HPLC法評(píng)估補(bǔ)腎強(qiáng)身膠囊中酒女貞子的質(zhì)量

張鵬程，張崇生，倪 贊

（溫州市食品藥品檢驗(yàn)科學(xué)研究院，浙江溫州 325008）

補(bǔ)腎強(qiáng)身膠囊由淫羊藿、金櫻子、菟絲子、酒女貞子和燙狗脊5味藥材組方而成,主治腰酸足軟、頭暈耳鳴、眼花心悸、陽痿遺精等癥狀［1］。酒女貞子為方中臣藥,其制法為取凈女貞子,照酒燉法或酒蒸法（通則0213）燉至酒吸盡或蒸透［2］。女貞子酒制后涼滑之性緩和,滋補(bǔ)肝腎作用增強(qiáng)［3-4］。較多文獻(xiàn)研究表明女貞子炮制后環(huán)烯醚萜苷類成分如特女貞苷含有量降低,紅景天苷含有量升高［5-8］。

補(bǔ)腎強(qiáng)身膠囊現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)有衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第四冊標(biāo)準(zhǔn)和多個(gè)企業(yè)注冊標(biāo)準(zhǔn),這些標(biāo)準(zhǔn)過于簡單,無法有效控制內(nèi)在質(zhì)量。2015年版《中國藥典》 標(biāo)準(zhǔn)除性狀外無法有效區(qū)分生品女貞子和炮制品,制成中成藥后更無法評(píng)估藥材質(zhì)量。紀(jì)鑫等［8］研究發(fā)現(xiàn)合格酒女貞子中特女貞苷與紅景天苷比值（比值）不大于8；趙淑淑等［9］通過建立薄層色譜和特女貞苷含有量測定方法完善和提高酒女貞子配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；范妙璇等［10］通過HPLC測定二至丸中的特女貞苷、紅景天苷和酪醇的含有量,綜合評(píng)價(jià)其質(zhì)量。然而這些研究均未涉及中成藥中酒女貞子炮制相關(guān)的指標(biāo)。

因此,本實(shí)驗(yàn)建立HPLC法測定補(bǔ)腎強(qiáng)身膠囊中紅景天苷和特女貞苷的含有量,通過兩者含有量比值分析酒女貞子的炮制程度,以此評(píng)估10個(gè)生產(chǎn)企業(yè)29批樣品中酒女貞子的質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器 Shimadzu LC-20AD高效液相色譜（日本島津公司）；XS205DU分析天平（十萬分之一,瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；SB-5200D超聲波清洗器（寧波生物科技股份有限公司）；TGL-16C高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Milli-Q Integal 5超純水器 （德國Millipore公司）；美的WH2237電磁爐（美的集團(tuán)股份有限公司）；不銹鋼多層蒸鍋（君匯商用廚具直銷店）。

1.2 試劑與藥物 對照品紅景天苷 （批號(hào)110818-201708）、特女貞苷（批號(hào)111926-201605）均購于中國食品藥品檢定研究院。原藥材購于浙江華宇藥業(yè)股份有限公司,經(jīng)溫州市食品藥品檢驗(yàn)科學(xué)研究院謝秉湘副主任中藥師鑒定均為對應(yīng)藥材正品。29批補(bǔ)腎強(qiáng)身膠囊均來自2019年浙江省藥品質(zhì)量考核抽檢樣品。乙醇為分析純；乙腈為色譜純；黃酒酒精度為14.5%。

2 方法與結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎強(qiáng)身膠囊與酒女貞子制備 按衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第四冊處方比例制備9批補(bǔ)腎強(qiáng)身膠囊樣品,按處方比例除去酒女貞子制備1批酒女貞子陰性樣品。參照2015年版《中國藥典》女貞子項(xiàng)下酒女貞子制備中的酒蒸法和文獻(xiàn)［8］制備酒女貞子。分別取3批女貞子飲片各400 g,加入100 g黃酒悶潤15 h,分裝至平皿中,每份50 g,放入蒸鍋,電磁爐上蒸制,待蒸鍋中蒸氣飽滿后開始計(jì)時(shí),分別于蒸制3、6、9、12、15、18、21、24 h時(shí)各取一份樣品,晾干24 h后,60 ℃干燥5 h,作為實(shí)驗(yàn)室自制的不同炮制時(shí)間的酒女貞子樣品。

2.2 混合對照品溶液制備 取紅景天苷對照品約12.5 mg,精密稱定,加甲醇定容至25 mL,作為紅景天苷對照品貯備液。取特女貞苷對照品約12.5 mg,精密稱定,精密加入紅景天苷對照品貯備液5 mL,甲醇定容至25 mL,混勻,即得。

2.3 供試品溶液制備 取補(bǔ)腎強(qiáng)身膠囊10粒,傾出內(nèi)容物,研細(xì)混勻,稱取約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%乙醇50 mL,稱定質(zhì)量,超聲（250 W,40 kHz）處理30 min,放冷至室溫,用50% 乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,離心取上清,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得。取酒女貞子粉末 （過5號(hào)篩）,稱取約0.25 g,精密稱定,按“2.2” 項(xiàng)下方法制備。

2.4 色譜條件 采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm,5 μm）,流動(dòng)相乙腈（A）-水（B）,梯度洗脫（0～10 min,5%A～15%A；10～30 min,15%A～25%A；30～35 min,25%A～50%A；35～45 min,50%A～5%A）；體積流量1.0 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長224 nm；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 mL置10 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,制成不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液,在“2.4” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣,記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）,峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸,得紅景天苷、特女貞苷的回歸方程分別為Y=1.354×107X+4 479.98（r=0.999 8）；Y=1.356 5×107X+29 081.9 （r=0.999 9）。結(jié)果表明紅景天苷、特女貞苷分別在 2.956～118.2、12.46～498.2 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對照品溶液10 μL,在“2.4” 項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6次,測得紅景天苷、特女貞苷峰面積RSD均為0.1%,表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品,按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.4” 項(xiàng)條件下,分別于0、3、6、9、12 h進(jìn)樣,測得紅景天苷、特女貞苷的RSD分別為0.3%、0.4%,表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 專屬性試驗(yàn) 取酒女貞子陰性樣品,按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.4” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣,在與對照品色譜峰相應(yīng)的位置上,無干擾色譜峰出現(xiàn),表明專屬性好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取供試品6份,按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.4” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣,測得紅景天苷、特女貞苷含有量分別為0.299、14.871 mg/g,RSD分別為1.2%、0.6%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含有量的供試品約0.25 g,共6份,分別精密加入5 mL混合對照溶液,按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.4” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣,依法測定紅景天苷、特女貞苷含有量,計(jì)算回收率,結(jié)果見表1。

表1 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of recovery tests for various constituents （n=6）

2.11 樣品含有量測定 取實(shí)驗(yàn)室不同炮制時(shí)間的酒女貞子樣品,按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.4” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣,依法測定紅景天苷、特女貞苷的峰面積,采用外標(biāo)法計(jì)算含有量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著炮制時(shí)間的延長（0～21 h）,實(shí)驗(yàn)室炮制的酒女貞子樣品中紅景天苷含有量逐漸升高,特女貞苷含有量逐漸降低,21 h后兩者均降低；比值逐漸變小,見表2。

表2 炮制過程中酒女貞子成分變化（n=2）Tab.2 Constituent changes of Ligustri Lucidi Fructusduring processing （n=2）

取實(shí)驗(yàn)室制備的9批補(bǔ)腎強(qiáng)身膠囊樣品和對應(yīng)的酒女貞子藥材,按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.4” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣,依法測定紅景天苷、特女貞苷的峰面積,采用外標(biāo)法計(jì)算含有量。結(jié)果表明,按照補(bǔ)腎強(qiáng)身膠囊處方計(jì)算,9批酒女貞子的特女貞苷平均轉(zhuǎn)移率為93.29%,RSD為4.88%。

取29批抽檢樣品,按“2.3” 項(xiàng)下方法處理,依法測定紅景天苷、特女貞苷的峰面積,采用外標(biāo)法計(jì)算其含有量,結(jié)果見表3。

表3 各成分含有量測定結(jié)果（n=2）Tab.3 Results of content determination of various constituents （n=2）

3 討論

3.1 提取溶劑選擇 參照相關(guān)文獻(xiàn)［8,11-12］,分別考察了不同體積分?jǐn)?shù)甲醇、乙醇溶液的提取效果,結(jié)果表明50%乙醇效果最佳。

3.2 含有量測定限度 29批樣品中特女貞苷含有量范圍為0.60～3.62 mg/粒。根據(jù)2015年版《中國藥典》 的規(guī)定,以9批實(shí)驗(yàn)室制備樣品的平均轉(zhuǎn)移率為轉(zhuǎn)移率,暫定特女貞苷含有量為每粒不得少于0.65 mg,29批樣品中僅有1批未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn),表明各企業(yè)對特女貞苷含有量控制較好。

3.3 酒女貞子炮制程度分析 3批實(shí)驗(yàn)室炮制女貞子的研究表明,1#和3#女貞子炮制9 h,2#炮制6 h后性狀符合法定標(biāo)準(zhǔn),與文獻(xiàn)［8］的結(jié)果不一致,可能是黃酒用量、蒸氣壓力等因素的差異所致。將酒女貞子和對應(yīng)樣品的比值進(jìn)行配對樣本t檢驗(yàn),表明95% 置信區(qū)間內(nèi)兩者無顯著差異,樣品中的比值可反映原料的炮制程度。參照文獻(xiàn)［8］,暫定樣品比值不大于8,29批樣品中有15批大于8,且企業(yè)A、F不同批次差異較大,表明各企業(yè)存在較大的酒女貞子炮制不足的風(fēng)險(xiǎn)。

3.4 企業(yè)調(diào)研 調(diào)研結(jié)果表明：企業(yè)A 1～4號(hào)樣品女貞子炮制時(shí)用酒量大于其他批,故比值遠(yuǎn)小于其他批；企業(yè)C、D炮制時(shí)酒蒸分別3、4～6 h,比值小于8,炮制效果較好；企業(yè)I炮制時(shí)酒蒸僅為10～15 min,比值大于8,炮制效果不佳；其余企業(yè)均直接采購酒女貞子藥材,其法定標(biāo)準(zhǔn)與女貞子相差無幾,故市場上原料炮制程度千差萬別。因此,建議在補(bǔ)腎強(qiáng)身膠囊標(biāo)準(zhǔn)中新增比值用于評(píng)估女貞子炮制程度的指標(biāo),敦促各企業(yè)制定科學(xué)規(guī)范的炮制工藝,有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。