• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    Nisin、?-聚賴氨酸、pH值對(duì)蝦源枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面模型構(gòu)建與評(píng)價(jià)

    2020-12-13 08:09:52郭全友李保國(guó)姜朝軍
    食品科學(xué) 2020年22期
    關(guān)鍵詞:枯草芽孢概率

    郭全友,劉 玲,,李保國(guó),楊 絮,姜朝軍

    (1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所,上海 200090;2.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院,上海 200093)

    熟制水產(chǎn)品通常是以魚(yú)類(lèi)、甲殼類(lèi)、貝類(lèi)、軟體類(lèi)、棘皮類(lèi)等動(dòng)物性水產(chǎn)品為主要原料,經(jīng)蒸、煮、烘烤、油炸等加熱熟制過(guò)程制成的直接食用的水產(chǎn)加工品,在加工過(guò)程中自原料、預(yù)處理、熟制或滅菌、包裝等工藝難以將芽孢桿菌完全殺滅,即使經(jīng)過(guò)高溫殺菌的食品,可能因殘存芽孢桿菌和孢子萌發(fā)而受到污染。枯草芽孢桿菌耐高溫,極端條件下還可被誘導(dǎo)產(chǎn)生抗逆性很強(qiáng)的內(nèi)源孢子[1],孢子的萌發(fā)為食品安全埋下隱患??莶菅挎邨U菌常存在于烤腸、對(duì)蝦或鮑汁等熟制水產(chǎn)品中[1-3]。陳曉等[1]在酸臭的蒜蓉烤腸中檢出枯草芽孢桿菌,發(fā)現(xiàn)該菌滋生與原料、設(shè)備、加工和二次滅菌等關(guān)鍵控制點(diǎn)均密切相關(guān)。鄭瑞生[3]發(fā)現(xiàn),枯草芽孢桿菌感染的鮑魚(yú)無(wú)明顯惡臭和黑變特征,但存在部分流汁和酸敗現(xiàn)象,其分泌的酶類(lèi)物質(zhì)可能是其變質(zhì)的重要因素。鄭麗君等[4]通過(guò)測(cè)定免泡豆桿中腐敗代謝產(chǎn)物(揮發(fā)性鹽基氮)的產(chǎn)量因子為35.38 mg/100 g,確定枯草芽孢桿菌是致腐能力較強(qiáng)的腐敗菌之一。表明枯草芽孢桿菌是熟制水產(chǎn)品中被檢出常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌,因而抑制其生長(zhǎng)對(duì)保障食品質(zhì)量安全至關(guān)重要。

    預(yù)測(cè)微生物學(xué)是食品微生物學(xué)領(lǐng)域中一種有效的預(yù)測(cè)工具,可定量描述環(huán)境因子(溫度、pH值、水分活度等)與微生物(如致病菌和腐敗菌)生長(zhǎng)的關(guān)系,在食品貨架期預(yù)測(cè)及安全質(zhì)量管理中具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值[5]。預(yù)測(cè)微生物模型分為初級(jí)模型、二級(jí)模型和三級(jí)模型,經(jīng)驗(yàn)?zāi)P秃屠碚撃P?,?dòng)力學(xué)模型及概率模型等[6]。20世紀(jì)90年代以來(lái),動(dòng)力學(xué)模型是預(yù)測(cè)微生物學(xué)的研究重點(diǎn),能較好描述微生物生長(zhǎng)與環(huán)境因子之間的關(guān)系,但不能對(duì)微生物的非生長(zhǎng)狀況進(jìn)行定量表述[7]。微生物生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)模型可定量描述不同因子作用下微生物生長(zhǎng)的可能性(或概率),獲知其生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)信息,為食品保藏和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供一種有效工具[8]。目前微生物的生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)模型有確定性方法[9]、Logistic回歸法[10]、最小凸多面體法[11]、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法[12]、簡(jiǎn)化式法[13]等。Logistic回歸模型具有模型擬合度高、表達(dá)直觀、應(yīng)用方便等優(yōu)點(diǎn),更適合多種控制因子不同水平生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)模型的建立。研究者多采用改變溫度、pH值、水分活度及NaCl等環(huán)境因子控制微生物的生長(zhǎng)[8,14-15],目前,通過(guò)生物因子(如乳酸鏈球菌肽(Nisin)、?-聚賴氨酸(?-polylysine,?-PL))與環(huán)境因子的交互作用定量調(diào)控生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)狀況逐漸引起關(guān)注,如Boziaris等[16]研究了NaCl、KCl、pH值及Nisin對(duì)單核細(xì)胞性李斯特菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)邊界的影響,Na等[17]研究?-PL和殼聚糖涂層對(duì)冷藏蝦質(zhì)量及其微生物群生長(zhǎng)的影響。相關(guān)研究表明[18]Nisin對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌具有較強(qiáng)抑制作用,其機(jī)理表現(xiàn)為對(duì)菌體凈表面電荷改變、疏水性變化、磷脂組成改變、膜脂肪酸組成的變化、細(xì)胞壁增厚或蛋白水解等起重要作用;?-PL是一種對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌及霉菌均有抑制作用的天然防腐劑,且對(duì)細(xì)菌的抑制作用強(qiáng)于霉菌,尤其對(duì)枯草芽孢桿菌等抑制作用較明顯[19],同時(shí)有研究[20]發(fā)現(xiàn)Nisin具有依賴于pH值的即時(shí)性殺菌效果,其殺菌效果隨pH值的降低而增加。

    目前針對(duì)枯草芽孢桿菌在Nisin、?-PL和pH值交互作用下生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面模型與效應(yīng)評(píng)價(jià)少見(jiàn)報(bào)道,本研究以源自熟制南美白對(duì)蝦優(yōu)勢(shì)腐敗菌枯草芽孢桿菌為研究對(duì)象,在37 ℃通過(guò)pH值、Nisin及ε-PL交互作用對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)概率產(chǎn)生影響,用Logistic回歸模型建立該交互作用下生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)模型,對(duì)其擬合優(yōu)度和適用性進(jìn)行評(píng)估及驗(yàn)證,分析比較3 種抑菌因子對(duì)枯草芽孢桿菌的交互作用,以期為優(yōu)化熟制水產(chǎn)品生產(chǎn)工藝、定量預(yù)測(cè)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)情況狀況提供一種有效手段。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    真空包裝熟制對(duì)蝦蝦仁采購(gòu)于寧德市某水產(chǎn)公司,在其貨架期終點(diǎn)時(shí)分離純化出優(yōu)勢(shì)菌株,經(jīng)MIDI脂肪酸鑒定、BIOLOG微生物鑒定和16S rRNA測(cè)序(序列號(hào):KU570452.1)鑒定為枯草芽孢桿菌[21-22],凍干,4 ℃貯藏,待用。

    0.01 mol/L HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液 深圳市博材達(dá)科技有限公司;營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、氯化鈉 上海市國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;Nisin 浙江新銀象生物工程有限公司;?-PL 鄭州博研生物科技有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Bioscreen C微生物生長(zhǎng)測(cè)定儀 芬蘭Oy Growth Curves Ab有限公司;PHS-3C pH計(jì) 上海雷磁儀器廠;SW-CJ-1FB潔凈工作臺(tái) 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;ZM-100反壓蒸煮消毒鍋 廣州標(biāo)際包裝設(shè)備有限公司;ZHWY-200H恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;低溫培養(yǎng)箱 日本三洋公司。

    1.3 方法

    1.3.1 生長(zhǎng)介質(zhì)的制備

    設(shè)計(jì)多因子交互試驗(yàn),使用營(yíng)養(yǎng)肉湯作為培養(yǎng)介質(zhì)。參考GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》及相關(guān)文獻(xiàn)[23],Nisin在熟制水產(chǎn)品中限量≤0.5 g/kg,?-PL在熟肉制品中限量≤0.25 g/kg 。?-PL及Nisin溶液梯度皆設(shè)置為0、20、60、100、140、180 μg/mL共6 個(gè)水平??莶菅挎邨U菌及孢子在3.0~10.0的pH值范圍內(nèi)具有耐受性[24-25],考慮到產(chǎn)品特性,參考GB 4789.26—2013《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 商業(yè)無(wú)菌檢驗(yàn)》低酸性食品與酸性食品界定為pH 4.6,取pH 4.0、4.6、5.0、6.0、7.0共5 個(gè)水平。參考文獻(xiàn)[10,12]選取144 例數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集,36 例數(shù)據(jù)作為驗(yàn)證集,試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

    表1 交互試驗(yàn)訓(xùn)練集與驗(yàn)證集設(shè)計(jì)Table 1 Design of training and validation set for interactiom experiments

    1.3.2 菌懸液的制備及接種

    菌株活化:取枯草芽孢桿菌接種于無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯中,振蕩30 s,37 ℃培養(yǎng)24 h,在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中劃線得到單菌落。

    菌懸液制備:挑取單菌落,接種到10 mL無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯中,37 ℃培養(yǎng)18 h,取1 mL培養(yǎng)液至9 mL無(wú)菌生理鹽水中得到10-1菌懸液,逐級(jí)稀釋?zhuān)瞥?0-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度菌懸液,各取0.1 mL涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板,37 ℃培養(yǎng)48 h,選取菌量約105CFU/mL菌懸液作為接種液。

    調(diào)節(jié)過(guò)pH值、ε-PL質(zhì)量濃度的營(yíng)養(yǎng)肉湯溶液經(jīng)121 ℃滅菌處理,無(wú)菌條件下調(diào)節(jié)Nisin至所需質(zhì)量濃度,每孔180 μL接入200微孔板中,取105CFU/mL 的接種液20 μL,確定最終接種液濃度為3.8×104CFU/mL ,接種入孔,每個(gè)條件10 組平行,1 個(gè)空白,微生物生長(zhǎng)測(cè)定儀中速振蕩25 ℃培養(yǎng),7 d內(nèi)每隔1 h測(cè)其OD600nm值。

    1.3.3 生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面的判別

    實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),微孔中出現(xiàn)明顯混濁或沉淀物且OD值讀數(shù)大于3×空白值(0.10左右)則判定枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)[10,12,26],當(dāng)OD值∈(0.10,0.30)或?qū)π】字芯鷳乙簻啙岫葻o(wú)法判定時(shí),通過(guò)涂布營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板證明,出現(xiàn)該菌典型菌落形態(tài),且菌數(shù)大于初始菌量0.5(lg(CFU/mL))時(shí)[14],則確定枯草芽孢桿菌生長(zhǎng),否則確定為不生長(zhǎng)。當(dāng)結(jié)果確定枯草芽孢桿菌生長(zhǎng),記為“1”,反之則記為“0”。

    1.3.4 生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)模型構(gòu)建與驗(yàn)證

    1.3.4.1 Logistic模型構(gòu)建

    Ratkowsky等[27]提出了簡(jiǎn)單Logistic回歸模型,其能夠在一個(gè)或多個(gè)生長(zhǎng)控制因子和添加劑的情況下,擬合菌株生長(zhǎng)與非生長(zhǎng)之間的邊界,通過(guò)預(yù)測(cè)微生物學(xué)概率及動(dòng)力學(xué)方面的整合,從而應(yīng)用于預(yù)測(cè)食品微生物學(xué)中,選取144 例數(shù)據(jù)為訓(xùn)練集用以構(gòu)建模型。

    式(1)中:Logit(P)=ln[P/(1-P)];P為枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)概率;ai(i=0~3)為擬合參數(shù);Nisin、ε-PL均表示質(zhì)量濃度/(μg/mL)。式(2)同。

    多項(xiàng)式Logistic回歸模型是一種建立在一個(gè)多項(xiàng)式的邏輯回歸模型的算法,可避免對(duì)大系數(shù)的過(guò)度擬合[12]:

    式(2)中:bi(i=0~9)為擬合參數(shù)。

    1.3.4.2 模型評(píng)價(jià)與驗(yàn)證

    模型評(píng)價(jià):評(píng)價(jià)指標(biāo)主要包括R2-Nagelkerke和Hosmer-Lemeshow。Hosmer-Lemeshow測(cè)試常用來(lái)評(píng)估模型的擬合優(yōu)度及任意數(shù)量的連續(xù)與分散的解釋變量,其值越小擬合效果越好。R2-Nagelkerke值主要反映了解釋變量與響應(yīng)變量間的關(guān)系,其值越接近1,擬合優(yōu)度越好[12]。預(yù)測(cè)正確率(fraction correct,F(xiàn)C)是指預(yù)測(cè)值與實(shí)際值一致樣本占總樣本數(shù)量的百分比,可用來(lái)評(píng)價(jià)模型預(yù)測(cè)精度[28]。

    模型驗(yàn)證:選取表1中36 例驗(yàn)證集,代入建立的Logistic模型中,采用C-matrix獲得FC,驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確度。

    式(3)中:FC=(a+d)/(a+b+c+d)。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    模型擬合通過(guò)SPSS 18.0(美國(guó)IBM公司),并通過(guò)Origin 9.0(美國(guó)OriginLab公司)繪制生長(zhǎng)概率等高線圖(選取概率Pi(i=1~9)為0.1~0.9時(shí)的預(yù)測(cè)值)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)模型構(gòu)建及驗(yàn)證

    2.1.1 Logistic回歸模型構(gòu)建及評(píng)價(jià)

    枯草芽孢桿菌2 種生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)模型的擬合參數(shù)見(jiàn)表2。采用簡(jiǎn)單Logistic回歸模型,pH值、ε-PL與Nisin對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)影響顯著(P<0.05);采用多項(xiàng)式Logistic回歸模型,pH值、ε-PL與Nisin對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)影響亦顯著(P<0.05)。

    簡(jiǎn)單Logistic回歸模型:

    多項(xiàng)式Logistic回歸模型:

    表2 Logistic模型擬合參數(shù)及擬合優(yōu)度比較Table 2 Comparison of parameters and goodness of fit between simple and polynomial Logistic models

    表3 兩種模型擬合優(yōu)度評(píng)價(jià)和驗(yàn)證Table 3 Goodness of fit evaluation and verification of simple and polynomial Logistic models

    表3 為兩種模型擬合優(yōu)度評(píng)價(jià)。R2-Nagelkerke是評(píng)價(jià)模型擬合度的指標(biāo);Hosmer-Lemeshow檢驗(yàn)表明,測(cè)試P值越大,χ2值越小,模型擬合優(yōu)度越高[28]。由表3可知,多項(xiàng)式Logistic模型的R2-Nagelkerke為0.91,高于簡(jiǎn)單Logistic模型R2-Nagelkerke為0.79,說(shuō)明多項(xiàng)式Logistic模型擬合優(yōu)度高于簡(jiǎn)單Logistic模型,枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)擬合效果更好。比較Hosmer-Lemeshow結(jié)果亦得出,多項(xiàng)式Logistic模型(χ2=0.76,P=1)擬合效果優(yōu)于簡(jiǎn)單Logistic模型(χ2=2.00,P=0.981),多項(xiàng)式Logistic模型擬合效果優(yōu)于簡(jiǎn)單Logistic模型。

    2.1.2 生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)模型的驗(yàn)證

    FC一般用以反映模型的預(yù)測(cè)能力,通常作為模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度的評(píng)價(jià)指標(biāo),反映預(yù)測(cè)值和實(shí)際值的一致性[14]。由表3可見(jiàn),簡(jiǎn)單Logistic模型訓(xùn)練集FC為65.2%,驗(yàn)證集FC為61.8%,訓(xùn)練集和驗(yàn)證集的FC較接近,但FC較低,說(shuō)明該模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度較低。多項(xiàng)式Logistic模型的訓(xùn)練集和驗(yàn)證集的FC分別為87.4%和84.1%,兩者較接近,對(duì)于同一性質(zhì)的數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度較高。從驗(yàn)證集看,F(xiàn)C值越高,代表模型對(duì)驗(yàn)證集的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度較高。

    2.2 環(huán)境因子對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)的作用

    2.2.1 Nisin對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)的作用

    圖1 不同Nisin質(zhì)量濃度下枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面圖Fig. 1 Growth/no growth boundaries at different concentrations of nisin for B. subtilis

    圖1 為Nisin對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)概率的影響,根據(jù)模型擬合出生長(zhǎng)概率P為0.1~0.9的分界線,P=1表明該條件下適宜生長(zhǎng);P=0說(shuō)明該區(qū)域條件下Nisin、?-PL和pH值的交互作用對(duì)枯草芽孢桿菌有較好的抑制作用,該條件下不適宜生長(zhǎng)。隨著Nisin質(zhì)量濃度增加,枯草芽孢桿菌非生長(zhǎng)區(qū)變大,其生長(zhǎng)受到抑制,Nisin質(zhì)量濃度對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)情況影響顯著(P<0.05)。

    圖1 a~c中,根據(jù)非生長(zhǎng)區(qū)大小可知,Nisin質(zhì)量濃度≤60 μg/mL時(shí),Nisin對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面的影響較小,?-PL質(zhì)量濃度越高則生長(zhǎng)區(qū)越小,pH值越接近7.0則生長(zhǎng)區(qū)越大;圖1d~f中,Nisin質(zhì)量濃度大于60 μg/mL時(shí),Nisin是影響枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面的主要因素。隨Nisin質(zhì)量濃度的增加,生長(zhǎng)概率等高線圖逐漸變緩,說(shuō)明pH值與?-PL質(zhì)量濃度的交互作用中pH值的影響減弱,?-PL質(zhì)量濃度的影響增強(qiáng)。無(wú)論?-PL質(zhì)量濃度為何值,Nisin質(zhì)量濃度為60、100、140、180 μg/mL時(shí),枯草芽孢桿菌在pH值分別為4.0、4.25、4.5、5.0時(shí)表現(xiàn)為不生長(zhǎng)。隨pH值增大至7.0,圖1c中Nisin質(zhì)量濃度為60 μg/mL時(shí),生長(zhǎng)概率在?-PL質(zhì)量濃度為90 μg/mL時(shí)達(dá)到0.98;圖1d中Nisin質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí),生長(zhǎng)概率在?-PL質(zhì)量濃度為60 μg/mL時(shí)達(dá)到0.94;圖1e中當(dāng)Nisin質(zhì)量濃度為140 μg/mL時(shí),?-PL質(zhì)量濃度為20 μg/mL,生長(zhǎng)概率為0.92;圖1f中當(dāng)Nisin質(zhì)量濃度達(dá)到180 μg/mL時(shí),生長(zhǎng)概率在?-PL質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)僅為0.40。隨Nisin質(zhì)量濃度增加,生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界限向更高?-PL質(zhì)量濃度、更低pH值方向移動(dòng)。Nisin在本次實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面的影響,其背后機(jī)理可能為Nisin中ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)枯草芽孢桿菌等細(xì)菌起到抗菌作用[29]。枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)區(qū)隨Nisin質(zhì)量濃度的增加而變小,這與Boziaris等[16]研究NaCl、KC、pH值及Nisin對(duì)單核細(xì)胞性李斯特菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)邊界的影響結(jié)果較為相似,其結(jié)果顯示增加Nisin質(zhì)量濃度顯著影響生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面,導(dǎo)致單核細(xì)胞性李斯特菌Scott A非生長(zhǎng)區(qū)增大,Nisin的存在導(dǎo)致單核細(xì)胞性李斯特菌Scott A更受抑制;因此,結(jié)合生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面模型對(duì)調(diào)控Nisin與pH值間的交互作用,以及靶向控制熟制水產(chǎn)品中的腐敗菌具有重要意義。

    2.2.2?-PL對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)的作用

    由圖2可知,與Nisin對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面的作用類(lèi)似,?-PL對(duì)其生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)情況影響顯著,即隨著?-PL質(zhì)量濃度增加,枯草芽孢桿菌非生長(zhǎng)區(qū)變大,其生長(zhǎng)受到抑制越強(qiáng)。由圖2可知,隨?-PL質(zhì)量濃度的增加,生長(zhǎng)概率等高線圖也逐漸變緩,說(shuō)明pH值與Nisin質(zhì)量濃度交互作用中Nisin占主導(dǎo)作用,且Nisin與?-PL的交互作用增強(qiáng)。無(wú)論Nisin質(zhì)量濃度為何值,?-PL質(zhì)量濃度為60、100、140、180 μg/mL時(shí),枯草芽孢桿菌在pH值分別為4.0、4.5、4.75、5.25時(shí)生長(zhǎng)概率為0。隨pH值增大至7.0,圖2c中當(dāng)?-PL質(zhì)量濃度為60 μg/mL時(shí),生長(zhǎng)概率在Nisin質(zhì)量濃度為90 μg/mL時(shí)達(dá)到0.97;圖2d中當(dāng)?-PL質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí),生長(zhǎng)概率在Nisin質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)達(dá)到0.98;圖2e中當(dāng)?-PL質(zhì)量濃度為140 μg/mL時(shí),Nisin質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí),生長(zhǎng)概率為0.97;圖2f中當(dāng)?-PL質(zhì)量濃度達(dá)到180 μg/mL時(shí),生長(zhǎng)概率在Nisin質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)僅為0.73。若?-PL質(zhì)量濃度不斷增加,生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界限向更高Nisin質(zhì)量濃度、更低pH值方向移動(dòng)。綜上,?-PL對(duì)枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出較好的抑制作用,與蔡瑞等[30]研究得出?-PL對(duì)芽孢桿菌屬具有顯著抑制效果結(jié)論相似,當(dāng)添加量為最小抑菌質(zhì)量濃度(1.25~5 mg/L)時(shí),對(duì)芽孢桿菌屬菌數(shù)減少量為1~2 個(gè)數(shù)量級(jí),與Sun Haitao等[31]通過(guò)澆鑄法將Nisin(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%~0.5%)和?-PL(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%)摻入玉米磷酸二淀粉/納米纖維素薄膜中制備抑菌生物納米復(fù)合薄膜,結(jié)果表明結(jié)合Nisin和?-PL的納米纖維素薄膜生物納米復(fù)合膜對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌)和革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)具有協(xié)同抑菌活性也較為一致。?-PL作用機(jī)理主要呈現(xiàn)為導(dǎo)致細(xì)菌質(zhì)壁分離,菌體塌陷及細(xì)胞質(zhì)溢出等現(xiàn)象[19],而?-PL與Nisin、pH值交互作用下對(duì)枯草芽孢桿菌的內(nèi)在抑菌機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

    圖2 不同?-PL質(zhì)量濃度下枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面圖Fig. 2 Growth/no growth boundaries at different concentrations of ?-polylysine for B. subtilis

    2.2.3 pH值對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)的作用

    由圖3可知,pH值由7.0逐漸調(diào)至4.0,枯草芽孢桿菌非生長(zhǎng)區(qū)逐步擴(kuò)大,pH值抑制作用增強(qiáng)。當(dāng)pH值低于5.0,枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)受到強(qiáng)烈抑制(非生長(zhǎng)區(qū)/生長(zhǎng)區(qū)>1)。圖3a中,當(dāng)pH值為4.0時(shí),pH值是影響枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的主要因素;圖3b~d中,當(dāng)pH≥5.0時(shí),Nisin與?-PL的交互作用影響加強(qiáng)。同時(shí),隨pH值的升高,生長(zhǎng)概率等高線逐漸變陡,可能是Nisin與?-PL的交互作用中,?-PL的影響減小,Nisin的影響增強(qiáng)導(dǎo)致的。pH值對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)情況影響顯著(P>0.05)。pH值越低,Nisin與?-PL的交互作用被減弱,枯草芽孢桿菌越不適宜生長(zhǎng),生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界限開(kāi)始變化點(diǎn)向低濃度生物因子(Nisin與?-PL)范圍移動(dòng)。

    圖3 不同p值下枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面圖Fig. 3 Growth/no growth boundaries at different pH for B. subtilis

    pH值下降會(huì)改變細(xì)胞膜通透性[26],造成微生物新陳代謝有關(guān)酶失活[32],進(jìn)而導(dǎo)致微生物死亡。有學(xué)者指出pH值對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)和失活等影響顯著,如Balasubramanian等[33]研究了熱-壓力-pH值(4.0~7.0)的交互效應(yīng)下檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液中枯草芽孢桿菌ATCC 6633孢子的失活過(guò)程,結(jié)果顯示當(dāng)孢子分別懸浮在pH 5.0和pH 3.0的緩沖溶液中,孢子數(shù)量能減少約為6 個(gè)和7 個(gè)對(duì)數(shù)值。于枯草芽孢桿菌而言,pH值低于5.0時(shí),Nisin與?-PL的交互作用逐漸受到影響,此時(shí)pH值為影響生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)邊界的主導(dǎo)因素。Vermeulen等[34]研究了pH值、水分活度及乙酸對(duì)單核細(xì)胞性李斯特菌的生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)情況,pH值越小,非生長(zhǎng)區(qū)范圍變大,生長(zhǎng)概率降低,生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面往更低乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0%~0.4%)、更高水分活度(0.960~0.990)方向偏移,這也與本研究結(jié)果一致??紤]到產(chǎn)品安全性及感官品質(zhì)的可接受性,例如為避免水產(chǎn)品或酸性食品中肉毒桿菌中毒的危害,pH 4.6通常被普遍接受為達(dá)到安全劑量的最小值[35];有研究者[15]在調(diào)味軟烤扇貝中發(fā)現(xiàn),pH值在5.7~5.9時(shí),有一定去腥效果且酸感不明顯,而當(dāng)pH值低于5.5時(shí),酸感較顯著。因此,結(jié)合生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面模型,調(diào)節(jié)適當(dāng)pH值并結(jié)合產(chǎn)品感官品質(zhì)特征在熟制水產(chǎn)品的加工及應(yīng)用中也具有一定參考價(jià)值。

    3 結(jié) 論

    研究源自熟制南美白對(duì)蝦的優(yōu)勢(shì)腐敗菌(枯草芽孢桿菌)37 ℃條件下,pH值、Nisin及?-PL的交互作用對(duì)其生長(zhǎng)概率的影響,通過(guò)簡(jiǎn)單Logistic和多項(xiàng)式Logistic方程擬合生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)模型,并對(duì)模型進(jìn)行了評(píng)價(jià)和驗(yàn)證,比較3 種抑菌因子對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)抑制效用,主要結(jié)論如下:1)建立了枯草芽孢桿菌簡(jiǎn)單Logistic和多項(xiàng)式Logistic生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)模型,可預(yù)測(cè)pH值、Nisin及?-PL作用下的枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)概率。簡(jiǎn)單Logistic模型與多項(xiàng)式Logistic模型訓(xùn)練集FC、R2-Nagelkerke及Hosmer-Lemeshow測(cè)試結(jié)果得出,多項(xiàng)式Logistic模型擬合效果優(yōu)于簡(jiǎn)單Logistic模型,表明多項(xiàng)式Logistic生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)模型能更好預(yù)測(cè)pH值、Nisin及?-PL作用下枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)概率。2)隨Nisin質(zhì)量濃度、?-PL質(zhì)量濃度增加或pH值的降低,生長(zhǎng)區(qū)域逐漸減小,非生長(zhǎng)區(qū)域逐漸擴(kuò)大,枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)受到抑制。當(dāng)Nisin質(zhì)量濃度增加,枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界限往更高?-PL質(zhì)量濃度、更低pH值方向移動(dòng)。無(wú)論第3種因子質(zhì)量濃度為何值,當(dāng)Nisin質(zhì)量濃度為60、100、140、180 μg/mL時(shí),枯草芽孢桿菌在pH值分別為4.0、4.25、4.5、5.0時(shí)表現(xiàn)為不生長(zhǎng)。?-PL質(zhì)量濃度為60、100、140、180 μg/mL時(shí),枯草芽孢桿菌在pH值分別為4.0、4.5、4.75、5.25時(shí)生長(zhǎng)概率為0。當(dāng)pH<5.0時(shí),枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)受到較強(qiáng)抑制,此時(shí)pH值是影響枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界限的主要因素。

    綜上,通過(guò)構(gòu)建水產(chǎn)品中腐敗菌/致病菌的生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)模型,在預(yù)測(cè)和控制微生物安全和產(chǎn)品品質(zhì)等方面具有重要參考價(jià)值,為實(shí)際生產(chǎn)中有效預(yù)測(cè)風(fēng)險(xiǎn)概率提供指導(dǎo)。由于水產(chǎn)品原料、加工、流通、銷(xiāo)售過(guò)程中影響因素的復(fù)雜性及不確定性,仍需根據(jù)產(chǎn)品特性和關(guān)鍵控制點(diǎn)導(dǎo)入更多調(diào)控因子,并對(duì)其協(xié)同/拮抗效應(yīng)作進(jìn)一步研究。

    猜你喜歡
    枯草芽孢概率
    第6講 “統(tǒng)計(jì)與概率”復(fù)習(xí)精講
    第6講 “統(tǒng)計(jì)與概率”復(fù)習(xí)精講
    枯草芽孢桿菌在養(yǎng)雞生產(chǎn)中的應(yīng)用
    湖南飼料(2021年4期)2021-10-13 07:32:46
    概率與統(tǒng)計(jì)(一)
    概率與統(tǒng)計(jì)(二)
    解淀粉芽孢桿菌Lx-11
    解淀粉芽孢桿菌的作用及其產(chǎn)品開(kāi)發(fā)
    側(cè)孢短芽孢桿菌A60
    歲末
    30L發(fā)酵罐培養(yǎng)枯草芽孢桿菌產(chǎn)高密度芽孢的研究
    亚洲精品第二区| 日本一区二区免费在线视频| 美国免费a级毛片| 黄片播放在线免费| 制服诱惑二区| 丝袜美腿诱惑在线| 90打野战视频偷拍视频| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 老熟女久久久| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 日本一区二区免费在线视频| 两性夫妻黄色片| 国产91精品成人一区二区三区 | 国产伦理片在线播放av一区| 国产日韩欧美在线精品| 99国产极品粉嫩在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 十八禁高潮呻吟视频| 婷婷成人精品国产| 12—13女人毛片做爰片一| 男人爽女人下面视频在线观看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| av福利片在线| 狠狠狠狠99中文字幕| 少妇精品久久久久久久| 亚洲欧美色中文字幕在线| 一区二区三区激情视频| 91大片在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 久久久欧美国产精品| 18禁观看日本| 一级毛片女人18水好多| 最新的欧美精品一区二区| 亚洲久久久国产精品| 波多野结衣av一区二区av| 美女福利国产在线| 欧美另类一区| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久久久精品国产欧美久久久 | 午夜福利乱码中文字幕| 亚洲欧美一区二区三区久久| 国产片内射在线| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 美女大奶头黄色视频| 精品亚洲成国产av| www日本在线高清视频| 成人国语在线视频| 久久性视频一级片| cao死你这个sao货| 成在线人永久免费视频| 亚洲男人天堂网一区| a 毛片基地| e午夜精品久久久久久久| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产成人免费无遮挡视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 老司机福利观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 麻豆av在线久日| 捣出白浆h1v1| 国产在线一区二区三区精| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲国产av影院在线观看| 麻豆av在线久日| 91av网站免费观看| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产xxxxx性猛交| 亚洲精品一区蜜桃| 丝袜在线中文字幕| 丝袜脚勾引网站| 青春草亚洲视频在线观看| 免费在线观看黄色视频的| 满18在线观看网站| 欧美xxⅹ黑人| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 久久久久久免费高清国产稀缺| 咕卡用的链子| 一级毛片电影观看| av片东京热男人的天堂| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产一卡二卡三卡精品| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲成人手机| 天天影视国产精品| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲天堂av无毛| 中文字幕色久视频| 国产精品1区2区在线观看. | 国产免费现黄频在线看| 操美女的视频在线观看| 脱女人内裤的视频| 婷婷色av中文字幕| 午夜福利一区二区在线看| 日韩人妻精品一区2区三区| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久久久精品国产欧美久久久 | 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 在线天堂中文资源库| 午夜福利在线观看吧| 久久这里只有精品19| 久久国产精品人妻蜜桃| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 91成年电影在线观看| 欧美精品一区二区免费开放| 精品国产乱子伦一区二区三区 | 黄片小视频在线播放| 十八禁网站网址无遮挡| 免费高清在线观看日韩| 午夜免费成人在线视频| 无限看片的www在线观看| 国产成人a∨麻豆精品| 狂野欧美激情性xxxx| av一本久久久久| 咕卡用的链子| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 性色av一级| 午夜免费成人在线视频| 午夜免费观看性视频| 啦啦啦 在线观看视频| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲国产欧美在线一区| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 精品久久久久久久毛片微露脸 | 韩国精品一区二区三区| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 成年人午夜在线观看视频| 一级毛片精品| 午夜福利,免费看| 国产精品久久久人人做人人爽| 叶爱在线成人免费视频播放| 成人国语在线视频| a 毛片基地| 青春草视频在线免费观看| 日韩视频一区二区在线观看| 一进一出抽搐动态| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产在视频线精品| av欧美777| 日本a在线网址| 免费在线观看黄色视频的| 国产高清videossex| 国产精品久久久久久久电影 | 亚洲自偷自拍图片 自拍| 久久婷婷成人综合色麻豆| 在线视频色国产色| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产人伦9x9x在线观看| 一二三四在线观看免费中文在| 黄片小视频在线播放| 1024视频免费在线观看| 一本精品99久久精品77| 日本成人三级电影网站| 舔av片在线| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国内精品久久久久精免费| 国产精品综合久久久久久久免费| 久久久国产精品麻豆| 免费在线观看黄色视频的| 天天一区二区日本电影三级| 色噜噜av男人的天堂激情| 中文字幕熟女人妻在线| 99riav亚洲国产免费| www.熟女人妻精品国产| 精品福利观看| 免费av毛片视频| 丰满的人妻完整版| 日本 欧美在线| 午夜精品在线福利| 国产探花在线观看一区二区| √禁漫天堂资源中文www| 一区二区三区激情视频| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲第一电影网av| 最好的美女福利视频网| 午夜精品在线福利| 国产伦在线观看视频一区| 波多野结衣高清无吗| 久久久久久大精品| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 久久久久性生活片| 搡老熟女国产l中国老女人| 色哟哟哟哟哟哟| 岛国视频午夜一区免费看| 久久久久国内视频| 亚洲av成人精品一区久久| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产黄a三级三级三级人| 一级作爱视频免费观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲片人在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 日本三级黄在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 一二三四社区在线视频社区8| 禁无遮挡网站| www.精华液| 国产一区二区三区视频了| 嫩草影视91久久| 免费看美女性在线毛片视频| 精品日产1卡2卡| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 欧美日韩乱码在线| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产一区二区在线观看日韩 | 日韩av在线大香蕉| 成人亚洲精品av一区二区| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产真人三级小视频在线观看| 男女视频在线观看网站免费 | 久久久久亚洲av毛片大全| 色综合站精品国产| 国产成人欧美在线观看| 国内精品一区二区在线观看| 久久亚洲精品不卡| 毛片女人毛片| 久久久久久久久中文| 老司机靠b影院| 老汉色av国产亚洲站长工具| 午夜老司机福利片| 欧美日韩国产亚洲二区| 精华霜和精华液先用哪个| 叶爱在线成人免费视频播放| 成人亚洲精品av一区二区| 一本综合久久免费| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 亚洲精品久久国产高清桃花| 色av中文字幕| 亚洲色图av天堂| 久久这里只有精品中国| 欧美成狂野欧美在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 大型黄色视频在线免费观看| 久久中文字幕人妻熟女| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产精品国产高清国产av| 午夜福利欧美成人| 久久精品成人免费网站| 观看免费一级毛片| 天天一区二区日本电影三级| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 高清在线国产一区| 两个人的视频大全免费| 舔av片在线| e午夜精品久久久久久久| 一本大道久久a久久精品| 亚洲国产精品999在线| 性色av乱码一区二区三区2| 国产亚洲欧美98| 亚洲专区字幕在线| 国产不卡一卡二| 免费搜索国产男女视频| 窝窝影院91人妻| 精品电影一区二区在线| 1024香蕉在线观看| 这个男人来自地球电影免费观看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 婷婷亚洲欧美| 免费电影在线观看免费观看| 最近在线观看免费完整版| 一级毛片高清免费大全| 日本五十路高清| 国产亚洲精品久久久久5区| 亚洲avbb在线观看| 日本黄色视频三级网站网址| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 日韩有码中文字幕| 在线观看舔阴道视频| 亚洲乱码一区二区免费版| 日本免费a在线| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲色图av天堂| 国产精品,欧美在线| 欧美成狂野欧美在线观看| 免费在线观看日本一区| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 午夜老司机福利片| 99国产精品99久久久久| 午夜两性在线视频| 国产av不卡久久| 99热6这里只有精品| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产在线观看jvid| 高清毛片免费观看视频网站| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 免费av毛片视频| 久久午夜亚洲精品久久| 黄色丝袜av网址大全| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 99在线人妻在线中文字幕| 久久精品国产亚洲av高清一级| 老司机福利观看| 白带黄色成豆腐渣| 日韩欧美三级三区| bbb黄色大片| 亚洲av片天天在线观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 久久久国产成人精品二区| 免费在线观看日本一区| 国产一区在线观看成人免费| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲人成电影免费在线| 久久久久久免费高清国产稀缺| a级毛片在线看网站| 日日夜夜操网爽| 欧美日本亚洲视频在线播放| 男女视频在线观看网站免费 | 亚洲乱码一区二区免费版| 久久精品国产亚洲av高清一级| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产午夜福利久久久久久| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产成人欧美在线观看| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美一级毛片孕妇| 日本成人三级电影网站| 日韩av在线大香蕉| 国产精品野战在线观看| 亚洲国产精品999在线| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | a在线观看视频网站| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产久久久一区二区三区| 国产熟女xx| av在线播放免费不卡| 在线观看午夜福利视频| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 99热只有精品国产| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲电影在线观看av| 欧美一区二区国产精品久久精品 | 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 一a级毛片在线观看| 久久九九热精品免费| 国内精品久久久久精免费| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 人成视频在线观看免费观看| 男女那种视频在线观看| 欧美成人午夜精品| 久久香蕉国产精品| 日本三级黄在线观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产精品av久久久久免费| 欧美另类亚洲清纯唯美| av天堂在线播放| 色播亚洲综合网| 真人做人爱边吃奶动态| 少妇被粗大的猛进出69影院| 久99久视频精品免费| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 天堂√8在线中文| 国产精品亚洲av一区麻豆| 欧美日本视频| 变态另类丝袜制服| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲精品中文字幕在线视频| 老鸭窝网址在线观看| 久久 成人 亚洲| 亚洲片人在线观看| 女警被强在线播放| 免费无遮挡裸体视频| 麻豆国产97在线/欧美 | 麻豆一二三区av精品| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲成av人片免费观看| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲av成人av| 日本在线视频免费播放| av免费在线观看网站| 亚洲无线在线观看| 高清在线国产一区| 男女午夜视频在线观看| 久久久久九九精品影院| 亚洲午夜理论影院| 他把我摸到了高潮在线观看| 性欧美人与动物交配| 黄色成人免费大全| 我要搜黄色片| 真人做人爱边吃奶动态| avwww免费| 久久精品成人免费网站| 国产午夜精品论理片| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 最近在线观看免费完整版| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久精品人妻少妇| 日本 欧美在线| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲专区国产一区二区| 男女之事视频高清在线观看| 波多野结衣巨乳人妻| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 俺也久久电影网| 不卡av一区二区三区| 国产一区二区在线av高清观看| 午夜精品在线福利| 又黄又粗又硬又大视频| 久久这里只有精品中国| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久 成人 亚洲| 一进一出好大好爽视频| 少妇的丰满在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 麻豆成人午夜福利视频| 一区二区三区高清视频在线| 一级作爱视频免费观看| 嫩草影视91久久| 午夜激情福利司机影院| 国产三级中文精品| 国产亚洲欧美98| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲精品在线观看二区| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产真人三级小视频在线观看| 精品久久久久久成人av| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 法律面前人人平等表现在哪些方面| av欧美777| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲激情在线av| 91大片在线观看| 午夜免费观看网址| 夜夜躁狠狠躁天天躁| АⅤ资源中文在线天堂| 波多野结衣巨乳人妻| 黄色视频,在线免费观看| 麻豆一二三区av精品| 变态另类丝袜制服| 欧美高清成人免费视频www| 欧美性猛交黑人性爽| 国产成人av激情在线播放| 久久久国产欧美日韩av| 午夜精品久久久久久毛片777| 搞女人的毛片| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 日本一区二区免费在线视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 一本综合久久免费| 久久这里只有精品中国| 精品午夜福利视频在线观看一区| 999精品在线视频| 久久精品91无色码中文字幕| 又黄又爽又免费观看的视频| 成在线人永久免费视频| 精品国产乱子伦一区二区三区| 婷婷六月久久综合丁香| www国产在线视频色| 成人国产一区最新在线观看| 日本一二三区视频观看| av免费在线观看网站| av视频在线观看入口| 国产1区2区3区精品| 国产高清激情床上av| 欧美中文日本在线观看视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产男靠女视频免费网站| 在线观看午夜福利视频| 国产激情欧美一区二区| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产高清有码在线观看视频 | 天堂影院成人在线观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产av又大| 成年版毛片免费区| 制服丝袜大香蕉在线| 国产成人精品久久二区二区免费| 国产成人系列免费观看| 免费在线观看亚洲国产| 婷婷亚洲欧美| 男女之事视频高清在线观看| 久久久久免费精品人妻一区二区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 91大片在线观看| 亚洲美女视频黄频| 欧美成人免费av一区二区三区| 免费看a级黄色片| 欧美日韩一级在线毛片| 久久精品91蜜桃| 99久久无色码亚洲精品果冻| 黄色a级毛片大全视频| 久久精品人妻少妇| 亚洲黑人精品在线| 欧美一级a爱片免费观看看 | 精品无人区乱码1区二区| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲国产精品成人综合色| 无限看片的www在线观看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 日韩大尺度精品在线看网址| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲成人中文字幕在线播放| 少妇的丰满在线观看| 亚洲国产精品999在线| 国产麻豆成人av免费视频| 动漫黄色视频在线观看| 日韩大码丰满熟妇| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 一二三四在线观看免费中文在| av视频在线观看入口| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 亚洲av熟女| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 在线观看午夜福利视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 精品久久久久久久末码| 免费无遮挡裸体视频| 99国产精品一区二区蜜桃av| 特级一级黄色大片| 亚洲七黄色美女视频| 超碰成人久久| 深夜精品福利| 久久久久精品国产欧美久久久| 两个人免费观看高清视频| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 久久欧美精品欧美久久欧美| 午夜激情福利司机影院| 日本五十路高清| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 欧美一区二区精品小视频在线| 欧美日韩乱码在线| 欧美乱码精品一区二区三区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 丁香六月欧美| 九色成人免费人妻av| 天堂av国产一区二区熟女人妻 | 日本 av在线| 欧美一级毛片孕妇| 搡老岳熟女国产| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产久久久一区二区三区| 在线永久观看黄色视频| 在线国产一区二区在线| videosex国产| 欧美成人午夜精品| 黄片大片在线免费观看| 国产三级在线视频| 性欧美人与动物交配| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 久久午夜亚洲精品久久| 午夜福利高清视频| 免费在线观看亚洲国产| 欧美精品啪啪一区二区三区| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 久久中文看片网| 在线a可以看的网站| 国产成人aa在线观看| 欧美日韩精品网址| 美女免费视频网站| 色精品久久人妻99蜜桃| 在线观看66精品国产| 亚洲国产欧美一区二区综合| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 男女午夜视频在线观看| 国产精华一区二区三区| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产av不卡久久| 成年免费大片在线观看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 日韩欧美在线二视频| 999久久久精品免费观看国产| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲乱码一区二区免费版| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 男女之事视频高清在线观看| 日本熟妇午夜| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲成人中文字幕在线播放| 99国产精品99久久久久| 午夜免费激情av| 亚洲欧美日韩无卡精品| 怎么达到女性高潮| 69av精品久久久久久| 久久精品人妻少妇| 两个人看的免费小视频| 99国产精品一区二区蜜桃av| 午夜福利在线在线| 天堂影院成人在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| av免费在线观看网站| 真人一进一出gif抽搐免费| 欧美乱色亚洲激情| 国产高清有码在线观看视频 | 天堂av国产一区二区熟女人妻 | 免费看十八禁软件| 此物有八面人人有两片| 两人在一起打扑克的视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲国产中文字幕在线视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 在线观看美女被高潮喷水网站 | 国产激情欧美一区二区| 欧美性猛交黑人性爽|