HPLC法同時(shí)測(cè)定椒香溫中止痛軟膏中8種成分

李雙雙李 希 鄧 謙施崇精馮建安黃 嫣王 玉

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川成都 611137；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)研究所，四川成都 610031）

椒香溫中止痛軟膏由延胡索、肉桂、白芍、夏枯草等藥材加工制成,具有溫中散寒、行氣止痛的功效,臨床上主要用于治療脾胃虛寒引起的脘腹冷痛。方中延胡索性味辛、苦、溫,具有活血、利氣、止痛的功效,主要成分為生物堿,包括延胡索乙素、延胡索甲素、脫氫紫堇堿等［1-3］；白芍具有緩急止痛的功效,主要成分為芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、沒食子酸等,有著抗炎、抗腫瘤、抑菌等藥理作用［4-6］；肉桂性味辛、甘、大熱,具有散寒止痛、溫通經(jīng)脈的功效,主要成分為揮發(fā)油,以桂皮醛含有量最高,約為84%,具有解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、擴(kuò)張血管等藥理作用［7-9］；夏枯草性味辛、苦、寒,可反佐以制肉桂等之過熱,主要成分為迷迭香酸,具有抗氧化、抗炎等藥理作用［10-11］。該制劑臨床應(yīng)用多年,療效顯著,但其藥味多樣,僅檢測(cè)單一成分難以全面反映其整體療效,目前也尚無完善的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。

因此,本實(shí)驗(yàn)在查閱相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上,建立HPLC法同時(shí)測(cè)定椒香溫中止痛軟膏中沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、延胡索乙素、延胡索甲素、迷迭香酸、脫氫紫堇堿、桂皮醛的含有量,以期為該制劑的質(zhì)量控制及藥效研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 DZTW型調(diào)溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司；Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀 （美國 Agilent Technologies公司）；電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；BT-125D型電子天平［十萬分之一,賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］。

1.2 試劑與藥物 脫氫紫堇堿（批號(hào)20040208,純度98%）、延胡索甲素（批號(hào)20032606,純度98%）、芍藥內(nèi)酯苷（批號(hào)20040106,純度98%）對(duì)照品均購自成都市卓譜儀器有限公司；沒食子酸（批號(hào)110831-200803,純度90.10%）、桂皮醛（批號(hào)110710-201821,純度99.60%）、芍藥苷（批號(hào)110736-201943,純度98%）、延胡索乙素（批號(hào)110726-201819,純度99.8%）、迷迭香酸（批號(hào)11871-201706,純度90.5%）對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院。椒香溫中止痛軟膏（批號(hào)20200401、20200402、20200403）由四川省第二中醫(yī)醫(yī)院制劑室生產(chǎn)。甲醇、磷酸為色譜純（美國Tedia公司）；其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流動(dòng)相甲醇（A）-0.1%磷酸 （B）,梯度洗脫 （0～10 min,5% A；10～15 min,5%～30%A；15～42 min,30%～38%A；42～60 min,38%～39%A；60～72 min,39%～50% A；72～83 min,50%～90% A）；體積流量0.9 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長272 nm （0～13 min）、230 nm （13～83 min）；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取各對(duì)照品適量,甲醇溶解后定容,制成貯備液 （含沒食子酸1.034 3 mg/mL、芍藥內(nèi)酯苷1.002 5 mg/mL、芍藥苷2.141 7 mg/mL、延胡索乙素0.332 9 mg/mL、延胡索甲素 1.109 4 mg/mL、迷迭香酸0.787 4 mg/mL、脫氫紫堇堿1.075 1 mg/mL、桂皮醛3.600 5 mg/mL）,分別精密量取1.5、2、4、2、1、2、1、3 mL至20 mL量瓶中,甲醇定容,搖勻,即得（含沒食子酸77.58 μg/mL、芍藥內(nèi)酯苷100.25 μg/mL、芍藥苷428.33 μg/mL、延胡索乙素33.29 μg/mL、延胡索甲素55.47 μg/mL、迷迭香酸78.74 μg/mL、脫氫紫堇堿53.75 μg/mL、桂皮醛540.08 μg/mL）。

2.2.2 供試品溶液 取軟膏（批號(hào)20200401）約2.0 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,密塞,稱定質(zhì)量,超聲提取60 min,放冷,70% 甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,0.45 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照處方比例和工藝流程,制備缺白芍、缺延胡索、缺夏枯草、缺肉桂的陰性樣品,按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備,即得。

2.3 專屬性考察 精密吸取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果見圖1。由此可知,各成分色譜峰與相鄰峰均能達(dá)到有效分離,理論塔板數(shù)按各成分計(jì)均大于3 000,陰性無干擾,表明該方法專屬性良好。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液5、3、2、1.5、1、1 mL,分別置于5、5、5、5、5、10 mL量瓶中,甲醇依次稀釋至6個(gè)質(zhì)量濃度（編號(hào)1～6）,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）,峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸,結(jié)果見表1,可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.4” 項(xiàng)下3號(hào)對(duì)照品溶液（含沒食子酸31.03 μg/mL、芍藥內(nèi)酯苷40.10 μg/mL、芍藥苷171.33 μg/mL、延胡索乙素13.32 μg/mL、延胡索甲素22.19 μg/mL、迷迭香酸31.49 μg/mL、脫氫紫堇堿21.50 μg/mL、桂皮醛216.03 μg/mL）,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次,測(cè)得沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、延胡索乙素、延胡索甲素、迷迭香酸、脫氫紫堇堿、桂皮醛峰面積RSD分別為1.64%、1.23%、0.77%、1.15%、1.13%、0.54%、1.59%、0.62%,表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批軟膏 （批號(hào)20200401）,按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別于0、3、6、9、12、24 h,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、延胡索乙素、延胡索甲素、迷迭香酸、脫氫紫堇堿、桂皮醛峰面積RSD分別為0.92%、1.87%、1.28%、0.95%、1.85%、2.69%、1.43%、1.56%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批軟膏 （批號(hào)20200401）,按“2.2.2” 項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、延胡索乙素、延胡索甲素、迷迭香酸、脫氫紫堇堿、桂皮醛含有量RSD分別為1.17%、1.63%、0.88%、1.63%、1.79%、1.53%、2.08%、1.02%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批各成分含有量已知的軟膏（批號(hào)20200401）6份,每份約1.0 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加入“2.2.1” 項(xiàng)下貯備液適量,使其與各成分含有量之比均在1 ∶1左右,按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算回收率。結(jié)果,沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、延胡索乙素、延胡索甲素、迷迭香酸、脫氫紫堇堿、桂皮醛平均加樣回收率分別為99.33%、99.95%、98.87%、100.28%、99.52%、97.82%、100.46%、101.08%,RSD分別為1.72%、1.13%、1.86%、1.77%、2.03%、1.71%、2.38%、1.10%。

2.9 樣品含有量測(cè)定 取3批軟膏,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,每批平行3份,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算含有量,結(jié)果見表2。

表2 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg/g， n=3）Tab.2 Results of content determination of various constituents （mg/g， n=3）

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇 椒香溫中止痛軟膏中沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、延胡索乙素、延胡索甲素、迷迭香酸、脫氫紫堇堿、桂皮醛藥理活性以抗炎、鎮(zhèn)痛為主［12-15］,而且專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好,故選擇其作為指標(biāo)成分。另外,方中花椒、香附因其指標(biāo)成分不明確、熱穩(wěn)定性差等因素未納入定量測(cè)定中,而是采用TLC法作定性鑒別。

3.2 流動(dòng)相、體積流量篩選 本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-水、乙腈-0.1% 磷酸、［乙腈-甲醇（1 ∶1）］-0.1%磷酸、甲醇-水、甲醇-0.1% 磷酸,最終選擇甲醇-0.1% 磷酸作為流動(dòng)相；考察了0.8、0.9、1.0 mL/min,發(fā)現(xiàn)在0.9 mL/min體積流量下各成分峰形較好。再對(duì)甲醇、0.1%磷酸比例不斷進(jìn)行調(diào)節(jié),最終確定為“2.1” 項(xiàng)下梯度洗脫程序。

3.3 檢測(cè)波長篩選 本研究采用DAD檢測(cè)器對(duì)各成分進(jìn)行200～400 nm全波長掃描,考慮到既要與其他色譜峰有較好的分離度,又能同時(shí)將所有成分都檢測(cè)出,最終確定為“2.1” 項(xiàng)下檢測(cè)波長,此時(shí)各成分色譜峰峰形較好,響應(yīng)值穩(wěn)定,與其他相鄰峰能達(dá)到有效分離。

3.4 供試品溶液制備方法篩選 本實(shí)驗(yàn)考察了提取溶劑（甲醇、70% 乙醇、70% 甲醇、50% 甲醇、1%鹽酸甲醇）、提取方式（加熱回流、超聲、振搖）、提取時(shí)間（20、40、60、80、100 min）、料液比（1 ∶5、1 ∶10、1 ∶25、1 ∶50）,發(fā)現(xiàn)提取溶劑、提取時(shí)間、料液比對(duì)提取效果影響較大,而提取方式對(duì)其影響較小?？紤]到實(shí)驗(yàn)操作、提取效率等方面,最終確定為“2.2.2” 項(xiàng)下方法。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC法同時(shí)測(cè)定椒香溫中止痛軟膏中沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、延胡索乙素、延胡索甲素、迷迭香酸、脫氫紫堇堿、桂皮醛的含有量,該方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確,重復(fù)性好,可用于該制劑的質(zhì)量控制。