駝乳蛋白α-淀粉酶抑制活性肽的制備與鑒定

蘇 娜，伊 麗,2，吉日木圖,2,

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古駱駝研究院，內(nèi)蒙古 阿拉善 750306）

隨著生活水平的提高，越來(lái)越多的人患上糖尿病，致使其成為僅次于心腦血管疾病、惡性腫瘤后排名第三的慢性非傳染疾病[1]。目前，在預(yù)防糖尿病方面采用了各種策略，如改變飲食、避免加工食品，增加蔬菜和水果的攝入量、定期進(jìn)行鍛煉以及使用不同的降血糖藥物[2]。然而由于胰島素和常規(guī)口服降血糖藥物的副作用和有限的長(zhǎng)期持久性，需要探索自然和安全的方法防止糖尿病的進(jìn)一步發(fā)展。近年來(lái)，食源性降血糖肽不斷被開發(fā)出來(lái)，例如植物源降血糖肽（核桃、燕麥和山杏仁等）[3-5]；動(dòng)物源性降血糖肽（山羊乳、蠶蛹和帶魚等）[6-8]。它們較化合藥物具有很多優(yōu)勢(shì)，已成為當(dāng)下的研究熱點(diǎn)。文獻(xiàn)表明，一些降血糖肽能有效刺激胰島素的分泌，改善糖尿病動(dòng)物模型和受試者的血糖水平[9]。其中α-淀粉酶抑制活性肽可有效控制餐后血糖，降低血糖水平，備受學(xué)術(shù)界關(guān)注。

駝乳營(yíng)養(yǎng)成分獨(dú)特，容易消化吸收，過(guò)敏原性低，含有豐富的蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、維生素和必需的礦物質(zhì)元素，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值遠(yuǎn)高于其他動(dòng)物乳。它的基本化學(xué)成分與牛乳相似，但干物質(zhì)、蛋白質(zhì)、灰分和脂肪等含量都高于牛乳[10]。駝乳獨(dú)特的健康益處可能與自身的蛋白質(zhì)組成有關(guān)[11]，駝乳含有其他動(dòng)物乳所罕有的純天然生物活性蛋白，如乳鐵蛋白、溶菌酶、免疫球蛋白、重鏈抗體、胰島素和類胰島素生長(zhǎng)因子等，可應(yīng)用于抑制血糖升高的研究中[12]。研究表明，駝乳在體外和體內(nèi)試驗(yàn)都顯示出良好的降血糖活性[13-16]，引起消費(fèi)者的極大興趣。以駝乳蛋白為原料制備α-淀粉酶抑制活性肽，顯得十分有價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)預(yù)采用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)駝乳蛋白進(jìn)行水解，優(yōu)化其工藝條件。測(cè)定最優(yōu)酶解條件下駝乳多肽的α-淀粉酶抑制活性，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）驗(yàn)證駝乳多肽的酶解效果和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）測(cè)定駝乳多肽的分子質(zhì)量分布。并利用氨基酸自動(dòng)分析儀和液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatograph-mass spectrometry，LC-MS）聯(lián)用儀對(duì)駝乳多肽進(jìn)行鑒定，比較不同蛋白酶作用下駝乳多肽的氨基酸組成和肽段序列，分離出有效的生物活性肽，為今后駝乳蛋白α-淀粉酶抑制活性肽的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

駝乳由內(nèi)蒙古阿拉善盟阿拉善右旗養(yǎng)駝戶提供。

BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型） 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；堿性蛋白酶（200 000 U/g）、木瓜蛋白酶（6 000 000 U/g）、1,4-二巰基蘇糖醇（1,4-dithiothreitol，DTT，純度為99%）、絲氨酸、α-淀粉酶（40 000 U/g）、可溶性淀粉、DNS試劑、考馬斯亮藍(lán)蛋白膠快速染色液 北京索萊寶科技有限公司；SDS、三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸、α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA） 美國(guó)Sigma公司；鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA，純度為97%） 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker（10～180 kDa） 美國(guó)Thermo Fisher Scientitic公司；SDS-PAGE預(yù)制膠 江蘇金斯瑞有限公司；SDSPAGE上樣緩沖液（5×） 北京博奧森生物技術(shù)有限公司；乙腈、三氟乙酸（均為色譜純） 德國(guó)Merck公司；Mass Standards Kit for thr 4700 Proteomics Analyzer美國(guó)AB Sciex公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FE28 pH計(jì) 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；DK-8AXX電熱恒溫水槽、GHP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；5810R離心機(jī)德國(guó)Eppendorf公司；MD25（3 500 Da）透析袋 北京索萊寶科技有限公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司；SYNERGY H1酶標(biāo)儀、165-8001垂直電泳槽、164-5050電泳儀、GelDoc XR＋凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Tek有限公司；TS-1000水平脫色搖床 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司；4800 Plus MALDI TOF/TOF質(zhì)譜儀 美國(guó)AB Sciex公司；Q-Exactive質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientitic公司。

1.3 方法

1.3.1 駝乳蛋白的制備

新鮮的駝乳經(jīng)離心（8 000 r/min、20 min、4 ℃），棄去上層脂肪，即得脫脂駝乳。脫脂后的駝乳置于透析袋中，透析外液為磷酸鹽緩沖液，透析24 h除雜。取出后置于－80 ℃預(yù)凍24 h，放入真空冷凍干燥機(jī)中，在－50 ℃、1 Pa條件下干燥成粉備用。駝乳蛋白含量采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定，駝乳蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為64.61%。

1.3.2 酶解制備駝乳多肽

駝乳蛋白以0.1 g/mL的底物質(zhì)量濃度復(fù)原后，選用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶分別對(duì)駝乳蛋白進(jìn)行水解。水解完成后90 ℃、20 min滅酶，冷卻，離心沉淀（4 000 r/min、10 min、4 ℃）提取上清液，即為駝乳多肽。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

分別對(duì)堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶用量、酶解溫度、酶解pH值和酶解時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，測(cè)定各酶解液的蛋白質(zhì)水解度，確定單因素試驗(yàn)的酶解條件。

控制酶解溫度55 ℃、酶解pH 7.0、酶解時(shí)間3 h，設(shè)定酶用量分別為（E/S）質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、3%、5%、7%、9%，考察酶用量對(duì)駝乳蛋白水解度的影響?？刂泼赣昧?%、酶解pH 7.0、酶解時(shí)間3 h，設(shè)定酶解溫度分別為45、50、55、60、65 ℃，考察酶解溫度對(duì)駝乳蛋白水解度的影響?？刂泼赣昧?%、酶解溫度55 ℃、酶解時(shí)間3 h，設(shè)定酶解pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，考察酶解pH值對(duì)駝乳蛋白水解度的影響。控制酶用量5%、酶解溫度55 ℃、酶解pH 7.0，設(shè)定酶解時(shí)間分別為1、2、3、4、5 h，考察酶解時(shí)間對(duì)駝乳蛋白水解度的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以蛋白質(zhì)水解度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)酶用量、酶解溫度、酶解pH值和酶解時(shí)間的4因素3水平L9（34）正交試驗(yàn)，以期獲得堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解駝乳蛋白的最佳工藝條件，正交試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1、2。

表1 堿性蛋白酶水解駝乳蛋白正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9（34）因素與水平Table 1 Factors and levels used in L9(34) orthogonal array design for optimization of camel milk protein hydrolysis by alcalase

表2 木瓜蛋白酶水解駝乳蛋白正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9（34）因素與水平Table 2 Factors and levels used in L9(34) orthogonal array design for optimization of camel milk protein hydrolysis by papain

1.3.5 蛋白質(zhì)水解度的測(cè)定

采用OPA法測(cè)定蛋白質(zhì)水解度[17]。在避光條件下，向裝有3 mL OPA試劑（200 mg SDS、7.62 g四硼酸鈉、160 mg OPA、4 mL乙醇和176 mg DTT用去離子水溶解，定容至200 mL，避光保存）的試管中分別加入400 μL絲氨酸溶液（標(biāo)準(zhǔn)溶液）、去離子水（空白溶液）和駝乳多肽溶液（樣品溶液），混勻5 s后，室溫反應(yīng)2 min，于波長(zhǎng)340 nm處測(cè)定吸光度。按式（1）計(jì)算蛋白質(zhì)水解度：

式中：h為被水解的肽鍵數(shù)/（meqv/g）；htot為蛋白質(zhì)總肽鍵數(shù)（8.2 meqv/g）。

1.3.6α-淀粉酶抑制活性的測(cè)定

吸取不同濃度的駝乳多肽與駝乳蛋白溶液100 μL及1 U/mL的α-淀粉酶（用pH 6.8，0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液配制）100 μL于試管中，混勻后于37 ℃恒溫反應(yīng)5 min，再加入250 μL 1%淀粉溶液（用pH 6.8，0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液配制），混勻后于37 ℃恒溫反應(yīng)5 min，加入200 μL的DNS試劑，反應(yīng)液于沸水浴中加熱15 min后取出，并于冰水浴中迅速冷卻，再加入2 mL蒸餾水，于波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定吸光度[18]。按式（2）計(jì)算α-淀粉酶抑制率：

式中：A樣品為樣品反應(yīng)液吸光度；A空白為以磷酸鹽緩沖液代替酶的吸光度；A對(duì)照為以磷酸鹽緩沖液代替樣品的吸光度。

1.3.7 SDS-PAGE

配制SDS-PAGE 15%分離膠、5%濃縮膠和質(zhì)量濃度為30 mg/mL的駝乳多肽和駝乳蛋白，并與蛋白上樣緩沖液4∶1混合，備用。待濃縮膠凝固后，取下膠板，裝入電泳槽，倒入電泳緩沖液，取下樣品梳，開始加樣。堿性蛋白酶水解駝乳蛋白制備的多肽（以下簡(jiǎn)稱JX）、木瓜蛋白酶水解駝乳蛋白制備的多肽（以下簡(jiǎn)稱MG）、駝乳蛋白和標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子Marker（10～180 kDa）的上樣量為5 μL，濃縮膠和分離膠的電壓分別為90 V和120 V。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)染色液對(duì)膠片進(jìn)行染色，再用脫色液脫色至背景透明，條帶清晰可見(jiàn)，并置于凝膠成像儀上拍照分析。

1.3.8 氨基酸組成的測(cè)定

根據(jù)GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的測(cè)定》的測(cè)定方法[19]，采用L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀對(duì)駝乳多肽的游離氨基酸組成進(jìn)行測(cè)定。

1.3.9 分子質(zhì)量的測(cè)定

將駝乳多肽樣品與CHCA基質(zhì)溶液按體積比1∶1混勻，取1 μL點(diǎn)至樣品靶上，再以相同的方法將校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)在樣品的相鄰靶位上，待自然干燥成結(jié)晶后，置于4800 Plus MALDI TOF/TOF質(zhì)譜儀離子源中進(jìn)行測(cè)定，圖譜掃描范圍為m/z0～10 000，累計(jì)10 次單次掃描信號(hào)為最終質(zhì)譜圖[20]。

1.3.10 多肽的鑒定

1.3.10.1 樣品處理

駝乳多肽通過(guò)10 kDa離心過(guò)濾器過(guò)濾，SPE C18柱除鹽，真空蒸發(fā)后，用40 μL 0.1 mol/L的三氟乙酸溶液重溶，通過(guò)LC-MS鑒定。

1.3.10.2 色譜分離

流動(dòng)相A液為0.1%甲酸溶液，B液為0.1%甲酸-乙腈溶液（乙腈體積分?jǐn)?shù)84%）。色譜柱為RP-C18（0.15 mm×150 mm，5 μm），進(jìn)樣量20 μL，流速0.25 mL/min，進(jìn)樣時(shí)間60 min。流動(dòng)相洗脫程序：流動(dòng)相梯度：0～50 min，96%～50% A，4%～50% B；50～54 min，50%～20% A， 50%～80% B；54～60 min，0% A，100% B。

1.3.10.3 質(zhì)譜鑒定

檢測(cè)方式：正離子模式，質(zhì)量掃描范圍m/z300～1 800，離子源溫度280 ℃，噴霧電壓3 800 V，信號(hào)強(qiáng)度閾值2×104，碰撞能量27 eV。肽段序列用軟件MaxQuant 1.5.5.1檢索相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)，最后得到駝乳多肽鑒定和定量的分析結(jié)果。

1.3.11 多肽的合成

采用固相合成法對(duì)篩選的肽段進(jìn)行合成，并通過(guò)LC-MS分析儀對(duì)合成肽的純度和分子質(zhì)量進(jìn)行鑒定，以上步驟由浙江昂拓萊司生物技術(shù)有限公司輔助完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)均用SPSS 20.0和Microsoft Excel 2016進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，采用ANOVA進(jìn)行Duncan差異分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶用量對(duì)駝乳蛋白水解度的影響

圖1 酶用量對(duì)駝乳蛋白水解度的影響Fig. 1 Effect of enzyme dosage on hydrolysis degree of camel milk protein

從圖1可以看出，隨著酶用量的增加，水解度整體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶在酶用量達(dá)到5%時(shí)，水解度分別為67.17%和52.96%。繼續(xù)增加酶用量，酶解反應(yīng)達(dá)飽和，蛋白質(zhì)水解度變化無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。為節(jié)約成本，故確定堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解駝乳蛋白的最佳酶用量為5%。

2.1.2 酶解溫度對(duì)駝乳蛋白水解度的影響

由圖2可知，隨著酶解溫度的升高，酶與底物接觸機(jī)會(huì)增多，水解程度增大。當(dāng)酶解溫度到達(dá)60 ℃，蛋白質(zhì)水解度達(dá)最高，分別為63.27%（堿性蛋白酶）和57.28%（木瓜蛋白酶）。隨后酶解溫度繼續(xù)升高，導(dǎo)致蛋白酶失活，酶解效果變差，蛋白質(zhì)水解度也開始下降。故確定堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解駝乳蛋白的最佳酶解溫度為60 ℃。

圖2 酶解溫度對(duì)駝乳蛋白水解度的影響Fig. 2 Effect of hydrolysis temperature on hydrolysis degree of camel milk protein

2.1.3 酶解pH值對(duì)駝乳蛋白水解度的影響

圖3 酶解p值對(duì)駝乳蛋白水解度的影響Fig. 3 Effect of pH on hydrolysis degree of camel milk protein

如圖3所示，隨著酶解pH值的增大，堿性蛋白酶水解駝乳蛋白水解度也逐漸增大。在酶解pH值為7.5時(shí)，蛋白質(zhì)水解度相對(duì)較高，達(dá)62.94%，隨后蛋白質(zhì)水解度又下降，因此確定堿性蛋白酶水解駝乳蛋白最佳酶解pH值為7.5。木瓜蛋白酶水解駝乳蛋白隨著酶解pH值的增大，水解度呈先升高后降低的趨勢(shì)。酶解pH值為6.5時(shí)，蛋白質(zhì)水解度為60.61%，達(dá)到最大。這可能是由于過(guò)堿會(huì)影響蛋白酶的穩(wěn)定性，改變酶的空間結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致酶失活。因此確定木瓜蛋白酶的最佳酶解pH值為6.5。

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)駝乳蛋白水解度的影響

圖4 酶解時(shí)間對(duì)駝乳蛋白水解度的影響Fig. 4 Effect of hydrolysis time on hydrolysis degree of camel milk protein

如圖4可知，在堿性蛋白酶作用下，在1～3 h內(nèi)駝乳蛋白的水解度呈上升趨勢(shì)，水解度由46.09%增加到61.27%。隨著水解的進(jìn)行，底物逐漸被消耗，3 h后的水解度開始下降。但在2～3 h內(nèi)，水解度已基本趨于平緩，無(wú)顯著差異（P＞0.05）。故確定堿性蛋白酶水解駝乳蛋白的最佳酶解時(shí)間為2 h。木瓜蛋白酶水解駝乳蛋白隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度有所提高，酶解時(shí)間在2 h時(shí)，蛋白質(zhì)水解度達(dá)最高，為50.04%。因此確定2 h為木瓜蛋白酶水解駝乳蛋白的最佳酶解時(shí)間。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 堿性蛋白酶水解駝乳蛋白正交試驗(yàn)L9（34）結(jié)果Table 3 Results of L9(34) orthogonal array design for optimization of camel milk protein hydrolysis by alcalase

表4 木瓜蛋白酶水解駝乳蛋白正交試驗(yàn)L9（34）結(jié)果Table 4 Results of L9(34) orthogonal array design for optimization of camel milk protein hydrolysis by papain

如表3、4所示，堿性蛋白酶水解駝乳蛋白的實(shí)際最優(yōu)組合為A2B1C2D3，即酶用量5%、酶解溫度55 ℃、酶解pH 7.5、酶解時(shí)間2.5 h，水解度達(dá)64.43%；木瓜蛋白酶水解駝乳蛋白的實(shí)際最優(yōu)組合為A3B1C3D2，即酶用量6%、酶解溫度55 ℃、酶解pH 7.0、酶解時(shí)間2 h，水解度達(dá)62.95%。

堿性蛋白酶水解駝乳蛋白的理論最優(yōu)水平組合為A2B2C3D3，即酶用量5%、酶解溫度60 ℃、酶解pH 8.0、酶解時(shí)間2.5 h；木瓜蛋白酶水解駝乳蛋白的理論最優(yōu)組合為A1B1C3D2，即酶用量4%、酶解溫度55 ℃、酶解pH 7.0、酶解時(shí)間2 h。堿性蛋白酶水解駝乳蛋白的極差結(jié)果得出RA＞RB＞RD＞RC，即影響水解度因素的主次關(guān)系為酶用量＞酶解溫度＞酶解時(shí)間＞酶解pH值；木瓜蛋白酶水解駝乳蛋白極差結(jié)果得出RA＞RC＞RB＞RD，即影響水解度因素的主次關(guān)系為酶用量＞酶解pH值＞酶解溫度＞酶解時(shí)間。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，理論最優(yōu)水平組合所得酶解產(chǎn)物測(cè)得的蛋白質(zhì)水解度高于實(shí)際最優(yōu)水平組合，所以堿性蛋白酶水解駝乳蛋白的最佳工藝組合為A2B2C3D3，木瓜蛋白酶水解駝乳蛋白的最佳工藝組合為A1B1C3D2。

2.3 α-淀粉酶的抑制作用

圖5 JX、MG和駝乳蛋白質(zhì)量濃度對(duì)α-淀粉酶抑制率的影響Fig. 5 α-Amylase inhibitory effects of different concentrations of JX,MG and camel milk protein

碳水化合物的分解是引起餐后血糖升高的主要原因，控制餐后血糖可有效預(yù)防糖尿病。α-淀粉酶是碳水化合物分解的關(guān)鍵酶，可隨機(jī)水解淀粉等碳水化合物內(nèi)部的α-1,4-糖苷鍵，將淀粉類物質(zhì)分解。因此可以通過(guò)抑制其酶促反應(yīng)減少葡萄糖的生成，從而防止血糖濃度的升高[21-22]。如圖5所示，隨著樣品質(zhì)量濃度的升高，α-淀粉酶的抑制率先升高后趨于平緩。這是由于樣品質(zhì)量濃度的增加，與α-淀粉酶結(jié)合的有效肽段增多，因而抑制作用越來(lái)越強(qiáng)。隨后樣品質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，有效肽段與α-淀粉酶的結(jié)合達(dá)到了飽和，再增加樣品質(zhì)量濃度對(duì)于抑制效果并不明顯[23]。JX、MG和駝乳蛋白對(duì)α-淀粉酶的IC50分別為0.027、0.026 mg/mL和0.089 mg/mL。駝乳多肽的IC50值低于駝乳蛋白，表明駝乳蛋白被酶解后，生成了有效的生物活性肽，從而使抑制α-淀粉酶的作用增加，這與Mudgil等[24]研究的結(jié)果相同。相比于JX，MG的IC50值更低，對(duì)α-淀粉酶的抑制作用更強(qiáng)，表明MG產(chǎn)生了更為有效的α-淀粉酶抑制活性肽。由于蛋白酶種類和水解條件的差異，可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)更大程度水解成一些無(wú)效的短肽和游離氨基酸，從而使JX的α-淀粉酶抑制活性偏低[25]。Jan等[6]研究發(fā)現(xiàn)綿羊乳酪蛋白水解3 h時(shí)，α-淀粉酶抑制活性升高，而水解5 h后α-淀粉酶抑制活性降低。后續(xù)Ngoh等[26]也發(fā)現(xiàn)用復(fù)合蛋白酶水解黑白斑豆1 h可改善α-淀粉酶抑制活性，而水解1.5 h后α-淀粉酶抑制活性降低。因此，木瓜蛋白酶更適合制備α-淀粉酶抑制活性肽。

2.4 SDS-PAGE結(jié)果

圖6 JX、MG和駝乳蛋白的SDS-PAG結(jié)果Fig. 6 SDS-PAGE profiles of JX, MG and camel milk protein

如圖6所示，大多數(shù)駝乳蛋白在水解后都被降解成SDS-PAGE無(wú)法檢測(cè)到的小分子肽段。JX和MG都有不明顯的κ-酪蛋白條帶，說(shuō)明這2 種蛋白酶對(duì)κ-酪蛋白的降解能力有限，且κ-酪蛋白含量較高。對(duì)于α-乳白蛋白，木瓜蛋白酶有一定程度的水解作用，而堿性蛋白酶都對(duì)α-乳白蛋白有一定的抗性。相對(duì)來(lái)說(shuō)，由于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)不同，酪蛋白和α-乳白蛋白都比較難水解。酪蛋白的水解是隨機(jī)且靈活的，而α-乳白蛋白的肽段分裂位置藏在較深的桶狀結(jié)構(gòu)中，導(dǎo)致蛋白酶對(duì)它們表現(xiàn)出較差的降解能力[24]。酶解后的產(chǎn)物在10 kDa以下的條帶顏色較深且連續(xù)，說(shuō)明駝乳蛋白已經(jīng)水解成多肽，酶解很徹底?？偟膩?lái)說(shuō)，酪蛋白和α-乳白蛋白較其他蛋白難降解，木瓜蛋白酶較堿性蛋白酶更容易水解蛋白質(zhì)，這與Salami等[27]的研究一致。

2.5 駝乳多肽的氨基酸組成

如表5所示，在駝乳蛋白中，谷氨酸、亮氨酸和脯氨酸的含量普遍較高，與伊日貴等[28]的研究結(jié)果一致。從整體上看，酶解前后游離氨基酸的含量變化不大，可能是因?yàn)槊附庵荒軐⒌鞍踪|(zhì)水解成長(zhǎng)短不一的肽段，而不能極大地改變酶解產(chǎn)物中游離氨基酸的含量。由于蛋白酶種類的不同，對(duì)蛋白質(zhì)的作用位點(diǎn)不同，因而可以產(chǎn)生不同的酶解產(chǎn)物，導(dǎo)致JX和MG的氨基酸組成有所區(qū)別。MG中除絲氨酸和纈氨酸外，其余15 種氨基酸、總氨基酸含量都高于JX，說(shuō)明MG水解更完全。有研究發(fā)現(xiàn)，淀粉酶有許多芳香族氨基酸殘基，這些殘基會(huì)與多肽中的芳香族氨基酸殘基（苯丙氨酸、酪氨酸）結(jié)合，形成氫鍵、靜電和范德瓦爾斯作用，使得多肽和酶之間產(chǎn)生芳香族氨基酸和芳香族氨基酸的相互作用，這與α-淀粉酶的抑制活性密切相關(guān)[29]。MG的芳香族氨基酸含量稍高于JX，說(shuō)明MG的α-淀粉酶抑制活性偏高與其芳香族氨基酸有一定關(guān)系。

表5 JX、MG和駝乳蛋白的氨基酸組成Table 5 Amino acid composition of JX, MG and camel milk protein

2.6 駝乳多肽的分子質(zhì)量分布

MALDI-TOF-MS是一種新型軟電離質(zhì)譜技術(shù)，可直接應(yīng)用于混合物的分析，測(cè)定其絕對(duì)的分子質(zhì)量，具有準(zhǔn)確、快速、靈敏度高和檢測(cè)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于眾多領(lǐng)域[30]。本實(shí)驗(yàn)在正離子檢測(cè)模式下，利用反射方式（0～5 000 Da）和線性方式（5 000～10 000 Da）對(duì)2 種駝乳多肽進(jìn)行分子質(zhì)量的測(cè)定。如圖7、8所示，JX和MG都表現(xiàn)出很好的水解效果，其中MG的洗脫峰更多，水解程度高于JX。JX和MG分子質(zhì)量分布如圖9所示，MG的分子質(zhì)量主要集中在400～2 000 Da，JX的分子質(zhì)量主要集中在400～3 000 Da。MG分子質(zhì)量在400～1 000 Da范圍內(nèi)肽段最多，所占比例高達(dá)68.29%，明顯高于其他分子質(zhì)量范圍，說(shuō)明木瓜蛋白酶相比于復(fù)合蛋白酶水解駝乳蛋白可以得到更多的小分子肽。

圖7 反射方式（A）和線性方式（B）下JX的分子質(zhì)量質(zhì)譜圖Fig. 7 Mass spectra showing molecular mass of JX in reflection mode (A) and linear mode (B)

圖8 反射方式（A）和線性方式（B）下MG的分子質(zhì)量質(zhì)譜圖Fig. 8 Mass spectra showing molecular mass of MG in reflection mode (A) and linear mode (B)

圖9 JX和MG的分子質(zhì)量分布（0～10 kDa）Fig. 9 Molecular mass distribution of JX and MG (0–10 kDa)

2.7 駝乳多肽鑒定結(jié)果

表6 JX和MG中被鑒定的多肽及蛋白信息Table 6 Information about the identified peptides and proteins in JX and MG

JX和MG鑒定出的肽段在UniProt Camelidae數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)。表6表明，JX鑒定出110 種肽段，共計(jì)147 條肽段，對(duì)應(yīng)16 種蛋白，主要來(lái)源于酪蛋白，可達(dá)50.91%，分子質(zhì)量主要集中在900～2 800 Da。MG鑒定出69 種肽段，共計(jì)81 條肽段，對(duì)應(yīng)13 種蛋白，主要來(lái)源于酪蛋白，可達(dá)68.12%，分子質(zhì)量主要集中在900～2 600 Da。經(jīng)過(guò)不同的蛋白酶處理，獲得不同序列和大小的肽段以及分解蛋白質(zhì)的來(lái)源也不同。由圖10可以看出，JX和MG有19 種相同肽段，JX和MG的差異性肽段分別有91 和50 種?；赑eptide Ranker評(píng)分大于0.80的標(biāo)準(zhǔn)，篩選潛在的生物活性肽[31]，見(jiàn)表7。JX篩選出1 條肽段HAGPTWNPISIGISFM，MG篩選出2 條肽段IPLPLPLPLP和LPLPLPLR。由于堿性蛋白酶主要作用于C-末端的芳香族或疏水性氨基酸[32]，酶切范圍較廣，易被水解，獲得的肽段序列比較復(fù)雜，而木瓜蛋白酶則主要作用于蛋白質(zhì)N-末端的疏水性氨基酸殘基[33]，水解后疏水性基團(tuán)暴露，導(dǎo)致肽序中含有較多的亮氨酸（L）和脯氨酸（P），MG有較高的α-淀粉酶抑制活性可能與此有關(guān)。篩選出的3 條肽段在數(shù)據(jù)庫(kù)（BIOPEP、PeptideDB、SwePep和EROPMoscow）中搜索無(wú)記錄，表明發(fā)現(xiàn)了新的生物活性肽，這為駝乳蛋白在防治糖尿病方面提供了新的依據(jù)。

圖10 JX和MG差異性肽段Venn圖Fig. 10 Venn diagram of differential peptides between JX and MG

表7 JX和MG中Peptide Ranker評(píng)分大于0.80的肽段Table 7 Selected peptides derived from JX and MG from Peptide Ranker score 0.80

2.8 合成肽的分析和驗(yàn)證

采用固相合成法合成了3 條新發(fā)現(xiàn)的肽段，并驗(yàn)證了潛在α-淀粉酶抑制活性相似序列合成肽的效價(jià)。如圖11A1、B1、C1所示，出峰時(shí)間穩(wěn)定、峰形對(duì)稱、基線平穩(wěn)，純度都大于95%。如圖11A2、B2、C2所示，各肽的分子質(zhì)量測(cè)定值與其理論值相近，合成結(jié)果可靠，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表8。HAGPTWNPISIGISFM、IPLPLPLPLP和LPLPLPLR三條肽的α-淀粉酶的IC50分別為0.067、0.039 mg/mL和0.041 mg/mL，都低于與之對(duì)應(yīng)的酶解產(chǎn)物，造成這樣結(jié)果的原因可能是合成肽僅為單一肽，而酶解產(chǎn)物中是多種混合肽的共同作用；合成肽的氨基酸序列和分子質(zhì)量雖然與天然肽相近，但空間結(jié)構(gòu)有所不同；此外合成過(guò)程中一些毒性物質(zhì)的影響，也會(huì)對(duì)活性造成一定的破壞。HAGPTWNPISIGISFM的活性相對(duì)較低，IPLPLPLPLP和LPLPLPLR的活性相差不大，說(shuō)明α-淀粉酶抑制活性與疏水性氨基酸有關(guān)，主要是亮氨酸和脯氨酸，驗(yàn)證了氨基酸序列與活性的相關(guān)性。

圖113 條多肽的LC-MS圖Fig. 11 Liquid chromatograms and mass spectra of 3 peptides

表8 合成肽的色譜、質(zhì)譜信息及α-淀粉酶的IC50Table 8 Chromatographic and mass spectrographic information of synthetic peptides and their IC50 against α-amylase

3 結(jié) 論

駝乳因其潛在的健康效益而受到科學(xué)界的關(guān)注。在本研究中，發(fā)現(xiàn)駝乳蛋白是生物活性肽的潛在來(lái)源，具有抑制與糖尿病相關(guān)的關(guān)鍵代謝酶的潛力。還觀察到用于產(chǎn)生生物活性肽的蛋白酶的類型和酶解時(shí)間對(duì)產(chǎn)生的肽的生物活性有深刻的影響。利用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解駝乳蛋白，都提高了α-淀粉酶的抑制活性，但I(xiàn)C50值有所不同，從而證實(shí)了用特異性蛋白酶控制水解的重要性。不同蛋白酶水解駝乳蛋白可產(chǎn)生不同的肽段，但JX和MG中鑒定的肽段分解的主要源蛋白相同。其中IPLPLPLPLP和LPLPLPLR可認(rèn)為是最有效的α-淀粉酶抑制活性肽，驗(yàn)證了肽段的氨基酸序列與α-淀粉酶抑制活性有一定的關(guān)系。為了將所制得的活性肽應(yīng)用到實(shí)際生活中，今后的工作還需要對(duì)肽的消化穩(wěn)定性、生物安全性以及體內(nèi)模型的α-淀粉酶抑制活性進(jìn)行進(jìn)一步研究。