、咽喉腫痛、癰腫疔毒等病癥［1-2］。研究發(fā)現(xiàn),鴨跖草中含有黃酮類、生物堿類、萜類、甾醇類等多種化合物［3-4］。但是對于鴨跖草鎮(zhèn)痛作用有效部位及鎮(zhèn)痛作用機(jī)制研究尚未見報(bào)道。本研究采用輻射熱刺激甩尾法、醋酸扭體法觀察鴨跖草不同提取部位對小鼠的鎮(zhèn)痛作用,以探究其鎮(zhèn)痛活性部位,并通過阿片受體阻斷試驗(yàn)和檢測疼痛部位組織中的炎癥因子探討其鎮(zhèn)痛作用機(jī)制,旨在為鴨跖草的進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級昆明種小鼠,雌雄各半,體質(zhì)量（20±2）g,購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號 SCXK （魯）20140007,動(dòng)物合格證號37009200012102。動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d,實(shí)驗(yàn)藥前及實(shí)驗(yàn)過程中均全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng),自由飲水,晝夜明暗交替時(shí)間12 h/12 h,實(shí)驗(yàn)室溫度為25 ℃,相對濕度為40%。

1.1.2 藥物與試劑 鴨跖草（安徽易元堂中藥飲片科技有限公司,批號20150410）；阿司匹林腸溶片（每片100 mg,石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司,批號286160208）；鹽酸曲馬多緩釋片（每片100 mg,萌蒂［中國］制藥有限公司,批號10100706,成人單劑量50～100 mg）；鹽酸納洛酮注射液（規(guī)格2 mL ∶2 mg,批號20150906,成都苑東藥業(yè)有限公司）。小鼠組織前列腺E2（PGE2）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（批號20160530）、小鼠組織腫瘤壞死因子-α （TNF-α）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（批號20160530）和小鼠組織白介素-6（IL-6）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（批號20160530）,均購自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 儀器 SW-200光熱尾痛測試儀（成都泰盟科技有限公司）；BIO-RAD iMark酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD公司）；UV-1901臺式高速微量離心機(jī)（北京科普順科技有限公司）；AN1574電子分析天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；KQ-400數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法

2.1 鴨跖草不同提取部位的制備 稱取鴨跖草4.5 kg,粉碎制成粗粉,浸泡2 h,以70%乙醇進(jìn)行回流提取1 h,連續(xù)3次,將3次的提取液合并,回收溶劑,減壓濃縮直至無醇味,干燥后得鴨跖草浸膏49.85 g。將浸膏按硅膠與浸膏3 ∶1的比例混合攪勻,然后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水進(jìn)行萃取,減壓,干燥,直至無溶劑殘留,得到石油醚提取部位（27.16 g）、乙酸乙酯提取部位（2.67 g）、正丁醇提取部位（7.28 g）和水溶部位（30 g）,計(jì)算各提取部位與生藥的比值,臨用前用蒸餾水配制成適當(dāng)質(zhì)量體積濃度的混懸液,置于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 鴨跖草不同部位的鎮(zhèn)痛作用

2.2.1 輻射熱刺激甩尾法測定痛閾值［5］昆明種小鼠140只,雌雄各半,體質(zhì)量（20±2）g,按性別分籠,每籠10只,自由采食飲水。小鼠在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)7 d后,隨機(jī)分為14組,即生理鹽水組,鹽酸曲馬多組（0.013 g/kg）,鴨跖草石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水溶部位高、中、低劑量組 （30、15、7.5 g生藥量/kg）,給各鼠按0.1 mL/10 g灌胃,每天1次,連續(xù)7 d。

灌胃給藥前,將小鼠置入固定筒內(nèi),尾部暴露于外,實(shí)驗(yàn)前先用75%酒精擦凈尾部,在尾部中下1/3處做標(biāo)記作為光輻射刺激點(diǎn),然后將尾部標(biāo)記對準(zhǔn)光熱尾痛測試儀的光輻射孔,待小鼠安靜后測定甩尾潛伏期（光強(qiáng)75%）3次,每次間隔5 min,取3次的平均值作為基礎(chǔ)痛閾值。末次給藥后1 h,測試各小鼠給藥后的痛閾值。

2.2.2 醋酸扭體法測定痛閾值［5-6］昆明種小鼠140只,雌雄各半,體質(zhì)量（20±2）g,按性別分籠,每籠10只,自由采食飲水。小鼠在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)7 d后,隨機(jī)分為14組,即生理鹽水組,阿司匹林組（0.5 g/kg）,鴨跖草石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水溶部位高、中、低劑量組（30、15、7.5 g生藥量/kg）,給各鼠按0.1 mL/10 g灌胃,每天1次,連續(xù)7 d。末次給藥后1 h,給各鼠腹腔注射0.6%醋酸0.4 mL,觀察并記錄各鼠扭體反應(yīng)的潛伏期和15 min內(nèi)扭體反應(yīng)的次數(shù)。

2.3 鴨跖草鎮(zhèn)痛有效部位的作用機(jī)制

2.3.1 阿片受體阻斷試驗(yàn) 經(jīng)過上述實(shí)驗(yàn)即可篩選出鴨跖草的鎮(zhèn)痛活性部位為水溶部位。昆明種雌性小鼠,體重（22±2）g,采用熱板法［5］（55±1）℃篩選痛閾值相近的小鼠30只,隨機(jī)分為3組,即1組（生理鹽水/納洛酮組）、2組（鴨跖草水溶部位/生理鹽水組）、3組（鴨跖草水溶部位/納洛酮組）,每組10只。2、3組分別灌服鴨跖草水溶部位（相當(dāng)于生藥30 g/kg）,1組灌服等量的生理鹽水,每天1次,連續(xù)7 d,末次給藥45 min后進(jìn)行如下處理。

鴨跖草水溶部位/生理鹽水組：腹腔注射生理鹽水0.1 mL/10 g進(jìn)行預(yù)處理,15 min后再次灌服鴨跖草水溶部位；鴨跖草水溶部位/納洛酮組：用納洛酮0.1 mL/10 g（5 mg/kg）腹腔注射進(jìn)行預(yù)處理,15 min后再次灌服鴨跖草水溶部位；生理鹽水/納洛酮組：腹腔注射生理鹽水進(jìn)行預(yù)處理,15 min后注射納洛酮（劑量同前）；末次給藥1 h后再次進(jìn)行熱板試驗(yàn),記錄舔后足潛伏期作為痛閾值（超過60 s者均按60 s計(jì)算）。

2.3.2 福爾馬林致痛試驗(yàn)局部組織中炎癥因子含有量測定

昆明種雌性小鼠,體質(zhì)量（22±+2）g,隨機(jī)分為6組,即生理鹽水組,阿司匹林組（500 mg/kg）,鹽酸曲馬多組（0.013 g/kg）,鴨跖草水溶部位高、中、低劑量組（30、15、7.5 g生藥量/kg）,每組10只,連續(xù)灌胃給藥7 d。末次給藥1 h后,于小鼠右足底皮下注射5%福爾馬林25 μL,然后放置于懸掛的1 000 mL燒杯內(nèi),觀察第一時(shí)相（0～10 min）和第二時(shí)相（15～30 min）舔咬右后足次數(shù)［5,7］。福爾馬林試驗(yàn)結(jié)束后6 h,將小鼠頸椎脫臼處死,剪取腫脹右足底組織并稱定質(zhì)量,按質(zhì)量容積比1 ∶9 （1 g ∶9 mL）的比例加生理鹽水,研磨成勻漿,于4 ℃、3 000 r/min離心10 min,取上清液,ELISA測定PGE2、TNF-α 和IL-6含有量。

3 結(jié)果

3.1 鴨跖草不同部位的鎮(zhèn)痛作用

3.1.1 鴨跖草提取部位對小鼠輻射熱刺激痛反應(yīng)的影響各給藥組的給藥前痛閾值（輻射熱刺激甩尾潛伏期）與生理鹽水組比較無顯著性差異（P＞0.05）。與生理鹽水組比較,阿司匹林組小鼠給藥后痛閾值明顯增大（P＜0.01）；與自身給藥前及生理鹽水組比較,鴨跖草石油醚提取部位高劑量組（30 g/kg）和水溶部位高、中、低劑量組（30、15、7.5 g/kg）痛閾值有不同程度增大 （P＜0.05,P＜0.01）,尤以水溶部位高、中劑量組最為顯著（P＜0.01）。見表1。

3.1.2 鴨跖草不同提取部位對小鼠醋酸扭體反應(yīng)的影響與生理鹽水組比較,阿司匹林組小鼠扭體次數(shù)減少、扭體反應(yīng)潛伏期延長（P＜0.01）；鴨跖草石水溶部位高、中、低劑量組小鼠扭體次數(shù)減少,扭體反應(yīng)潛伏期延長（P＜0.05,P＜0.01）,其中水溶部位高、中劑量組扭體次數(shù)顯著減少,扭體反應(yīng)潛伏期顯著延長（P＜0.01）,見表2。

3.2 鴨跖草鎮(zhèn)痛有效部位的作用機(jī)制

3.2.1 納洛酮對鴨跖草水溶部位鎮(zhèn)痛作用的影響 鴨跖草水溶部位/生理鹽水組小鼠給藥后的痛閾值增大,即舔足潛伏期延長,與自身給藥前基礎(chǔ)痛閾值比較有顯著性差異（P＜0.01）；與生理鹽水/納洛酮組比較有顯著性差異（P＜0.05）；與鴨跖草水溶部位/生理鹽水組比較,鴨跖草水溶部位/納洛酮組小鼠舔足潛伏期縮短（P＜0.05）；與自身給藥前基礎(chǔ)痛閾值比較,鴨跖草水溶部位/納洛酮組小鼠舔足潛伏期延長（P＜0.05）。見表3。

表1 鴨跖草不同提取部位對小鼠輻射熱刺激痛反應(yīng)的影響（， n=10）

表1 鴨跖草不同提取部位對小鼠輻射熱刺激痛反應(yīng)的影響（， n=10）

注：與生理鹽水組比較,*P＜0.05,**P＜0.01；與自身給藥前比較,△P＜0.05,△△P＜0.01。

表2 鴨跖草不同提取部位對小鼠醋酸扭體反應(yīng)的影響（， n=10）

表2 鴨跖草不同提取部位對小鼠醋酸扭體反應(yīng)的影響（， n=10）

注：與生理鹽水組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

表3 納洛酮對鴨跖草水溶部位鎮(zhèn)痛作用的影響（，n=10）

表3 納洛酮對鴨跖草水溶部位鎮(zhèn)痛作用的影響（，n=10）

注：與生理鹽水/納洛酮/組比較,*P＜0.05；與鴨跖草水溶部位/生理鹽水組比較,△P＜0.05；與自身給藥前基礎(chǔ)痛閾值比較,#P＜0.05,##P＜0.01。

3.2.2 鴨跖草水溶部位對小鼠福爾馬林致痛的影響 與生理鹽水組比較,阿司匹林組小鼠在第一時(shí)相（0～10 min）舔咬右后足次數(shù)無明顯減少 （P＞0.05）,在第二時(shí)相（15～30 min）舔咬右后足次數(shù)減少（P＜0.01）；鹽酸曲馬多組小鼠在第一相和第二相舔咬右后足次數(shù)均減少（P＜0.01）；鴨跖草水溶部位各劑量組小鼠在第一時(shí)相和第二時(shí)相舔咬右后足次數(shù)均減少（P＜0.01,P＜0.05）,且呈劑量依賴性。見表4。

表4 鴨跖草水溶部位對小鼠福爾馬林致痛的影響（，n=10）

表4 鴨跖草水溶部位對小鼠福爾馬林致痛的影響（，n=10）

注：與生理鹽水組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

3.2.3 鴨跖草水溶部位對炎癥因子的影響 與生理鹽水組比較,阿司匹林組小鼠右足底局部組織PGE2、TNF-α 和IL-6含有量降低（P＜0.05,P＜0.01）；鴨跖草水溶部位高、中劑量組小鼠右足底局部組織PGE2、TNF-α 和IL-6含有量降低（P＜0.05,P＜0.01）,其中以高劑量組的含有量降低最明顯（P＜0.01）,見表5。

表5 鴨跖草水溶部位對炎癥因子的影響（， n=10）

表5 鴨跖草水溶部位對炎癥因子的影響（， n=10）

注：與生理鹽水組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

4 討論

疼痛是機(jī)體受到傷害性刺激和發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)所伴隨的癥狀,一般分為急性傷害性疼痛、炎癥性疼痛和神經(jīng)病理性疼痛［8］。一定強(qiáng)度的熱刺激引起的疼痛為急性傷害性疼痛［6］。小鼠尾部對熱刺激特別敏感,當(dāng)受到一定強(qiáng)度的熱刺激時(shí),痛覺信號傳導(dǎo)至神經(jīng)中樞,再反饋到運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)即可出現(xiàn)甩尾的保護(hù)性反應(yīng),因此熱刺激時(shí)小鼠出現(xiàn)甩尾的潛伏期可反映痛閾值［5］。醋酸扭體法是通過給小鼠腹腔注射一定容積和濃度的醋酸,刺激腹膜引起炎性疼痛,從而出現(xiàn)扭體反應(yīng),該反應(yīng)在注射15 min內(nèi)出現(xiàn)頻率最高,故以注射15 min內(nèi)發(fā)生扭體反應(yīng)的次數(shù)或發(fā)生反應(yīng)的潛伏期作為疼痛指標(biāo)［5,9］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,鴨跖草水溶部位可明顯提高小鼠熱刺激痛閾值,減少小鼠醋酸致痛的扭體反應(yīng)次數(shù)；石油醚提取部位高劑量具有一定的提高痛閾值作用,而石油醚提取部位中、低劑量和乙酸乙酯提取部位、正丁醇提取部位各劑量均無明顯作用,提示鴨跖草的水溶性部位為鴨跖草的鎮(zhèn)痛活性部位。

福爾馬林致痛試驗(yàn)是目前國際公認(rèn)的用于研究藥物鎮(zhèn)痛作用的常用方法［10］,適用于篩選鎮(zhèn)痛作用較弱的藥物,其致痛刺激較為持久,且疼痛反應(yīng)的兩個(gè)時(shí)相分別代表不同性質(zhì)的疼痛。第一時(shí)相（0～10 min）反應(yīng)為福爾馬林直接刺激傷害性感受器,引起C纖維興奮而出現(xiàn)急性傷害性疼痛,其特點(diǎn)為短暫的急痛反應(yīng),表現(xiàn)為舔足、縮足或抬足反射等行為反應(yīng)；第二時(shí)相（15～30 min）反應(yīng)則是由于第一階段引起的中樞敏化和外周炎癥共同參與所致［10-12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,鴨跖草水溶部位對小鼠福爾馬林致痛試驗(yàn)的第一時(shí)相和第二時(shí)相反應(yīng)均有抑制作用,提示鴨跖草水溶部位對傷害性刺激引起的急性傷害性疼痛和炎癥反應(yīng)引起的炎性疼痛均有抑制作用。

TNF-α、IL-6、PGE2是重要的致炎因子。組織損傷時(shí),受損的組織細(xì)胞和免疫細(xì)胞可釋放TNF-α、IL-6和PGE2等炎癥介質(zhì),引起炎癥反應(yīng)和疼痛［13-15］；PGE2還可直接刺激痛覺感受器引起疼痛［6］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,給小鼠足底注射福爾馬林可引起局部組織中PGE2、TNF-α 和IL-6釋放增加,表明注射部位發(fā)生了炎癥反應(yīng)；鴨跖草水溶部位能使局部組織PGE2、TNF-α 和IL-6含有量降低,且呈劑量相關(guān)性,提示鴨跖草水溶部位具有抑制炎癥反應(yīng)和減輕炎性疼痛的作用。

阿片受體是內(nèi)源性阿片肽和阿片類藥物產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用的重要靶點(diǎn)。納洛酮為阿片受體拮抗劑,可競爭性拮抗阿片肽和阿片類藥物的鎮(zhèn)痛作用［16-17］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,納洛酮能使鴨跖草水溶部位的鎮(zhèn)痛作用有所減弱,提示鴨跖草水溶部位的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制可能部分與激動(dòng)阿片受體有關(guān)。

本研究結(jié)果提示,鴨跖草的水溶部位為鴨跖草的鎮(zhèn)痛活性部位,對于傷害性疼痛的鎮(zhèn)痛作用可能與阿片受體有關(guān)；對于炎癥性疼痛的鎮(zhèn)痛作用可能與減少前列腺素等致炎因子有關(guān)。