腌制臭雞蛋中微生物多樣性分析及關(guān)鍵物質(zhì)含量測定

陳 偉，李 楊，谷新晰，談蘇慧，盧海強(qiáng),

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)教務(wù)處，河北 保定 071001）

“臭”味食品源自食腐文化，是飲食的一個(gè)重要分支，如我國臭豆腐、瑞典鯡魚罐頭及日本的臭魚干等。臭雞蛋是一種極具地域特色食品，在河北省唐山、滄州、邢臺(tái)和石家莊等地區(qū)較為常見。臭雞蛋蛋體呈灰白色，有淡淡的臭味，入口后酯香濃郁、余味悠長。當(dāng)前，臭雞蛋生產(chǎn)仍以家庭生產(chǎn)方式進(jìn)行，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，其關(guān)鍵原因是臭雞蛋中的微生物菌落結(jié)構(gòu)信息不詳。因此，探究臭雞蛋中微生物群落結(jié)構(gòu)、微生物群落結(jié)構(gòu)與化學(xué)特性的關(guān)系十分重要。

發(fā)酵食品微生物多樣性研究主要為發(fā)酵食品中微生物種群的類別、豐度、分布、結(jié)構(gòu)變化及微生物群落功能的多樣性。以此為改進(jìn)傳統(tǒng)食品發(fā)酵工藝、探究發(fā)酵食品風(fēng)味形成機(jī)理等方面提供技術(shù)支持。中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品種類眾多且大多采用獨(dú)特的生產(chǎn)方法，涉及復(fù)雜的微生物群落，采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法對(duì)它們進(jìn)行分析顯然已經(jīng)遠(yuǎn)無法滿足研究的需要。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，尤其是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）這一技術(shù)的成熟，建立了單鏈構(gòu)象多態(tài)性[1]、變性梯度凝膠電泳[2]和末端限制性片段長度多樣性[3]等環(huán)境微生物多樣性分析方法，并成功應(yīng)用于食品微生物多樣性的研究。近年來，高通量測序以其檢測快速、準(zhǔn)確、信息全面豐富等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品微生物多樣性的研究[4-5]。戴玲瑛等[6]運(yùn)用高通量測序技術(shù)對(duì)蝦醬中的細(xì)菌群落組成和多樣性進(jìn)行分析，加深了對(duì)蝦醬中微生物群落組成和多樣性的認(rèn)識(shí)，為優(yōu)化蝦醬的生產(chǎn)工藝提供理論依據(jù)。Zang Jinhong等[7]運(yùn)用16S rRNA和ITS1高通量測序技術(shù)研究酸魚過程中微生物群落的動(dòng)態(tài)、多樣性和演替，研究發(fā)現(xiàn)酸魚發(fā)酵過程中微生物群落是動(dòng)態(tài)的，接種混合發(fā)酵劑抑制了許多與食品腐敗有關(guān)的微生物的生長，有利于酸魚產(chǎn)品質(zhì)量的提高。

發(fā)酵食品在生產(chǎn)的過程中，微生物將對(duì)原材料中的物質(zhì)進(jìn)行降解、轉(zhuǎn)換及分泌自身代謝產(chǎn)物等物質(zhì)，而這些物質(zhì)會(huì)對(duì)產(chǎn)品的風(fēng)味、營養(yǎng)及安全性造成一定的影響。如傳統(tǒng)發(fā)酵食品中普遍存在生物胺，尤其是原料富含蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，如我國的豆豉、臭豆腐、腐乳[8-10]，國外的奶酪和發(fā)酵香腸等[11-12]。食用過多含有生物胺的食物，可能會(huì)引起中毒，導(dǎo)致偏頭疼、高血壓、呼吸紊亂等不良反應(yīng)[13-14]。雞蛋中富含膽固醇等脂類及氨基酸，會(huì)對(duì)產(chǎn)品的風(fēng)味及營養(yǎng)價(jià)值造成很大影響，而到目前為止，鮮有臭雞蛋中上述物質(zhì)含量相關(guān)的報(bào)道。

本研究以傳統(tǒng)腌制臭雞蛋為材料，開展微生物（細(xì)菌和真菌）多樣性及氨基酸、生物胺與膽固醇等物質(zhì)含量分析，以加深對(duì)臭雞蛋中微生物多樣性及其化學(xué)特征的認(rèn)識(shí)，強(qiáng)化臭雞蛋的質(zhì)量與安全，提高臭雞蛋的品質(zhì)，為優(yōu)化和規(guī)范臭雞蛋的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

臭雞蛋樣品購自河北省河間市堪泰家庭農(nóng)場有限公司。

17 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸） 美國Agilent公司；內(nèi)標(biāo)（正亮氨酸、異硫氰酸苯酯）、8 種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品（色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺） 美國Sigma-Aldrich公司；丹磺酰氯 上海源葉試劑有限公司；總膽固醇（total cholesterol，T-CHO）測試盒、甘油三酯（triglyceride，TG）測試盒、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測試盒、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）測試盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜系統(tǒng)（包括二元泵、2489紫外-可見光檢測器、2707自動(dòng)進(jìn)樣器、1500柱溫箱） 沃特科技（上海）有限公司；酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司；L600系列高效液相色譜儀 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集

利用無菌取樣器對(duì)臭雞蛋腌制鹵汁進(jìn)行取樣，并于－20 ℃保存?zhèn)溆?，進(jìn)行臭雞蛋的微生物多樣性的測定；選取外觀完整的臭雞蛋，貯存于－20 ℃，進(jìn)行臭雞蛋生物胺、氨基酸和脂肪酸等指標(biāo)的測定。

1.3.2 微生物群落的高通量測序分析

采集臭雞蛋發(fā)酵后期的鹵汁100 mL，選用十六烷基三甲基溴化銨法提取DNA，目標(biāo)片段PCR擴(kuò)增采用NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶，擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的V3-V4區(qū)域和真菌的ITS1區(qū)域，細(xì)菌V3-V4 F：ACTCCTACGGGAGGCAGCA；細(xì)菌V3-V4 R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。真菌ITS1 F：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG；真菌ITS1 R：GCTGCGTTCTTCATCGATGC。擴(kuò)增體系（25 μL）：5×Reaction Buffer 5 μL，5×GC Buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，F(xiàn)orward Primer（10 μmol/L）1 μL，Reverse Primer（10 μmol/L）1 μL，DNA Template 2 μL，ddH2O 8.75 μL，Q5 DNA Polymerase 0.25 μL。擴(kuò)增參數(shù)：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。采用AXYGEN公司的凝膠回收試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化。將PCR擴(kuò)增回收產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量，熒光試劑為Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫，使用MiSeq測序儀進(jìn)行2×300 bp的雙端測序，相應(yīng)試劑為MiSeq Reagent Kit V3。

為整合原始雙端測序數(shù)據(jù)，首先采用滑動(dòng)窗口法對(duì)FASTQ格式的雙端序列逐一做質(zhì)量篩查，隨后利用FLASH軟件進(jìn)行配對(duì)連接，最后根據(jù)樣本所對(duì)應(yīng)的Barcode序列對(duì)獲得每個(gè)樣本的有效序列。運(yùn)用QIIME軟件和R軟件剔除疑問序列并統(tǒng)計(jì)序列數(shù)，用QIIME軟件的UCLUST對(duì)前述獲得的序列按97%的序列相似度進(jìn)行歸并和可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）劃分，選取每個(gè)OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列。采用UNITE數(shù)據(jù)庫對(duì)真菌的ITS序列進(jìn)行物種分類信息的劃分，采用Greengenes數(shù)據(jù)庫對(duì)細(xì)菌16S rRNA進(jìn)行物種分類信息的劃分。最后基于上述分析結(jié)果，運(yùn)用QIIME軟件進(jìn)行對(duì)樣本進(jìn)行α多樣性分析，在物種水平上進(jìn)行物種的差異分析和相關(guān)分析等。

1.3.3 游離氨基酸和水解氨基酸含量的測定

采用反相高效液相色譜法測定臭雞蛋樣品中游離氨基酸和水解氨基酸含量。游離氨基酸和水解氨基酸待測溶液的制備參照張薇等[15]的方法。氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備、衍生試劑異硫氰酸苯酯的配制及衍生、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和色譜條件等均參照董蕊等[16]的方法并稍作改動(dòng)，以正亮氨酸為內(nèi)標(biāo)物，與氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液、游離氨基酸和水解氨基酸待測液混合后濃度為250 μmol/L。

1.3.4 生物胺含量的測定[17]

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精確稱取8 種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品各100 mg，用0.1 mol/L HCl溶液溶解，制備成4 mg/mL生物胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別吸取相同體積標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行混合，用0.1 mol/L HCl溶液稀釋成最終質(zhì)量濃度分別為500、250、100、50、25、10、5 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

樣品的處理：將臭雞蛋在研缽中研磨成糜，取2 g加入20 mL 0.1 mol/L HCl溶液，16 000 r/min攪拌分離器均質(zhì)1～2 min，7 422×g、4 ℃離心30 min，取上清液過濾。

衍生：取1 mL生物胺的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液或樣品，加入200 μL 2 mol/L NaOH溶液，然后加入300 μL飽和NaHCO3溶液，再加入1 mL丹磺酰氯溶液（10 mg/mL丙酮），渦旋1 min，置于42 ℃水浴鍋中避光水浴45 min，取出后向樣液中加入100 μL氨水，避光反應(yīng)30 min，最后用色譜級(jí)乙腈定容至5 mL，并用0.45 μm有機(jī)膜過濾后用于高效液相色譜分析。

色譜柱為Agilent EclipseXDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相A為0.1 mol/L乙酸銨溶液，流動(dòng)相B為乙腈，柱溫40 ℃，采用梯度洗脫程序，流速1 mL/min，紫外檢測器波長254 nm，進(jìn)樣量20 μL。

1.3.5 膽固醇相關(guān)物質(zhì)含量的測定

準(zhǔn)確稱取去殼臭雞蛋和鮮雞蛋質(zhì)量，按料液比1∶9（g/mL）加入無水乙醇。在冰水浴的條件下進(jìn)行機(jī)械勻漿1～2 min，2 500 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液待測，采用試劑盒測定臭雞蛋和鮮雞蛋中的T-CHO、TG、HDL-C、LDL-C含量，具體步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)測定3 次，利用Excel 2010和SPSS 19.0軟件對(duì)測定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物多樣性分析

2.1.1 微生物的α多樣性分析

基因組DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1），并對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行切膠回收，回收濃度到擴(kuò)增的要求，可用于后續(xù)的研究分析。通過細(xì)菌V3-V4和真菌ITS1測序，分別獲得66 229 個(gè)和94 033 個(gè)序列。運(yùn)用QIIME軟件和R軟件剔除疑問序列并統(tǒng)計(jì)序列數(shù)，分別獲得39 605 個(gè)和53 649 個(gè)序列。所得序列在97%的相似水平下進(jìn)行OTU統(tǒng)計(jì)分析，分別獲得2 748 個(gè)和712 個(gè)OTU。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測圖Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products of bacterial and fungal genomic DNA

表1 臭雞蛋菌群微生物多樣性指數(shù)Table 1 Microbial diversity indexes of stinky eggs

由表1可知，臭雞蛋鹵汁樣品中細(xì)菌和真菌的微生物群落種群多樣性和總體豐度相對(duì)較高。從Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)可以看出，臭雞蛋鹵汁樣品中細(xì)菌的群落豐度高于真菌。在采樣數(shù)量不足5 000 個(gè)OTU時(shí)，細(xì)菌與真菌的Shannon指數(shù)便進(jìn)入了平臺(tái)期，表明測序結(jié)果已足夠反映臭雞蛋鹵汁樣本所包含的多樣性，臭雞蛋樣品的測序深度已滿足后續(xù)生物信息學(xué)分析的要求。

2.1.2 臭雞蛋鹵汁樣品中不同水平細(xì)菌群落組成分析

臭雞蛋鹵汁樣品中共鑒定出7 個(gè)細(xì)菌門，分別為變形菌門（Proteobacteria）、鹽厭氧菌門（Halanaerobiaeota）、梭桿菌門（Fusobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）。

由圖2A可知，鹽厭氧菌是鹵汁的細(xì)菌中最占優(yōu)勢的菌群，由門水平至屬水平其相對(duì)豐度均在53%以上；Proteobacteria和Firmicutes所占比例略低，相對(duì)豐度分別為30.62%和15.05%。在變形菌門中γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）為優(yōu)勢菌綱，其相對(duì)豐度為30.26%。γ-變形菌綱中有很多病原菌，如沙門氏菌屬和弧菌屬等，在腌制臭雞蛋的過程中控制變形菌的生長，利于提高臭雞蛋的安全性。在厚壁菌門中芽孢桿菌綱（Bacilli）和梭菌綱（Clostridia）占主導(dǎo)地位，相對(duì)豐度分別為7.56%和7.48%。

圖2 基于GraPhlAn的樣本總體分類等級(jí)樹圖（A）及屬水平分布圖（B）Fig. 2 GraPhlAn-based sample classification hierarchy tree (A) and horizontal distribution map at genus level (B)

臭雞蛋鹵汁中鑒定出的細(xì)菌屬主要有20 個(gè)（圖2B）。在這20 個(gè)細(xì)菌屬中，嗜鹽耐鹽的菌屬有鹽厭氧菌屬（Halanaerobium）、鹽單胞菌屬（Halomonas）、源洋菌屬（Idiomarina）、鹽乳芽孢桿菌屬（Halolactibacillus）、海桿菌屬（Marinobacter）、Kosakonia、嗜鹽嗜堿菌屬（Alkalibacterium）等，總相對(duì)豐度將近90%。這與臭雞蛋的制作工藝有關(guān)，在高鹽濃度發(fā)酵的環(huán)境中會(huì)存在嗜鹽耐鹽微生物，李春生等[18]在研究傳統(tǒng)魚露發(fā)酵過程中細(xì)菌群落演替中發(fā)現(xiàn)Halanaerobium是魚露發(fā)酵過程中最主要的菌群，在發(fā)酵3 個(gè)月，其相對(duì)豐度達(dá)到92.1%；魚露發(fā)酵末期，Halomonas成為優(yōu)勢菌群，其相對(duì)豐度為25.8%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)Halanaerobium與三甲胺（魚腥味）呈顯著正相關(guān)，Halomonas與2-甲基丙醛（麥芽香味）呈顯著正相關(guān)；韓國魚醬油[19]在發(fā)酵過程中Halanaerobium也占據(jù)主導(dǎo)地位。本研究所取樣品時(shí)期為臭雞蛋發(fā)酵末期，Halanaerobium為優(yōu)勢菌屬，相對(duì)豐度達(dá)到53.89%；其余依次為Halomonas（11.55%）、Idiomarina（9.97%）、Halolactibacillus（4.77%）、Marinobacter（4.50%）、Clostridiisalibacter（3.53%）、Clostridium_sensu_stricto_18（2.33%）、腸球菌屬（Enterococcus，1.44%）、Kosakonia（1.14%）。

2.1.3 臭雞蛋鹵汁樣品中不同水平真菌群落組成分析

臭雞蛋鹵汁樣品共鑒定出6 個(gè)真菌門，分別為子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）、毛霉亞門（Mucoromycota）、油壺菌門（Olpidiomycota）。

圖3 基于GraPhlAn的樣本總體分類等級(jí)樹圖（A）及屬水平分布圖（B）Fig. 3 GraPhlAn-based sample classification hierarchy tree (A) and horizontal distribution map at genus level (B)

由圖3A可知，劃分至已知分類單元的真菌的優(yōu)勢菌門分別為Ascomycota（35.04%）、Olpidiomycota（10.10%）、Basidiomycota（9.68%）；優(yōu)勢菌綱分別為糞殼菌綱（Sordariomycetes，24.21%）、油壺菌綱（Olpidiomycetes，10.10%）、傘菌綱（Agaricomycetes，7.32%）、座囊菌綱（Dothideomycetes，5.65%）；優(yōu)勢菌目分別為肉座菌目（Hypocreales，19.54%）、油壺菌目（Olpidiales，10.10%）、牛肝菌目（Boletales，5.87%）、Dothideomycetes_ord_Incertae_sedis（2.33%）；優(yōu)勢菌科分別為蟲草菌科（Cordycipitaceae，18.95%）、油壺菌科（Olpidiaceae，10.10%）、乳牛肝菌科（Suillaceae，5.84%）、沙漠殼菌科（Eremomycetaceae，2.33%）。

臭雞蛋鹵汁樣品中鑒定出的真菌屬主要有20 個(gè)（圖3B），而相對(duì)豐度大于1%的屬有蠟蚧菌屬（Lecanicillium，11.64%）、油壺菌屬（Olpidium，10.10%）、擬青霉屬（Simplicillium，7.10%）、乳牛肝菌屬（Suillus，5.84%）、Arthrographis（2.33%）、Acidomyces（1.58%）、裂殼菌屬（Schizothecium，1.20%）、Anteaglonium（1.07%）、Derxomyces（1.04%）。對(duì)比酸魚、紅腐乳、東北大醬和發(fā)酵乳制品（酸牛奶、酸馬奶和酸駝奶）等[7,20-22]我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品的真菌菌屬，Lecanicillium和Olpidium是臭雞蛋樣品中獨(dú)有的菌屬，其中Lecanicillium是從輪枝孢屬（Verticillium）真菌中分離出來的一類真菌，寄生在農(nóng)業(yè)害蟲和植物病原真菌中；Olpidium菌體寄生于藻類和植物細(xì)胞內(nèi)，屬于植物致病菌。目前，未見Lecanicillium和Olpidium參與食品發(fā)酵的報(bào)道，在臭雞蛋樣品中含有Lecanicillium和Olpidium，可能是發(fā)酵后期遭到了污染。

2.2 水解氨基酸含量分析

雞蛋在腌制過程中，大量微生物的演替，伴隨著微生物的代謝活動(dòng)，雞蛋中蛋白質(zhì)大分子分解成小肽和游離氨基酸，產(chǎn)生并積累具有臭味的風(fēng)味物質(zhì)和生物胺等物質(zhì)，氨基酸測定結(jié)果如表2所示。

鮮雞蛋樣品中水解氨基酸總量為（11.10±0.331）%，必需氨基酸為（4.69±0.169）%，非必需氨基酸為（6.41±0.162）%；臭雞蛋樣品中水解氨基酸總量為（6.89±0.440）%，必需氨基酸為（3.14±0.203）%，非必需氨基酸為（3.75±0.237）%。與鮮雞蛋樣品相比，臭雞蛋樣品的水解氨基酸總量減少了37.93%。

表2 鮮雞蛋與臭雞蛋試樣中氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 2 Amino acid composition of fresh and stinky eggs

臭雞蛋樣品水解氨基酸的必需氨基酸含量占其總氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的45.57%，高于世界衛(wèi)生組織/聯(lián)合國糧農(nóng)組織（World Health Organization/Food and Agriculture Organization，WHO/FAO）理想蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的40%。水解氨基酸中的非必需氨基酸含量占其總氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的54.43%，其中必需氨基酸/非必需氨基酸為83.73%，遠(yuǎn)高于WHO/FAO理想蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的60%[23]。這說明臭雞蛋中的營養(yǎng)物質(zhì)雖然有所損失，但臭雞蛋的氨基酸組成與WHO/FAO理想蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)十分接近，能夠?yàn)槿梭w提供較為豐富的必需氨基酸。

2.3 游離氨基酸含量分析

游離氨基酸是重要的呈味物質(zhì)，臭雞蛋樣品中游離氨基酸總量為（3.42±0.111）%，為鮮雞蛋樣品（（0.30±0.039）%）的11.4 倍。其中丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸呈甜味，谷氨酸和天冬氨酸呈鮮味，精氨酸、組氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸呈苦味[24]。臭雞蛋中呈甜味、鮮味和苦味的游離氨基酸分別是鮮雞蛋的8.4、12.5 倍和15.2 倍，臭雞蛋鮮味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸分別占總游離氨基酸的21.93%、12.28%、48.83%。

2.4 生物胺含量分析

目前我國還沒有完善的監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)或規(guī)定限制食品中8 種生物胺含量以及總生物胺含量。唯一涉及生物胺的標(biāo)準(zhǔn)只是針對(duì)水產(chǎn)品，即GB 2733—2015《鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品》[25]，標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定高組胺魚類中組胺含量不可超過400 mg/kg，其他海水魚類中組胺含量不可超過200 mg/kg。由圖4可知，在臭雞蛋樣品中共檢測出3 種生物胺，分別為色胺（69.02±0.74）mg/kg、組胺（8.33±0.53）mg/kg和酪胺（129.45±1.12）mg/kg，總生物胺含量為（206.80±2.39）mg/kg。結(jié)果表明，臭雞蛋中的生物胺含量相對(duì)較低。

圖4 臭雞蛋樣品生物胺高效液相色譜圖Fig. 4 HPLC chromatograms of biogenic amines in stinky egg samples

2.5 T-CHO、TG、HDL-C及LDL-C含量分析

圖5 臭雞蛋與鮮雞蛋中的T-CO、TG、DL-C、LDL-C含量Fig. 5 Contents of T-CHO, TG, HDL-C and LDL-C in stinky and fresh eggs

人體血液中T-CHO、TG和LDL-C含量超過正常標(biāo)準(zhǔn)會(huì)增高動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等心血管疾病的發(fā)病率。而HDL-C可以降低動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等心血管疾病的發(fā)病率。由圖5可知，臭雞蛋樣品中T-CHO、TG和LDL-C含量相比于鮮雞蛋減少44%、47%和30%；臭雞蛋樣品中的HDL-C含量相比于鮮雞蛋增加59%。

3 討 論

本研究通過高通量測序技術(shù)對(duì)臭雞蛋發(fā)酵后期鹵汁的細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)臭雞蛋鹵汁與我國其他傳統(tǒng)發(fā)酵臭味食品相比在細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)均存在一定差異。臭雞蛋鹵汁中的乳酸菌和酵母菌種類不及臭豆腐和臭鹵水豐富，但含有豐富的嗜鹽耐鹽細(xì)菌[26]。這可能是因?yàn)槌綦u蛋僅以食鹽和香辛料熬制的鹵水浸泡腌制，而在發(fā)酵臭鹵水的原料中有大量蔬菜。臭雞蛋鹵汁中細(xì)菌屬水平有相對(duì)豐度將近90%的嗜鹽耐鹽細(xì)菌，大部分嗜鹽菌會(huì)產(chǎn)出蛋白酶、脂肪酶和脂酶。其中臭雞蛋中的Halomonas（11.55%）、Idiomarina（9.97%）、Marinobacter（4.50%）和Stenotrophomonas（0.01%）等菌屬，均從其中篩選出了產(chǎn)蛋白酶、酯酶和脂肪酶的菌株[27-31]。真菌方面，有41.9%的OTU經(jīng)UNITE數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分類學(xué)注釋，未能歸屬到任何已知分類單元。而劃分至已知分類單元的真菌的優(yōu)勢菌屬為Lecanicillium（11.64%）和Olpidium（10.10%），本研究用于高通量測序的樣品為發(fā)酵后期鹵汁，對(duì)真菌的演替變化不得而知，但推測是發(fā)酵后期遭到了污染。

生物胺在發(fā)酵食品中是潛在的食品安全隱患。此次臭雞蛋樣品中僅檢測出3 種生物胺，分別為色胺（69.02±0.74）mg/kg、組胺（8.33±0.53）mg/kg和酪胺（129.45±1.12）mg/kg，總生物胺含量為（206.80±2.39）mg/kg。而臭豆腐[9,26]和豆豉[32]測定出8 種生物胺，其中臭豆腐組胺和酪胺含量分別為0～34.5 mg/kg和67.8～178.0 mg/kg，且總生物胺含量高于臭雞蛋；豆豉的組胺和酪胺含量分別為0～24.71 mg/kg和0～117.59 mg/kg，且總生物胺含量為71.40～231.24 mg/kg。研究表明，在發(fā)酵食品中組胺、酪胺、β-苯乙胺和總生物胺含量分別為50～100、100～800、30、100～200 mg/kg，是可接受水平[33]。由以上對(duì)比結(jié)果，可知臭雞蛋中的生物胺含量在一個(gè)安全可接受的范圍中。

臭雞蛋鹵汁中含有相對(duì)豐度為1.44%的Enterococcus、0.26%的腸桿菌屬（Enterobacter）和0.92%的不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter），有研究發(fā)現(xiàn)其與酪胺、組胺、尸胺和腐胺等生物胺的產(chǎn)生有關(guān)[34-35]。同時(shí)，臭雞蛋鹵汁中含有總相對(duì)豐度接近3.5%的芽孢桿菌屬（Bacillus）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）、梭菌屬（Clostridium）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、變形菌屬（Proteus）和鏈球菌屬（Streptococcus）等可產(chǎn)生一種或多種生物胺[36]，有研究發(fā)現(xiàn)其中假單胞菌屬的豐度與組胺和尸胺的濃度呈正相關(guān)[37]。臭雞蛋鹵汁中產(chǎn)生物胺的微生物在屬水平的相對(duì)豐度僅為6.12%，發(fā)酵食品中生物胺的產(chǎn)生和積累是多種因素及其相互作用的結(jié)果，臭雞蛋樣品中僅含有少量色胺、酪胺和組胺，可能是因?yàn)楫a(chǎn)生物胺的微生物相對(duì)豐度較低。

臭雞蛋經(jīng)發(fā)酵后，營養(yǎng)物質(zhì)雖有一定的損失。但水解氨基酸的必需氨基酸/總氨基酸和必需氨基酸/非必需氨基酸較高，氨基酸組成符合FAO/WHO的理想模式，仍可作為補(bǔ)充人體蛋白質(zhì)的優(yōu)質(zhì)蛋白源。臭雞蛋中呈甜味、鮮味和苦味的游離氨基酸分別是鮮雞蛋的8.4、12.5 倍和15.2 倍，臭雞蛋鮮味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸分別占總游離氨基酸的21.93%、12.28%、48.83%?？辔栋被崦黠@多于甜味氨基酸和鮮味氨基酸，鮮味、甜味和苦味與各自的閾值有關(guān)。胱氨酸和甲硫氨酸等含硫氨基酸在微生物的作用下可能產(chǎn)生一定量的硫化氫等含硫化合物，使雞蛋產(chǎn)生臭味。有報(bào)道稱Halanaerobium和Halomonas分別與三甲胺（魚腥味）和2-甲基丙醛（麥芽香味）呈顯著正相關(guān)[18]。可能正是這些物質(zhì)造就了臭雞蛋的獨(dú)特風(fēng)味。與此同時(shí)，臭雞蛋中T-CHO、TG和LDL-C含量相比于鮮雞蛋減少44%、47%和30%，HDL-C含量相比于鮮雞蛋增加59%。這一變化符合現(xiàn)今人們營養(yǎng)需求，對(duì)消費(fèi)者的健康有利。由此可見，臭雞蛋是一種具有營養(yǎng)的和風(fēng)味特殊的傳統(tǒng)發(fā)酵食品。

本研究利用高通量測序?qū)Τ綦u蛋中的微生物多樣性進(jìn)行了解析，同時(shí)探討了微生物組成與生物胺之間的相關(guān)性，這為全面了解臭雞蛋發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌群和今后臭雞蛋發(fā)酵菌種篩選和規(guī)模化生產(chǎn)工藝的研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究利用高通量測序技術(shù)分析臭雞蛋發(fā)酵后期的鹵汁中的微生物多樣性，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌共有7 個(gè)細(xì)菌門、10 個(gè)綱、21 個(gè)目、37 個(gè)科、68 個(gè)屬；真菌共有6 個(gè)門、14 個(gè)綱、14 個(gè)目、36 個(gè)科、41 個(gè)屬。鹽厭氧菌是鹵汁細(xì)菌中最占優(yōu)勢的菌群。在屬水平嗜鹽耐鹽的細(xì)菌總相對(duì)豐度將近90%，Halanaerobium占53.89%。而真菌有41.9%的OTU經(jīng)UNITE數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分類學(xué)注釋，未能歸屬到任何已知分類單元，屬水平的優(yōu)勢菌群為Lecanicillium和Olpidium，推測是發(fā)酵后期遭到了污染。通過探討臭雞蛋鹵汁中的細(xì)菌與真菌群落組成，了解了其優(yōu)勢菌群的分布情況及對(duì)臭雞蛋的風(fēng)味、安全和營養(yǎng)等品質(zhì)的影響。

臭雞蛋中的蛋白含量雖然有所損失，但仍能為人體提供較為豐富的必需氨基酸。臭雞蛋游離氨基酸為鮮雞蛋的11.4 倍，豐富的游離氨基酸參與構(gòu)成了臭雞蛋的特殊風(fēng)味。臭雞蛋樣品中僅含色胺、組胺和酪胺，總生物胺為（206.80±2.39）mg/kg，含量在一個(gè)安全可接受的范圍中。臭雞蛋樣品中T-CHO、TG、LDL-C和HDL-C含量變化符合現(xiàn)今人們營養(yǎng)需求，對(duì)消費(fèi)者的健康有利。