腫瘤靶向治療新抗原篩選與臨床研究進展

費宇翔,趙楊靜，王薈，邵啟祥(江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院.臨床醫(yī)學(xué)系，b.檢驗系，免疫學(xué)與免疫學(xué)檢驗教研室，c.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

近十余年來，腫瘤免疫治療取得了重大進展，免疫檢查點抑制劑[1]、治療性腫瘤疫苗[2]和以嵌合抗原受體T細胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)[3]為代表的過繼性細胞免疫治療在臨床上開展的如火如荼。盡管這些免疫治療在血液系統(tǒng)腫瘤、肺癌等治療中收到了較好的臨床效果，但因缺乏特異性腫瘤抗原以及腫瘤存在多種免疫逃逸機制，許多腫瘤的免疫治療仍然舉步維艱[4]。

腫瘤抗原作為免疫系統(tǒng)識別癌細胞的靶點，是抗腫瘤免疫應(yīng)答的起點，在過繼性細胞免疫治療和腫瘤疫苗的研發(fā)中占據(jù)核心地位。根據(jù)抗原的特異性，腫瘤抗原可分為腫瘤相關(guān)抗原(tumor associated antigens，TAA)和腫瘤特異性抗原(tumor specific antigen，TSA)。大量研究表明，TAA的免疫特異性差，且由于多數(shù)TAA屬于胚胎抗原，在個體發(fā)育過程中已誘導(dǎo)機體的免疫耐受，不僅免疫原性弱，而且很難誘導(dǎo)出持久特異性免疫應(yīng)答。此外，靶向TAA的治療后，可能打破機體的免疫耐受，導(dǎo)致活化的免疫細胞攻擊表達TAA的自身正常組織，從而引發(fā)自身免疫應(yīng)答和自身免疫病。TSA是體細胞基因由于理化、環(huán)境等因素誘發(fā)或自發(fā)突變誘導(dǎo)，經(jīng)非同義點突變、插入缺失、基因融合和移碼突變等方式產(chǎn)生的腫瘤新抗原(neoantigen)。長期以來，由于腫瘤新抗原往往只有1個或數(shù)個氨基酸的改變，所以很難被發(fā)現(xiàn)；目前常用的血清學(xué)篩選重組cDNA表達文庫(serological analysis of recombinant cDNA expression library，SEREX)和基于HLA結(jié)合肽的鑒定等篩選方法，因工作量大、耗時長，海量的數(shù)據(jù)背后存在大量的無效數(shù)據(jù)，故而效率極其低下；第一代測序方法代價大，耗時長，難以開展深度測序，很難發(fā)現(xiàn)和鑒定少量的基因突變。近年來，隨著二代測序(next-generation sequencing，NGS)等技術(shù)的研發(fā)，深度測序、單細胞測序技術(shù)蓬勃發(fā)展，全球腫瘤基因組計劃的實施和癌癥基因組圖集(The Cancer Genome Atlas，TCGA)的完成，為高效準確地對患者個性化測序、篩選、確定和制備腫瘤新抗原創(chuàng)造了有利條件[5]。相對于TAA，腫瘤新抗原具有在腫瘤組織中特異性表達、免疫原性強、與主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)親和力高等優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)，當免疫檢查點抑制劑阻斷腫瘤微環(huán)境中的抑制性信號后，腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)對腫瘤新抗原能發(fā)揮有效地殺傷作用，促進免疫檢查點抑制劑的療效，在多種腫瘤的免疫治療中取得突破性進展[6]。由此可見，腫瘤新抗原的篩選對腫瘤免疫治療具有重要意義，本文圍繞腫瘤新抗原的篩選方法、基于腫瘤新抗原的免疫治療及臨床應(yīng)用研究進展進行綜述。

1 新抗原的篩選方法

由于患者腫瘤細胞的DNA突變、新抗原譜和MHC分子的多樣性和異質(zhì)性，個體化新抗原篩選是靶向新抗原治療方案中關(guān)鍵的第一步，決定了抗原是否能被抗原提呈細胞(antigen presenting cell，APC)提呈、被TCR識別和最后的治療的效果、成本和時間。用于篩選獲取新抗原的個體或突變體細胞應(yīng)滿足4個條件：(1)突變基因在蛋白質(zhì)水平有表達；(2)突變蛋白可被APC加工成適合于自身MHCⅠ提呈的多肽；(3)突變肽與患者自身MHCⅠ分子具有高親和力；(4)抗原肽—MHCⅠ復(fù)合物與效應(yīng)T細胞受體(T cell receptor，TCR)具有高親和力[7-8]。目前常用于腫瘤新抗原篩選的方法主要有外顯子組結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序法、串聯(lián)微基因序列法、靶基因測序法、共享新抗原肽庫法、抗原配體組學(xué)和質(zhì)譜聯(lián)合技術(shù)等。

1.1外顯子組結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序法 cDNA文庫是篩選腫瘤新抗原的經(jīng)典方法，但由于其耗時長、通量低等缺點，逐漸被二代測序技術(shù)取代。Yadav等[9]和Sahin等[10]分別在動物實驗和惡性黑色素患者中采用外顯子組測序(whole-exome sequencing，WES)和轉(zhuǎn)錄組測序法聯(lián)合篩選獲得了有效的新抗原肽。該方法主要包括以下步驟：首先對腫瘤組織和配對癌旁組織進行全外顯子組測序，然后對測序結(jié)果進行DNA比對，篩選出腫瘤特異性突變，再利用轉(zhuǎn)錄組測序驗證突變位點；在此基礎(chǔ)上，對腫瘤患者外周血細胞進行HLA基因分型，通過NetMHCpan等生物信息學(xué)軟件預(yù)測候選突變位點抗原肽與HLA-Ⅰ親和力，篩選出親和力最高的抗原肽；最后合成抗原肽，在體外驗證新抗原免疫原性，將負載了新抗原的APC與患者的T細胞體外共培養(yǎng)，檢測T細胞活化標志物以驗證篩選獲得的新抗原能否有效活化T細胞免疫應(yīng)答。

1.2串聯(lián)微基因(tandem minigenes，TMGs)序列法 TMGs與外顯子組結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序法相似，但更為簡便。該方法是在基因測序與MHC分型之后，直接合成由多個含有突變位點的微基因組成的串聯(lián)微基因序列，這些微基因序列編碼了12～13個氨基酸的突變肽，再從體外轉(zhuǎn)錄為RNA以驗證免疫原性[11]。該方法已在上皮癌、黑色素瘤和胃腸道腫瘤等腫瘤新抗原篩選上成功應(yīng)用，并獲得了很好的結(jié)果。

1.3靶基因測序法 Chen等[11]在評估上述方法優(yōu)缺點的基礎(chǔ)上，建立了對腫瘤基因序列、循環(huán)腫瘤DNA和正常組織的臨床級靶向測序法，找出非同義體細胞突變的靶基因，并在晚期難治實體瘤臨床試驗中取得了良好的效果。通過計算機分析、HLA結(jié)合親和力和突變等位基因頻率綜合評價候選突變抗原肽，縮小候選突變抗原肽范圍。該方法主要采用以下條件篩選抗原肽：(1)半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)以小于50 nmol/L的解離常數(shù)或親和力百分比小于50%篩選與HLA強結(jié)合肽；(2)具有較高的腫瘤突變等位基因頻率；(3)預(yù)測可結(jié)合2種及以上HLA分子；(4)通過多種算法預(yù)測出的多肽。體外抗原刺激T細胞的方式和時間是影響免疫應(yīng)答的關(guān)鍵因素，體外鑒定新抗原的有效應(yīng)答主要基于記憶T細胞應(yīng)答，如果用樹突狀細胞(dendritic cell，DC)等APC負載新抗原刺激從患者分離的T細胞產(chǎn)生快速應(yīng)答，則說明機體對該腫瘤抗原已產(chǎn)生特異性的有效初次應(yīng)答，同時也說明該新抗原在體內(nèi)加工提呈識別途徑是完整的[12]。該團隊運用此方法篩選出的新抗原在75%的患者中可被自體T細胞識別，并誘導(dǎo)強烈的免疫應(yīng)答。

1.4共享新抗原肽庫法 Chen等[11]建立了1個包含多種高頻突變基因的可共享新抗原肽庫，若患者檢測到的熱點突變和HLA等位基因與肽庫中匹配，可直接進行新抗原鑒定。該團隊首先在TCGA和癌癥的體細胞突變的目錄(catalogue of somatic mutations in cancer，COSMIC)數(shù)據(jù)庫中篩選出21個在9種人類惡性實體瘤中高頻突變基因，再從癌癥驅(qū)動基因KRAS、TP53、CTNNB1、EGFR、BRAF、PIK3CA和GNAS中篩選出了29個理想的候選熱點突變構(gòu)建共享新抗原肽庫，這些突變覆蓋了9種實體瘤中9%～90%的患者，最后合成經(jīng)算法檢驗優(yōu)先級別高的新抗原肽用于臨床驗證。

1.5抗原配體組學(xué)和質(zhì)譜聯(lián)合技術(shù) 該技術(shù)主要是基于HLA-Ⅰ/Ⅱ結(jié)合抗原肽，并提呈給T細胞識別的原理，構(gòu)建HLA-Ⅰ/Ⅱ結(jié)合肽庫，通過MS進行鑒別。同時對腫瘤來源的組織進行外顯子測序，確定突變的基因，把兩種結(jié)果進行重合分析，篩選出候選肽。Bassani-Sternberg等[13]利用質(zhì)譜技術(shù)在25例黑色素瘤患者中檢測到與腫瘤高度相關(guān)的HLA-Ⅰ/Ⅱ結(jié)合抗原肽，發(fā)現(xiàn)了大量TAA，并在11個體細胞突變肽段中篩選到了4條具有良好免疫原性的肽段，同時在患者腫瘤和外周血中也檢測到其特異性T細胞。Bulik-Sullivan等[14]基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)，建立了具有較高特異性和深度學(xué)習功能的HLA預(yù)測算法的EDGE模型，其不依賴MHC多聚體，只需要有限的外周血篩選少量抗原肽數(shù)據(jù)進行訓(xùn)練。由于不同腫瘤非同義突變后產(chǎn)生新抗原的概率是不同的，一般而言，腫瘤突變負荷(tumor mutation burden，TMB)在>1～10個突變/MB的患者可以產(chǎn)生新抗原，而這個負荷相當于1個腫瘤基因中出現(xiàn)15～150個非同義突變。95%突變?yōu)辄c突變基因，而點突變引起的蛋白質(zhì)空間構(gòu)象改變很小，常不能成為優(yōu)勢抗原，只有插入、刪除或移碼突變的因氨基酸改變較大，產(chǎn)生空間構(gòu)象改變明顯，從而有可能成為抗原，真正能與MHC分子具有高親和力的同時又能被患者TCR所識別的抗原僅占其中約1%，因此在10個突變/MB的突變負荷中，最多有1～2個新抗原。故而新腫瘤抗原的篩選具有工作量大，有效收獲率低的特點。

目前臨床應(yīng)用免疫學(xué)治療的患者多數(shù)是手術(shù)或放化療后復(fù)發(fā)的、晚期難治性腫瘤患者，其生存時間較短；此外，多數(shù)腫瘤患者的突變存在個性化。規(guī)模大、耗時長的方法顯然不適合臨床應(yīng)用。外顯子組聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組測序法與串聯(lián)微基因序列法篩選方法的優(yōu)點是篩選范圍大，不容易遺漏，但這也正是其缺點所在。由于篩選出的候選新抗原數(shù)量龐大，其存在能夠引起有效免疫應(yīng)答的新抗原少，低于液體活檢測序深度和缺乏對實體瘤常見驅(qū)動突變新抗原的免疫原性評估等問題，且檢測時間較長，易延誤治療，因此不適合晚期腫瘤新抗原的篩選。靶基因測序法篩選出的新抗原數(shù)目少，容易遺漏有效應(yīng)答基因，但優(yōu)點是大大減少了候選抗原肽的數(shù)目與鑒定時間，相對而言更適合臨床應(yīng)用。共享新抗原肽庫主要篩選的是驅(qū)動突變產(chǎn)生的抗原，但是驅(qū)動突變產(chǎn)生新抗原的概率低，覆蓋面比較窄，容易遺漏有效應(yīng)答抗原。該肽庫目前容量小，優(yōu)先級較低，但是可以通過多中心共享拓展庫容的方法彌補，其優(yōu)點是可以直接獲得抗原肽序列應(yīng)用于臨床?？乖潴w組學(xué)聯(lián)合質(zhì)譜方法，雖然費用高，但篩選的候選肽數(shù)量大，能直接獲得有效應(yīng)答肽段，短期可以應(yīng)用于臨床。

綜上所述，目前許多實驗室將多種方法聯(lián)合應(yīng)用，很少獨立采用一種方法。預(yù)計在不遠的將來，隨著大數(shù)據(jù)、人工智能深度學(xué)習等計算機科學(xué)的發(fā)展和完善，腫瘤新抗原的篩選將日益簡化，實驗室能夠在短期內(nèi)篩選出引發(fā)有效T細胞應(yīng)答的新抗原，為腫瘤患者的臨床治療提供有力的武器和合適的靶標。

2 靶向新抗原免疫治療的臨床應(yīng)用研究

目前利用新抗原臨床免疫治療的主要分為2個方面：一方面是應(yīng)用于免疫檢查點療效預(yù)測和評估，另一方面應(yīng)用于細胞免疫治療，包括腫瘤疫苗、TCR-T和CAR-T等過繼免疫治療。

2.1新抗原負荷預(yù)測免疫檢查點抑制劑療效 大量的文獻報道腫瘤突變負荷越高的患者，采用免疫檢查點抑制劑PD-1/PDL-1抗體治療的效果越好，這實際上反映了TMB越高，腫瘤突變產(chǎn)生能激發(fā)自身T細胞應(yīng)答的新抗原的概率就越高，當通過PD-1/PD-L1去除免疫抑制后，機體免疫細胞能有效識別新抗原，從而殺傷腫瘤細胞。Rizvi等[15]對使用PD-1抗體pembrolizumab治療的非小細胞肺癌患者進行全外顯子組測序，發(fā)現(xiàn)獲得持久性臨床受益(局部或穩(wěn)定反應(yīng)時間大于6個月)的患者比獲得非持久性臨床受益的患者擁有更高的新抗原負荷(中位數(shù)為203 vs 83個月，P=0.001)，且新抗原負荷與無進展生存率的改善相關(guān)(中位數(shù)為14.5 vs 3.5個月，P=0.002)。反之，在使用免疫檢查點抑制劑治療非小細胞肺癌的患者時，發(fā)現(xiàn)腫瘤的耐藥性與腫瘤特異性新抗原的突變丟失有關(guān)。因此，新抗原負荷可能是一個判斷免疫檢查點抑制劑治療腫瘤療效和預(yù)后的理想生物學(xué)標志物。

2.2腫瘤新抗原治療性疫苗的臨床應(yīng)用 新抗原疫苗可促進患者體內(nèi)新抗原特異性T細胞的增殖活化，增強免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的殺傷，也可避免傳統(tǒng)腫瘤疫苗靶向TAA誘發(fā)的自身免疫應(yīng)答。目前臨床應(yīng)用的新抗原疫苗主要包括DC疫苗、肽疫苗、RNA疫苗等，通過皮下或淋巴結(jié)內(nèi)直接注入接種患者。DC疫苗是利用負載新抗原肽的DC直接將新抗原提呈給T細胞；肽疫苗接種后，可直接與體內(nèi)DC細胞上相應(yīng)的HLA結(jié)合，提呈給T細胞；RNA疫苗則通過接種編碼新抗原肽的RNA片段，在體內(nèi)被翻譯成新抗原肽后再由HLA提呈。

Ott等[16]應(yīng)用20種腫瘤新抗原的個體化疫苗在惡性黑色素瘤患者中進行Ⅰ期臨床試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些新抗原疫苗分別可誘導(dǎo) 16%的CD8+T細胞和60%的CD4+T細胞應(yīng)答，其進一步在6例病灶切除的晚期黑色素瘤患者中進行驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在接受疫苗治療后，其中4例患者無復(fù)發(fā)生存時間為25個月，2例復(fù)發(fā)患者在PD-1抗體治療后腫瘤消退，新抗原特異性T細胞增多。

隨著新抗原鑒定的方法不斷發(fā)展和優(yōu)化，靶向新抗原的腫瘤疫苗逐漸引起了學(xué)界的關(guān)注。在多項臨床試驗中，靶向個體化篩選新抗原的疫苗均取得了很好的療效，且疫苗的安全性有所保證，治療期間所產(chǎn)生的毒副作用也在預(yù)計之中。但總體來說，新抗原腫瘤疫苗的研發(fā)與臨床應(yīng)用仍處于起步階段，臨床大樣本試驗很少，對于不同腫瘤的療效參差不齊；在不同的腫瘤中，使用不同類型的疫苗效果還缺乏很好的評估方法；腫瘤屏障的突破仍然是實體瘤治療的瓶頸；克服腫瘤微環(huán)境的抑制還沒有很好的破解辦法。因此，腫瘤疫苗要取得突破性進展還有較長的路要走。

2.3靶向新抗原的過繼性免疫細胞治療

2.3.1新抗原特異性TIL細胞的過繼治療 Dudley等[17]最早應(yīng)用TILs過繼免疫治療方法，從患者手術(shù)切除的腫瘤組織中分離浸潤的T細胞，通過體外IL-2培養(yǎng)擴增后回輸來發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。理論上，通過二代測序篩選的靶向腫瘤新抗原的TILs，相比單純分離出的TILs可能會有更好的治療效果。Zacharakis等[18]體外擴增可對4種突變蛋白(SLC3A2、KIAA0368、CADPS2和 CTSB)產(chǎn)生應(yīng)答的TILs，再回輸治療，使1例晚期難治性轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者取得了超過22個月的完全持久性緩解，表明通過新抗原篩選的特異性應(yīng)答TILs可有效殺傷腫瘤。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，新抗原特異性應(yīng)答TILs可有效提高腫瘤細胞對免疫檢查點抑制劑的敏感性，兩者聯(lián)合使用可獲得很好的協(xié)同作用[19]。TILs體外培養(yǎng)擴增的技術(shù)較為成熟，若結(jié)合前文新抗原肽庫等較為快速的新抗原篩選方法，可快速培養(yǎng)出新抗原應(yīng)答性TILs，應(yīng)用于臨床治療。

2.3.2T細胞受體工程T細胞 TCR-T是采用基因工程技術(shù)將克隆的特異性識別腫瘤抗原TCR移植到自體CD8+T細胞上，使其獲得特異性殺傷腫瘤細胞的能力。當患者抗腫瘤免疫功能低下或微環(huán)境中腫瘤特異性TILs缺乏時，新抗原特異性TCR-T細胞療法是一種具有優(yōu)勢的選擇。Robbins等[20]使用TCR-T技術(shù)驗證了靶向癌癥—睪丸抗原(cancer testis antigen，CT)NY-ESO-1的TCR-T介導(dǎo)的抗腫瘤作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)45%的黑色素瘤患者及67%的滑膜肉瘤患者出現(xiàn)臨床應(yīng)答反應(yīng)。

靶向gp100和NY-ESO-1等TAA的TCR-T取得了較好的療效，但這些抗原在正常細胞上也有表達，導(dǎo)致TCR-T治療過程中出現(xiàn)“脫靶”現(xiàn)象，在殺傷腫瘤細胞的同時也會破壞表達相同抗原的正常細胞。Morgan等[21]在采用TCR-T技術(shù)靶向MAGE-A3治療黑色素瘤時，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T細胞也識別在腦內(nèi)表達的MAGE-A12，出現(xiàn)嚴重的神經(jīng)毒副作用。靶向腫瘤特異性抗原的TCR-T細胞理論上可解決“脫靶”問題。Klebanoff等[22]采用外顯子組和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)鑒定腫瘤組織中的新抗原，與TILs共培養(yǎng)后篩選新抗原特異性T細胞，并克隆TCR序列導(dǎo)入新的T細胞，制備出新抗原特異性TCR-T細胞，目前尚在臨床試驗中，相信今后會取得較好的效果。

2.3.3嵌合抗原受體T細胞 CAR-T與TCR-T類似，其最大的優(yōu)勢是采用BCR的方式識別抗原，可識別通常不被TCR-T識別的碳水化合物和糖脂[23]，且無需通過抗原提呈過程，也不受MHC的限制，在一些MHC表達低下或不表達的腫瘤上也可發(fā)揮作用。

然而，CAR-T也會出現(xiàn)“脫靶”現(xiàn)象，在使用針對酪氨酸激酶受體2(V-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2，ErbB2)的CAR-T細胞治療結(jié)腸癌患者時，患者肺部出現(xiàn)了大量CAR-T細胞，并導(dǎo)致細胞因子釋放綜合征(cytokine release syndrome，CRS)、多器官衰竭[24]。制備靶向腫瘤特異性新抗原的CAR-T有可解決“脫靶”問題，目前靶向ErbB2、神經(jīng)節(jié)苷脂(disialoganglioside，GD2)、前列腺特異性膜抗原(prostate-specific membrane antigen，PSMA)新靶點的CAR-T的臨床試驗也正在進行[25]。

3 總結(jié)與展望

基于靶向新抗原的免疫治療是一種個體化精準醫(yī)療方式，具有良好的應(yīng)用前景，而新抗原篩選與鑒定是關(guān)鍵的第一步，提高新抗原篩選的速度與準確性可使更多晚期難治性腫瘤患者獲益。新抗原免疫治療和免疫檢查點抑制劑聯(lián)合應(yīng)用有望獲得更好的療效。

目前靶向新抗原的免疫治療仍面臨許多挑戰(zhàn)，MHC表達缺失等原因?qū)е驴乖砦粺o法提呈，使靶向原表位的T細胞無法發(fā)揮作用，靶向驅(qū)動突變(driver mutation)產(chǎn)生的新抗原相比于靶向過客突變(passenger mutation)有望降低突變表位無法提呈的情況；突變負荷較低的腫瘤無法尋找合適的新抗原和新抗原特異性T細胞等問題，很難在治療中獲益；此外，治療有效的個體中還面臨嚴重的自身免疫損傷和CRS帶來的嚴重毒副作用，尚未找到很好的破解方式。目前多數(shù)的腫瘤新靶點篩選的方法和新靶點腫瘤特異性T細胞的臨床應(yīng)用還處于實驗階段，還需要進行相當長時間的臨床探索；實體瘤的免疫治療尚未取得突破性進展；即使有的免疫治療最終獲得良好效果，但動輒數(shù)十萬甚至上百萬的天價治療費用，仍然讓許多癌癥患者不能受益，甚至因病致貧。因此如何獲取高效、快速和廉價的腫瘤新抗原的篩選方法，有效的擴增抗原特異性T細胞，還有待于我們繼續(xù)努力探索。

總之，靶向新抗原免疫治療是目前最前沿、最具前景的腫瘤免疫治療方向之一，大數(shù)據(jù)、人工智能深度學(xué)習等技術(shù)將助推腫瘤的免疫治療，加快新抗原的篩選速度，提高篩選效率，有效降低成本。腫瘤的臨床免疫治療的道路布滿荊棘，但前途是光明的，相信在不遠的將來會取得新的突破。