茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒不同輪次主釀區(qū)可培養(yǎng)霉菌種群結(jié)構(gòu)多樣性

朱治宇，黃永光

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025）

以貴州茅臺(tái)酒為代表的醬香型白酒，因其獨(dú)特的釀造工藝和優(yōu)質(zhì)的口感，受到廣大消費(fèi)者的青睞。與國(guó)外的蒸餾酒不同，醬香型白酒釀造屬于傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵，工藝復(fù)雜、開(kāi)放式多菌混合發(fā)酵。醬香型白酒獨(dú)特釀造環(huán)境和釀造工藝形成了其獨(dú)特的微生物體系，致使其形成獨(dú)特的風(fēng)格特征：醬香突出、酒體醇厚、幽雅細(xì)膩、空杯留香持久[1-5]。研究發(fā)現(xiàn)[6]，醬香型白酒酒醅中的微生物來(lái)自大曲、原料、空氣及地面灰塵，其發(fā)酵過(guò)程涵蓋著細(xì)菌、酵母、霉菌等菌群結(jié)構(gòu)復(fù)雜的演替。其中，霉菌能夠分泌多種酶，包括糖化酶、脂肪酶、蛋白酶和水解酶等，具有分解酒醅中的大分子物質(zhì)、產(chǎn)生酒體中的風(fēng)味物質(zhì)或其前體物質(zhì)的功能，與整個(gè)醬香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成密切相關(guān)[7]，其中的絲狀真菌能夠產(chǎn)生糖化酶作用于原料中的淀粉，提高出酒率[8]，還可提升基酒品質(zhì)。因此，系統(tǒng)性研究醬香白酒主釀區(qū)環(huán)境霉菌和大曲霉菌群落結(jié)構(gòu)及其種間演替規(guī)律對(duì)科學(xué)探究醬香白酒發(fā)酵具有重要意義。

酒曲是白酒釀造的糖化發(fā)酵劑，富含多種酶類(lèi)和菌類(lèi)，醬香白酒的釀造用曲量高達(dá)1∶1，因此大曲在釀造過(guò)程中非常重要[9]。醬香白酒的大曲中含有多類(lèi)霉菌，已知大多數(shù)的霉菌都參與酒醅發(fā)酵[10]，研究表明，霉菌代謝為大曲提供了豐富的酶系[11]，推動(dòng)了大曲的發(fā)酵成熟，對(duì)大曲淀粉的糖化降解和防止曲塊裂口等具有重要意義[12]。其中Aspergillussp.、Absidiasp.、Rhizopussp.、Rhizomucorsp.、Mucorsp.、Penicilliumsp.和Monascussp.是酒曲中主要存在的7 類(lèi)霉菌，約50 種[13]，游劍等[14]采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法從枝江大曲酒的大曲中分離出Penicilliumsp.、Aspergillussp.和Mucorsp.等霉菌；班世棟等[15]從醬香型白酒大曲中得到了19 株不同的霉菌。但高溫大曲中溫度和濕度等條件會(huì)限制很多霉菌的生長(zhǎng)[16]，醬香白酒還需要通過(guò)堆積發(fā)酵網(wǎng)羅環(huán)境中的霉菌來(lái)完成發(fā)酵[17]，由此可見(jiàn)，研究釀造大曲霉菌菌群結(jié)構(gòu)及主釀區(qū)環(huán)境微生態(tài)霉菌多樣性對(duì)醬香白酒發(fā)酵具有重要意義。

目前，鮮見(jiàn)對(duì)茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒主釀區(qū)環(huán)境和大曲霉菌系統(tǒng)性研究，本課題為了從物種分類(lèi)水平上詳細(xì)描述茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒釀造環(huán)境和大曲中霉菌群落的特征性結(jié)構(gòu)[18]，在前期利用宏基因組學(xué)系統(tǒng)分析微生物結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，對(duì)茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒7 個(gè)不同輪次主要釀造區(qū)域（共包括17 家酒企，分為7 個(gè)區(qū)域）進(jìn)行取樣，采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)技術(shù)和現(xiàn)代18S rRNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物基因測(cè)序技術(shù)確定霉菌種屬，通過(guò)探究霉菌在各輪次種類(lèi)、數(shù)量變化和功能分析（跟蹤整個(gè)生產(chǎn)期），擬充分認(rèn)識(shí)醬香型白酒1～7輪次中起主導(dǎo)作用的霉菌多樣性結(jié)構(gòu)特征、輪次間種群結(jié)構(gòu)差異性以及消亡率、富集率變化，更清晰地從微觀角度描述大曲霉菌和環(huán)境霉菌對(duì)白酒釀造的作用，為今后醬香白酒微生物數(shù)據(jù)庫(kù)的建立和微生物層面的工藝優(yōu)化提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：取自貴州省茅臺(tái)鎮(zhèn)TMS、GT、DDH等17 家醬香型白酒公司的白酒生產(chǎn)車(chē)間，2018—2019年1～7輪次主釀區(qū)環(huán)境樣品和大曲樣品。

真菌DNA試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；霉菌引物（ITS1和ITS4） 北京全式金生物技術(shù)有限公司；DAN Marker（DM2000） 寶生物工程有限公司；瓊脂糖 南京生興生物技術(shù)有限公司；核酸染料（Gengreen） 上海賽百盛有限公司。

孟加拉紅培養(yǎng)基（上海博微生物有限公司）：蛋白胨5.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L、磷酸氫二鉀1.0 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、孟加拉紅0.033 3 g/L、瓊脂20.0 g/L、氯霉素0.1 g/L，pH 7.0～7.4。

麥芽汁液體培養(yǎng)基（上海博微生物有限公司）：麥芽膏粉130.0 g/L、氯霉素0.1 g/L、pH 5.6±0.2。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái) 蘇州金凈科技有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；旋渦混合器 海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；CP153電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；PCR儀 美國(guó)伯樂(lè)公司；DYY-8C型電泳儀北京六一儀器廠；JS-680C凝膠成像儀 上海培清科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

樣品取自貴州省仁懷市茅臺(tái)鎮(zhèn)觀音寺區(qū)、上坪村、椿樹(shù)村、巖灘村、向陽(yáng)村、盧榮壩村及合馬鎮(zhèn)街道社區(qū)共7 個(gè)醬香白酒主釀區(qū)域的17 個(gè)代表性釀酒企業(yè)，1～7輪次酒醅堆積發(fā)酵期間的主釀區(qū)環(huán)境樣品和生產(chǎn)使用大曲樣品。其中環(huán)境樣品采集包括：將各酒廠生產(chǎn)車(chē)間的窗戶玻璃、窗臺(tái)、晾堂及四周地面、墻面、墻角、行車(chē)梯子及上表面、配電箱上表面、消防箱上表面、儲(chǔ)酒罐和一些平時(shí)不易被打掃的角落等處的采樣點(diǎn)進(jìn)行灰塵樣品等量采集并均勻混合。

將均勻混合的樣品作為該輪次樣品（17 家公司1～7輪次共計(jì)119 個(gè)大曲樣品和119 個(gè)環(huán)境樣品），均勻密封袋密封，并立即生物性保藏運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室4 ℃冰柜低溫保存。準(zhǔn)確標(biāo)記每個(gè)取樣點(diǎn)以防被破壞，且每次都在相同取樣點(diǎn)取樣。最終，按照區(qū)域劃分將每個(gè)酒廠的樣品等量混合為代表一個(gè)區(qū)域的最終混合樣品（本實(shí)驗(yàn)共分為7 個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域1 個(gè)最終混合樣品，7 個(gè)輪次共計(jì)49 個(gè)大曲最終混合樣品和49 個(gè)環(huán)境最終混合樣品）。

1.3.2 霉菌菌株分離鑒定

實(shí)現(xiàn)“三教融合”的有效路徑就是通過(guò)農(nóng)村普法教育的方式和途徑，將自治教育和德治教育內(nèi)容填充其中。這是因?yàn)?，普法教育?nèi)容與自治教育、德治教育存在內(nèi)容上的交集和方式上的共通。一方面，村民自治教育的主要內(nèi)容，除了我國(guó)現(xiàn)行的《村民委員會(huì)組織法》外，一般是村委會(huì)自身制定的自治性章程規(guī)范，而后者制定的淵源是前者。德治教育的內(nèi)容離不開(kāi)法律這一最低的限度，法律既是實(shí)現(xiàn)道德的手段，也是衡量道德的標(biāo)準(zhǔn)。另一方面，經(jīng)過(guò)40年的普法教育，無(wú)論是傳統(tǒng)的說(shuō)教宣傳手段，還是便捷先進(jìn)的普法形式，在鄉(xiāng)村都已經(jīng)有了相當(dāng)?shù)慕?jīng)驗(yàn)和固定的通道，利用成熟的媒介進(jìn)行“三教融合”便利又高效。

取25 g最終樣品溶于225 mL生理鹽水中[15]，加入玻璃珠，在160 r/min的搖床充分振蕩30 min，稀釋到不同梯度（取10－3、10－4、10－5三個(gè)梯度）并設(shè)置3 個(gè)平行組，涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基上置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，統(tǒng)計(jì)肉眼可見(jiàn)的不同霉菌菌落數(shù)目，參照《常見(jiàn)與常用真菌》[19]中的方法鑒定。

1.3.3 霉菌DNA的提取

將初篩所得的霉菌點(diǎn)板于孟加拉紅培養(yǎng)基上（設(shè)置3 個(gè)平行組），30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，取6.5 g麥芽汁培養(yǎng)基溶于50 mL蒸餾水中，滅菌后冷卻，在無(wú)菌操作臺(tái)挑取部分菌體置于液體培養(yǎng)基中，在120 r/min的搖床振蕩3 d后，取培養(yǎng)基中的菌體研磨，再根據(jù)北京索萊寶科技有限公司的柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)，對(duì)霉菌進(jìn)行基因組DNA提取，將提取的菌株基因組DNA置于－20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 PCR擴(kuò)增及凝膠電泳

霉菌PCR擴(kuò)增引物：ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）；PCR體系：2 μL DNA，1 μL Primer 1和1 μL Primer 2兩種引物，12.5 μL 2×EsTaqMasterMix和8.5 μL ddH2O，總體系共計(jì)25 μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物置于－20 ℃冰箱保存至送樣。PCR程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性60 s；51 ℃退火60 s；72 ℃延伸1 min，其中變性、退火和第1次延伸共經(jīng)過(guò)35 個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃延伸5 min結(jié)束。

1.3.5 18S rRNA PCR產(chǎn)物測(cè)序

1%瓊脂糖凝膠（加有10 μL Gel Red核酸染色劑）檢測(cè)確定的PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。后將測(cè)序結(jié)果在NCBI的BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行DNA序列比對(duì)分析[20]，從而確定霉菌的種屬。

斜面保藏：挑取純化的霉菌接種于已滅菌且凝固的孟加拉紅斜面試管中，在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～5 d后置于4 ℃的冰箱保藏。

甘油管保藏：挑取純化的霉菌菌株于5 mL己滅菌的麥芽汁液體培養(yǎng)基中30 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，取多個(gè)菌絲團(tuán)稍微研磨成渾濁菌液（約0.5 mL）加入0.5 mL已滅菌的30%甘油于1.5 mL的EP管中混合均勻，每個(gè)菌株做3 個(gè)甘油保藏，標(biāo)記并放置于－80 ℃冰箱長(zhǎng)期保藏。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用WPS 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，堆積柱狀圖使用Origin 8.6繪制，RStudio繪制相對(duì)豐度圖、Venn圖和和弦圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同輪次環(huán)境和大曲中可培養(yǎng)霉菌菌種分析

整合茅臺(tái)鎮(zhèn)7 個(gè)主釀區(qū)樣品數(shù)據(jù)作為該輪次數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從不同輪次環(huán)境和大曲中分別分離得到614 株和486 株霉菌。根據(jù)點(diǎn)板霉菌菌落形態(tài)及其顏色特征排重，共送檢256 株霉菌，通過(guò)霉菌18S rRNA基因測(cè)序比對(duì)分析，結(jié)果如表1所示，環(huán)境樣品中共鑒定得到27 個(gè)屬57 個(gè)種，大曲樣品中共鑒定得到15 個(gè)屬31 個(gè)種。

表1 環(huán)境和大曲中分離篩選可培養(yǎng)霉菌分析結(jié)果Table 1 Separation and identification of culturable molds from the brewing environment and Daqu

續(xù)表1

表1 中M4、M6、M32、M46、M54、M67菌ITS的相似度小于98%，因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)合系統(tǒng)樹(shù)、菌落表征及生理特性等指標(biāo)的考察，并查閱相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道比對(duì)，明確了上述結(jié)果的可靠性，菌落表征分析見(jiàn)表2。

如表1所示，從醬香型白酒釀造環(huán)境中共篩出27 個(gè)屬：Lichtheimia、Mucor、Aspergillus、Monascus、Penicillium、Talaromyces、Rhizomucor、Rhizopus、Pleosporales、Coniothyrium、Galactomyces、Ascomycota、Epicoccum、Trichosporon、Paecilomyces、Trichoderma、Syncephalastrum、Gymnomyces、Irpex、Phanerochaete、Trametes、Fusarium、Chaetomium、Schizophyllum、Scopulariopsis、Geotrichum、Phlebia，包括2 種Lichtheimia、17 種Aspergillus、2 種Monascus、5 種Penicillium、5 種Mucor、2 種Rhizopus、2 種Rhizomucor、3 種Talaromyces等57 種霉菌。從醬香型白酒釀造大曲中共篩出15 個(gè)屬：Lichtheimia、Aspergillus、Monascus、Penicillium、Thermoascus、Phanerochaete、Paecilomyces、Rhizomucor、Irpex、Emmia、Cladosporium、Schizophyllum、Mucor、Trametes、Hyphodontia，包括2 種Lichtheimia、8 種Aspergillus、6 種Monascus、4 種Penicillium等31 種霉菌。

表2 ITS相似度小于98%可培養(yǎng)霉菌菌落表征分析Table 2 Characterization of culturable mold colonies with ITS similarity less than 98%

范光先等[21]以茅臺(tái)釀造過(guò)程中的酒醅、大曲、環(huán)境灰塵為樣品，利用傳統(tǒng)可培養(yǎng)技術(shù)分離出51 種霉菌；黃永光[22]從醬香白酒釀造環(huán)境及其主要釀造環(huán)節(jié)中共篩出10 種曲霉：A. niger、A. oryzae、A. terreus、A. tubingensis、A. flavus、A. hennebergii、A. fumigatus、A. niveus、A. candidus和M. ruber，其中有7 種曲霉與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。本課題在醬香白酒釀造區(qū)域環(huán)境和大曲樣品中共分離篩選出霉菌31 個(gè)屬68 個(gè)種，包括17 種Aspergillus和6 種Monascus。由于實(shí)驗(yàn)采樣區(qū)域廣泛，涵蓋茅臺(tái)鎮(zhèn)多個(gè)醬酒主釀區(qū)，且對(duì)整個(gè)生產(chǎn)周期進(jìn)行了跟蹤，使數(shù)據(jù)較前人研究霉菌種類(lèi)更豐富。另外，在醬香白酒釀造區(qū)域環(huán)境和大曲樣品中首次檢出6 種霉菌：S. racemosum、P. cinnamopurpureum、T. diversiformis、A. pragensis、A. allahabadii、H. palmae，多種霉菌混合發(fā)酵為白酒生產(chǎn)提供了豐富的酶系、有利的酸堿環(huán)境、多種風(fēng)味成分和前體物質(zhì)等[23]。

沈毅等[24]分析了醬香酒醅中真菌微生物的組成及其多樣性，發(fā)現(xiàn)了Paecilomyces、Thermomyces、Monascus等豐度較高的霉菌；孫劍秋等[25]通過(guò)傳統(tǒng)可培養(yǎng)技術(shù)分離醬香型白酒酒醅中的霉菌，其中Aspergillus、Penicillium、Geotrichum、Monascus、Mucor、Scopulariopsis、Paecilomyces、Cladosporium等屬霉菌與本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的霉菌相符；徐佳等[26]研究發(fā)現(xiàn)，Monascus、Mucor、Penicillium、Lichtheimia、Aspergillus、Rhizopus等屬霉菌是茅臺(tái)酒醅中常見(jiàn)的霉菌，其中A. nidulans、A. fumigatus、A. candidus、A. flavus、M. rutilus、M. ruber、M. purpureus等精確到種的霉菌與本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的霉菌相符；母應(yīng)春等[27]運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)分析了貴州省3 個(gè)地區(qū)的酒曲中微生物群落組成和多樣性，結(jié)果表明Rhizopus、Aspergillus和Thermomyces是酒曲中優(yōu)勢(shì)霉菌；李靜心等[28]運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)從白酒高溫大曲和中高溫大曲中分離出Aspergillus、Thermomyces和Rhizomucor等高豐度霉菌。本實(shí)驗(yàn)中Thermomyces在大曲中豐度較高，但在環(huán)境中未篩出，分析原因可能是該菌嗜熱，環(huán)境溫度較低不適合該菌的生長(zhǎng)；對(duì)比前人研究發(fā)現(xiàn)，醬香白酒酒醅發(fā)酵過(guò)程中多種霉菌與本實(shí)驗(yàn)研究相符，說(shuō)明釀造大曲和環(huán)境為酒醅發(fā)酵提供了主要微生物來(lái)源。

2.2 不同輪次環(huán)境中可培養(yǎng)霉菌種群結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 多樣性結(jié)構(gòu)分析

圖1 不同輪次環(huán)境中霉菌相對(duì)豐度Fig. 1 Relative abundance of molds from the brewing environment in different fermentation rounds

將環(huán)境樣品中鑒定得到的霉菌按照GB 4789.15—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》方法計(jì)數(shù)[29]，運(yùn)用軟件Origin 8.6繪制上述釀造環(huán)境中57 種霉菌在1～7輪次相對(duì)豐度堆積柱形圖。從圖1可以看出，至少在1 個(gè)輪次平均相對(duì)豐度大于20%的霉菌包括4 個(gè)屬4 個(gè)種，分別為L(zhǎng). corymbifera21%、M. circinelloides21.58%、P. variotii24.37%和S. commune21.17%；至少在1 個(gè)輪次平均相對(duì)豐度大于10%的霉菌包括6 個(gè)屬12 個(gè)種，分別為L(zhǎng). corymbifera、L. ramosa、M. circinelloides、M. racemosus、A. sydowii、A. flavus、A. tritici、A. oryzae、Monascussp. Atc8、R. pusillus、P. variotii、S. commune。綜上研究表明，Lichtheimia、Mucor、Aspergillus、Monascus、Rhizomucor、Paecilomyces、Schizophyllum等屬霉菌是醬香白酒釀造環(huán)境中具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的霉菌，其中Aspergillus的種類(lèi)多達(dá)4 種，說(shuō)明Aspergillus在醬香白酒釀造過(guò)程中發(fā)揮重要作用，與前人研究相符[25-26]。另外，霉菌種類(lèi)在2、3、4、5輪次最多，其中第4輪次霉菌種類(lèi)多達(dá)13 個(gè)屬21 個(gè)種。說(shuō)明醬香白酒發(fā)酵過(guò)程中2、3、4、5輪次是發(fā)酵最主要的幾個(gè)輪次，其中第4輪次中霉菌數(shù)量和種類(lèi)均最多，是發(fā)酵的核心輪次。該結(jié)果與楊大金等[30]研究相符，被稱(chēng)為“大回酒”的3、4、5輪次酒具有產(chǎn)酒率高、酒質(zhì)好、醬香風(fēng)味突出等特點(diǎn)。另外，前期應(yīng)用Illumina高通量測(cè)序分析霉菌菌群結(jié)構(gòu)，主釀區(qū)環(huán)境樣品中得到4 個(gè)門(mén)、20 個(gè)科、89 個(gè)屬，對(duì)比本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，有75%以上的屬能與高通量數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)，25%左右的屬未在高通量數(shù)據(jù)中對(duì)應(yīng)。分析原因可能是培養(yǎng)條件和分析方法的不同，使得數(shù)據(jù)在可接受范圍內(nèi)產(chǎn)生一定的差異。相對(duì)而言，高通量測(cè)序技術(shù)能更全面準(zhǔn)確地分析樣品微生態(tài)結(jié)構(gòu)，而傳統(tǒng)可培養(yǎng)技術(shù)較具局限性，適用于分析有限優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)[31]。本實(shí)驗(yàn)中優(yōu)勢(shì)霉菌與高通量測(cè)序分析結(jié)果基本一致，證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)的可靠性。

分析霉菌的消漲可知，Lichtheimia在1～6輪次趨于穩(wěn)定，第7輪次未篩出該菌；Mucor在1、5、6、7輪次含量較高，2、3、4輪次含量較低；Aspergillus、Monascus隨輪次的增加逐漸減少；Rhizomucor在1、6、7輪次含量較高；Paecilomyces隨輪次先增加后減少，在3、4、5輪次含量較高；Schizophyllum分布輪次較少，主要集中在3、4輪次。原因主要是發(fā)酵前期原料淀粉含量較高、溫度較低，發(fā)酵中期受季節(jié)影響溫度較高，發(fā)酵后期淀粉含量和環(huán)境溫度均降低，Lichtheimia具有產(chǎn)熱穩(wěn)定性淀粉酶的能力[32]，適合在高溫、高淀粉含量條件下生長(zhǎng)，而第7輪次溫度降低及原料中淀粉含量減少不利于該菌生長(zhǎng)；Mucor和Rhizomucor適合在適宜的條件下生長(zhǎng)，溫度升高則被抑制[33]；Aspergillus和Monascus酶系豐富[34-35]，當(dāng)原料逐漸消耗殆盡[36]，其含量也逐漸下降；Paecilomyces和Schizophyllum適合在高溫條件下生長(zhǎng)[37-38]，隨溫度的降低受到抑制。綜上表明，在茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒發(fā)酵過(guò)程中，霉菌種群多樣性結(jié)構(gòu)隨著發(fā)酵輪次的進(jìn)行發(fā)生改變，說(shuō)明不同發(fā)酵輪次對(duì)霉菌生長(zhǎng)具有調(diào)控作用，霉菌種類(lèi)和優(yōu)勢(shì)霉菌的更替產(chǎn)生豐富的酶系對(duì)醬香白酒酒體的飽滿具有積極促進(jìn)作用[7]。

2.2.2 輪次間種群結(jié)構(gòu)差異性分析

圖2 不同輪次環(huán)境中相對(duì)豐度大于5%的霉菌Upset圖Fig. 2 Upset plot of molds with relative abundance greater than 5%from the brewing environment in different fermentation rounds

運(yùn)用軟件RStudio繪制不同釀造輪次環(huán)境相對(duì)豐度大于5%（共23 種）霉菌Upset圖，見(jiàn)圖2。對(duì)環(huán)境樣品中57 種霉菌進(jìn)行篩選，得到23 種霉菌相對(duì)豐度大于5%。由左側(cè)條形圖可知，3、4、5輪次種類(lèi)優(yōu)勢(shì)明顯，其中4輪次最多；右側(cè)Upset圖表明，23 種霉菌有6 種單獨(dú)出現(xiàn)在2、6、7輪次中，剩余17 種霉菌具有輪次間的傳承性，其中，3、4輪次之間有10 種共有霉菌，4、5輪次之間有9 種共有霉菌，3、4、5輪次之間6 種共有霉菌。結(jié)果表明，茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒釀造環(huán)境中各輪次霉菌之間存在一定的共性特征，且特征霉菌穩(wěn)定性較強(qiáng)，遷移率較高，具有數(shù)量和種類(lèi)的傳承性。

另外，上述23 種霉菌在第1輪次發(fā)酵起始時(shí)發(fā)現(xiàn)9 種（相對(duì)豐度和占88.54%），到第7輪次發(fā)酵結(jié)束時(shí)剩余3 種（相對(duì)豐度和占38.71%），消亡率高達(dá)49.83%；有5 種霉菌發(fā)酵起始時(shí)未發(fā)現(xiàn)，但在發(fā)酵結(jié)束時(shí)檢出（相對(duì)豐度和占61.29%）；有9 種霉菌僅出現(xiàn)于發(fā)酵中間階段，即2～6輪次（相對(duì)豐度和占比分別為34.04%、6.72%、37.23%、25.17%、24.00%，均低于50%）。消亡率與富集率較高說(shuō)明不同發(fā)酵階段對(duì)霉菌調(diào)控作用明顯，而各階段霉菌存在差異性為各輪次白酒生產(chǎn)提供更豐富酶系，但差異性低于相似性說(shuō)明各階段起主導(dǎo)作用的霉菌具有較強(qiáng)的傳承性。

2.3 不同輪次大曲中可培養(yǎng)霉菌種群結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 多樣性結(jié)構(gòu)分析

將大曲樣品中鑒定得到的霉菌按照上述方法，繪制釀造大曲中31 種霉菌在1～7輪次相對(duì)豐度堆積柱形圖，見(jiàn)圖3。至少在1 個(gè)輪次平均相對(duì)豐度大于20%的霉菌包括4 個(gè)屬5 個(gè)種，分別為L(zhǎng). corymbifera20.55%、L. ramosa27.27%、A. allahabadii20.00%、P. sordida25.64%、T. crustaceus22.06%；至少在1 個(gè)輪次平均相對(duì)豐度大于10%的霉菌包括5 個(gè)屬8 個(gè)種，分別為L(zhǎng). corymbifera、L. ramosa、A. allahabadii、P. griseofulvum、P. citrinum、P. crustosum、P. sordida、T. crustaceus。綜上研究表明，Lichtheimia、Aspergillus、Penicillium、Phanerochaete、Thermoascus等屬霉菌是醬香白酒釀造區(qū)域大曲中具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的霉菌，對(duì)比本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前人研究基本相符[26-27]。但R. pusillus數(shù)量和輪次分布均較少僅在第1輪次發(fā)現(xiàn)，對(duì)比環(huán)境中R. pusillus的生長(zhǎng)狀況，認(rèn)為該菌雖然具有一定的耐熱性[39]，但醬香白酒中高溫大曲的溫度過(guò)高，不適合該菌的生長(zhǎng)。值得注意的是，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)A. allahabadii是大曲中的優(yōu)勢(shì)霉菌，也是首次在醬香白酒大曲中被發(fā)現(xiàn)，但該結(jié)果并沒(méi)有前人研究證實(shí)，原因可能是：1）本實(shí)驗(yàn)涉及白酒主釀區(qū)域較廣，樣品較多，實(shí)現(xiàn)了數(shù)據(jù)的創(chuàng)新；2）該菌原本并非優(yōu)勢(shì)菌，但由于樣品采集導(dǎo)致環(huán)境條件改變，有利于該菌的繁殖；3）平板培養(yǎng)的環(huán)境條件適合該菌的生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)后期采用空白平板篩選實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中的霉菌，并未發(fā)現(xiàn)該菌，證明該菌是樣品本身攜帶。研究發(fā)現(xiàn)A. allahabadii可以產(chǎn)生包括β-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶在內(nèi)的多種酶，其中β-半乳糖苷酶的產(chǎn)量最高，該酶可以水解多糖中的端鏈半乳糖殘基、降解抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高人體免疫力，是一種功能性很強(qiáng)的有益菌[40]，但是否為大曲中的優(yōu)勢(shì)菌種以及在大曲中發(fā)揮的作用，還待后續(xù)進(jìn)一步的研究。另外，前期應(yīng)用Illumina高通量測(cè)序分析霉菌菌群結(jié)構(gòu)，主釀區(qū)生產(chǎn)大曲樣品中得到5 個(gè)門(mén)、17 個(gè)科、68 個(gè)屬。對(duì)比本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，有80%以上的屬和能與高通量數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)，而優(yōu)勢(shì)霉菌Penicillium與高通量測(cè)序分析結(jié)果略有不同，原因可能是可培養(yǎng)條件較適宜該菌的生長(zhǎng)，使其成為本實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)菌種。

圖3 不同輪次大曲中霉菌相對(duì)豐度Fig. 3 Relative abundance of molds from Daqu in different fermentation rounds

分析霉菌的消漲可以發(fā)現(xiàn)，Lichtheimia在2、3、4輪次含量較低，6、7輪次含量較高；Aspergillus在1、7輪次含量較高，5、6輪次含量較低；Penicillium在各輪次含量趨于穩(wěn)定；Phanerochaete在1～5輪次含量較高，6、7輪次含量較低；Thermoascus在3～7輪次含量較高，2輪次含量較低，1輪次中未發(fā)現(xiàn)。分析原因可知，傳統(tǒng)醬香高溫大曲品溫高達(dá)60 ℃左右，加之發(fā)酵中期受季節(jié)影響溫度較高，抑制了包括Lichtheimia、Aspergillus等微生物的生長(zhǎng)，Penicillium耐高溫性不好，在不利的條件下會(huì)以孢子形式存在，樣品采集后條件改變使得孢子萌發(fā)，導(dǎo)致其在各輪次含量趨于穩(wěn)定[41]；Thermoascus能夠在45 ℃以上的高溫環(huán)境中生長(zhǎng)代謝，并產(chǎn)生耐熱的纖維素酶和木聚糖酶[42]，在環(huán)境樣品中未篩出該菌，而大曲卻對(duì)Thermoascus進(jìn)行了富集。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高溫大曲會(huì)對(duì)環(huán)境中的霉菌進(jìn)行篩選和富集，從而抑制酸敗菌的生長(zhǎng)，促進(jìn)高溫細(xì)菌和嗜熱霉菌的繁殖[43]，有利于醬香白酒酒體的成型與穩(wěn)定[11-12]。

2.3.2 輪次間種群結(jié)構(gòu)差異性分析

圖4 不同輪次大曲中相對(duì)豐度大于5%霉菌Upset圖Fig. 4 Upset plot of molds with relative abundance greater than 5%from Daqu in different fermentation rounds

對(duì)大曲樣品中31 種霉菌進(jìn)行篩選，得到18 種霉菌相對(duì)豐度大于5%（圖4）。由左側(cè)條形圖可知，各輪次霉菌種類(lèi)差異性不大，1輪次種類(lèi)最多，4輪次最少；右側(cè)Upset圖表明，18 種霉菌有3 種單獨(dú)出現(xiàn)在2、3輪次中，剩余15 種霉菌具有輪次間的傳承性，其中，有5 種霉菌在7 個(gè)輪次都被發(fā)現(xiàn)。對(duì)比環(huán)境霉菌，釀造大曲各輪次霉菌之間傳承性更強(qiáng)，推測(cè)原因是由于外界環(huán)境比曲房更復(fù)雜，曲房?jī)?nèi)穩(wěn)定的環(huán)境更有利于霉菌的傳承與遷移。

上述18 種霉菌在第1輪次發(fā)酵起始時(shí)發(fā)現(xiàn)12 種（相對(duì)豐度和占90.40%），到第7輪次發(fā)酵結(jié)束時(shí)剩余7 種（相對(duì)豐度和占79.09%），消亡率為11.31%；有2 種霉菌發(fā)酵起始時(shí)未發(fā)現(xiàn)，但在發(fā)酵結(jié)束時(shí)檢出（相對(duì)豐度和占20.91%）；有4 種霉菌僅出現(xiàn)于發(fā)酵中間階段，即2～6輪次（相對(duì)豐度和占比分別為9.01%、11.97%、0%、15.87%、2.21%）。結(jié)果表明，大曲中起主導(dǎo)作用霉菌傳承性極強(qiáng)，各階段霉菌差異性較低，消亡率遠(yuǎn)低于環(huán)境（49.83%），正是由于高溫大曲對(duì)優(yōu)勢(shì)霉菌具有良好的傳承和篩選特性，加之醬香白酒用曲量較大[9]，使得這些優(yōu)勢(shì)霉菌進(jìn)入酒醅后迅速主導(dǎo)發(fā)酵。本實(shí)驗(yàn)詮釋了“曲為酒骨”，用微觀的角度分析了制曲的重要性。

2.4 不同輪次環(huán)境與大曲霉菌種群結(jié)構(gòu)差異性分析

圖5 環(huán)境和大曲中霉菌種群Venn圖Fig. 5 Venn diagram showing the number of molds at the genus and species level between the brewing environment and Daqu

圖6 不同釀造輪次環(huán)境及大曲中霉菌種群和弦圖分析Fig. 6 Chord diagram showing the relative abundance of molds between the brewing environment and Daqu

繪制Venn圖和和弦圖直觀分析醬香白酒釀造區(qū)域環(huán)境及大曲中霉菌的共性與特性，見(jiàn)圖5、6。大曲霉菌中有11 個(gè)屬與環(huán)境一致，占大曲總屬73.33%，各輪次相對(duì)豐度和分別為99.32%、96.53%、86.33%、85.25%、92.06%、77.94%和85.45%；大曲霉菌中有20 個(gè)種與環(huán)境一致，占大曲總種的64.52%，各輪次相對(duì)豐度和分別為75.33%、79.84%、81.19%、85.25%、75.39%、63.98%和85.45%。值得注意的是，醬香型高溫大曲曲坯初入房時(shí)并非高溫，此時(shí)溫度較低濕度較高，適合籠絡(luò)環(huán)境中多種微生物生長(zhǎng)和代謝，隨著溫度的升高實(shí)現(xiàn)了對(duì)嗜熱微生物的篩選[37]。上述結(jié)果可知，大曲與環(huán)境中霉菌類(lèi)群相似度較高，說(shuō)明大曲在曲房開(kāi)放式發(fā)酵過(guò)程中與環(huán)境霉菌資源具有一定的交集作用，而大曲通過(guò)品溫上升的篩選，最終實(shí)現(xiàn)環(huán)境、原料等外界中的有益霉菌向大曲遷移富集。

環(huán)境霉菌中有16 個(gè)屬在大曲中未發(fā)現(xiàn)，占環(huán)境總屬59.26%，各輪次相對(duì)豐度和分別為11.44%、7.81%、5.04%、4.38%、2.88%、0%和24.74%；環(huán)境霉菌中有37 個(gè)種在大曲中未發(fā)現(xiàn)，占環(huán)境總種64.91%，各輪次相對(duì)豐度和分別為11.44%、39.74%、11.76%、16.06%、25.17%、26.00%和35.50%。結(jié)果顯示，環(huán)境中存在多種霉菌，其中未進(jìn)入大曲發(fā)酵的霉菌種類(lèi)超過(guò)50%。眾所周知，醬香白酒堆積發(fā)酵是自然網(wǎng)羅、富集釀造環(huán)境中微生物過(guò)程，能夠形成獨(dú)特的微生物菌群結(jié)構(gòu)[2]，以上數(shù)據(jù)證實(shí)了醬香白酒堆積發(fā)酵網(wǎng)羅環(huán)境中微生物的重要性。

綜上可知，醬香白酒釀造區(qū)域環(huán)境中存在種類(lèi)繁多的霉菌，無(wú)論是高溫大曲的制作工藝還是堆積發(fā)酵工藝，都是為籠絡(luò)環(huán)境中霉菌為后續(xù)發(fā)酵提供微生物動(dòng)力。從微生物角度分析，若發(fā)酵過(guò)程中舍棄撒曲僅靠堆積發(fā)酵籠絡(luò)環(huán)境微生物，會(huì)使有益霉菌無(wú)法主導(dǎo)發(fā)酵或因生物量不足延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，從而嚴(yán)重影響白酒口感甚至使酒醅變質(zhì)；若舍棄堆積發(fā)酵，雖然大曲提供了主導(dǎo)發(fā)酵的有益霉菌，但如圖6所示，各輪次將有30%左右霉菌被摒棄。

表3 部分相對(duì)豐度小于5%可培養(yǎng)霉菌功能總結(jié)分析Table 3 Functions of selected culturable molds with relative abundance less than 5%

由表3可知，部分豐度較小的霉菌同樣具有產(chǎn)香功能，可見(jiàn)，若舍棄環(huán)境中這些豐度較小的霉菌可能會(huì)對(duì)醬香白酒品質(zhì)產(chǎn)生重要影響。

3 結(jié) 論

對(duì)茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒7 個(gè)主釀區(qū)1～7輪次環(huán)境和大曲中可培養(yǎng)霉菌種群結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行研究，分別分離得到614 株和486 株霉菌，通過(guò)形態(tài)特征和18S rRNA基因測(cè)序比對(duì)分析，共送檢256 株霉菌，最終環(huán)境樣品中鑒定得到27 個(gè)屬57 個(gè)種不同霉菌，大曲樣品中鑒定得到15 個(gè)屬31 個(gè)種不同霉菌。通過(guò)對(duì)不同輪次釀造環(huán)境和大曲中可培養(yǎng)霉菌多樣性結(jié)構(gòu)分析，明確了Lichtheimia、Mucor、Aspergillus、Monascus、Rhizomucor、Paecilomyces、Schizophyllum等屬是醬香白酒釀造環(huán)境中具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的霉菌；Lichtheimia、Aspergillus、Penicillium、Phanerochaete、Thermoascus等屬是醬香白酒釀造大曲中具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的霉菌，通過(guò)對(duì)比前人研究發(fā)現(xiàn)，醬香白酒酒醅發(fā)酵過(guò)程中多種霉菌與本實(shí)驗(yàn)研究相符，說(shuō)明釀造大曲和環(huán)境為酒醅發(fā)酵提供了主要微生物來(lái)源。

通過(guò)對(duì)輪次間可培養(yǎng)霉菌種群結(jié)構(gòu)差異性分析，證實(shí)了不同輪次環(huán)境中霉菌之間存在一定的共性特征，且特征霉菌穩(wěn)定性較強(qiáng)，遷移率較高，具有數(shù)量和種類(lèi)的傳承性。通過(guò)對(duì)比消亡率和富集率，進(jìn)一步說(shuō)明不同發(fā)酵階段對(duì)霉菌調(diào)控作用明顯，各階段霉菌存在的差異性為各輪次白酒生產(chǎn)提供更豐富酶系，但差異性低于相似性說(shuō)明各階段起主導(dǎo)作用的霉菌具有較強(qiáng)的傳承性；對(duì)比環(huán)境霉菌，釀造大曲各輪次霉菌之間傳承性更強(qiáng)，各階段霉菌差異性較低，消亡率遠(yuǎn)低于環(huán)境，起主導(dǎo)作用霉菌具有極強(qiáng)傳承性，該結(jié)論詮釋了“曲為酒骨”，從微觀的角度分析了制曲的重要性。

通過(guò)對(duì)環(huán)境與大曲霉菌種群結(jié)構(gòu)差異性分析，發(fā)現(xiàn)大曲與環(huán)境中霉菌類(lèi)群相似度較高，說(shuō)明大曲在曲房開(kāi)放式發(fā)酵過(guò)程中與環(huán)境霉菌資源具有一定的交集作用，而大曲通過(guò)品溫上升的篩選，最終實(shí)現(xiàn)環(huán)境、原料等外界中的有益霉菌向大曲遷移和富集。另外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)環(huán)境中有37 種（各輪次相對(duì)豐度和占30%左右）霉菌未在大曲中篩出，證實(shí)了醬香白酒堆積發(fā)酵網(wǎng)羅環(huán)境中微生物的重要性。本實(shí)驗(yàn)深入剖析了環(huán)境霉菌和大曲霉菌對(duì)醬香白酒發(fā)酵的重要意義，從微生物角度詮釋了高溫大曲和堆積發(fā)酵都是醬香白酒中不可分割的釀造工藝。