骨膜蛋白在玻璃體視網(wǎng)膜疾病中作用機制的研究進展

增生型糖尿病性視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)和年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)等玻璃體視網(wǎng)膜疾病是現(xiàn)階段導致相應人群視力下降和喪失的主要原因，上述眼疾最重要的病理特征是晚期脈絡膜或視網(wǎng)膜纖維血管膜(fibrovascular membrances, FVMs)的形成。增生的FVMs所引起的玻璃體出血或牽拉性視網(wǎng)膜脫離是患者視力喪失及術(shù)后預后不良的最主要原因。目前，DR治療主要以視網(wǎng)膜激光光凝、抗血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、激素和手術(shù)治療為主[1],在臨床上針對因玻璃體積血或視網(wǎng)膜脫離達到行玻璃體切割手術(shù)指征的PDR患者通常術(shù)前聯(lián)合抗VEGF治療。但是常常因為FVMs的存在，術(shù)中術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生率增加，且患者術(shù)后視力往往恢復不佳。因此，尋找玻璃體視網(wǎng)膜疾病的新的生物學標記物和治療靶點對疾病的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷及早期治療至關(guān)重要。骨膜蛋白(Periostin，PN)是一種獨特的細胞外基質(zhì)蛋白，參與人體各組織器官的相應免疫炎癥反應，如心肌梗死后重塑[2]、骨髓纖維化[3]、牙周組織再生修復[4]、皮膚傷口愈合[5]、腫瘤細胞轉(zhuǎn)移[6]、腎臟損傷[7]、以及可誘導慢性過敏性疾病[8]等。骨膜蛋白在眼部的主要作用包括促進細胞增殖、分化、遷移和粘附，誘導纖維形成以及促進新生血管等[8]。Yoshida等[9]對PDR患者增生的纖維血管膜cDNA文庫的7000個隨機序列測序發(fā)現(xiàn)，骨膜蛋白在FVMs中的表達比在特發(fā)性視網(wǎng)膜前膜中的表達更高。Takada等[10]通過蛋白質(zhì)組學技術(shù)分析了骨膜蛋白是PDR的一種新的生物學標記物。越來越多的國內(nèi)外研究證明，骨膜蛋白是各玻璃體視網(wǎng)膜疾病中的關(guān)鍵因子，骨膜蛋白有望成為玻璃體視網(wǎng)膜疾病的新的生物學標志物，以此提供新的治療策略。

一、骨膜蛋白的發(fā)現(xiàn)、染色體定位、結(jié)構(gòu)與功能

骨膜蛋白最早在1993年由Takeshita等[11]在小鼠成骨細胞系MC3T3-E1的cDNA文庫中通過mRNA減法雜交和微分篩選技術(shù)發(fā)現(xiàn)和鑒定的。早期因其主要是成骨細胞及其前體分泌產(chǎn)生并可在骨形成中發(fā)揮著重要作用，故被稱為成骨細胞特異性因子2(osteoblast-specific factor-2，OSF-2)。1999年研究發(fā)現(xiàn)OSF-2顯著表達在人體骨膜和牙周組織中，其不僅參與骨和牙齒組織的正常生理性發(fā)育，且與骨折、牙周疾病病理狀態(tài)下的修復也密切相關(guān)，便更名為骨膜蛋白。

骨膜蛋白由Postn基因編碼，鼠和人類的骨膜蛋白有89.2%的氨基酸相同，小鼠的Postn基因位于3號染色體，人類的Postn基因位于13號染色體[12]。骨膜蛋白是一種保守的分泌型細胞外基質(zhì)蛋白，相對分子質(zhì)量為90kD，主要分子結(jié)構(gòu)由四個部分構(gòu)成：特征性信號肽序列、EMI結(jié)構(gòu)域(富集半胱氨酸的區(qū)域)、FAS-1結(jié)構(gòu)域(4個同源串聯(lián)重復結(jié)構(gòu)區(qū)域)和C末端區(qū)域[13]。EMI結(jié)構(gòu)域結(jié)合I型膠原及纖維連接蛋白。由于存在FAS-1結(jié)構(gòu)域，骨膜蛋白屬于成束蛋白家族[14]，F(xiàn)AS-1結(jié)構(gòu)域與tenascin-C和BMP-1結(jié)合，且第2、第4個結(jié)構(gòu)域存在整合素結(jié)合位點。C末端區(qū)域在轉(zhuǎn)錄的過程中易發(fā)生缺失、插入，從而可產(chǎn)生功能不同的骨膜蛋白剪接變構(gòu)體[15]。Nakama等[16]構(gòu)建氧誘導視網(wǎng)膜病變(oxygen-induced retinopathy, OIR)模型小鼠并對其骨膜蛋白的C末端區(qū)域的相應基因做基因敲除，接著向小鼠玻璃體腔注射骨膜蛋白剪接變構(gòu)體對應的抗體，最后分析實驗組小鼠和空白對照組小鼠視網(wǎng)膜新生血管網(wǎng)密度變化和視網(wǎng)膜無灌注區(qū)面積改變，實驗揭示缺少不同外顯子對應的骨膜蛋白剪接變構(gòu)體均具有促進病理性新生血管形成的作用，其中C末端區(qū)域缺少外顯子17的骨膜蛋白剪接變構(gòu)體作用最強，而C末端區(qū)域缺少外顯子21的骨膜蛋白剪接變構(gòu)體則可抑制生理性血管重建。

二、玻璃體視網(wǎng)膜疾病與巨噬細胞的極化

巨噬細胞在機體固有免疫和特異性免疫中發(fā)揮著不可或缺的作用，具有趨化性運動、吞噬、分泌相應細胞因子和抗原呈遞等功能。巨噬細胞在不同的微環(huán)境影響下可極化為不同表型從而改變其功能特征，主要有M1型即經(jīng)典活化的巨噬細胞(CD68+、CD86+、MHCⅡ+為表型特征)和M2型即替代活化的巨噬細胞(CD68+、CD163+、FRβ+為表型特征)[17]。

巨噬細胞極化及其產(chǎn)生的相應細胞因子和炎癥因子介導的免疫反應是多種眼部疾病的重要發(fā)病機制。巨噬細胞的極化與AMD的脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)的形成有著一定的聯(lián)系。隨著AMD病程的進展，巨噬細胞由M1型向M2型極化，活化后的M2型巨噬細胞通過激活信號通路上調(diào)VEGF的表達，以促進CNV的形成[18]。巨噬細胞極化同樣發(fā)生在PDRⅤ期FVMs增生過程中。2015年Zhou等[19]在OIR小鼠模型中發(fā)現(xiàn)表達CD163的M2型巨噬細胞聚集在新生血管束附近；Kobayashi等[20]通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)PDR患者的玻璃體和FVMs中CD163的表達增加，而CD163是M2型巨噬細胞標志物[21]，由此可見糖尿病性視網(wǎng)膜病變眼內(nèi)微環(huán)境中M2型巨噬細胞占主要優(yōu)勢。

三、骨膜蛋白在玻璃體視網(wǎng)膜疾病中的作用機制

1.骨膜蛋白與增生型糖尿病性視網(wǎng)膜病變：當前，糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)已成為全球糖尿病患者嚴重威脅視力的微血管并發(fā)癥，在我國，主要是50 歲以上人群最主要的致盲性眼病。國內(nèi)外大量文獻報道DR發(fā)生的明確病因不詳，主要是氧化應激、多元醇代謝通路的異常、蛋白激酶C(PKC)的活化、蛋白質(zhì)非酶糖基化產(chǎn)物的堆積、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶系統(tǒng)等的相互作用[22]。DR主要的病理過程為：微血管細胞損害使得微血管擴張或形成微血管瘤或發(fā)生滲漏，導致微血管閉塞，無灌注區(qū)形成，進一步導致視網(wǎng)膜缺血缺氧，PDRⅤ期眼底出現(xiàn)新生血管和形成FVMs。按DR發(fā)展階段和嚴重程度，臨床分為非增生型(nonproliferative diabetic retinopathy, NPDR)和增生型，PDR最核心、與NPDR相區(qū)別的是視網(wǎng)膜FVMs形成。Yoshida等[23]通過對84例PDR患者106只術(shù)眼及31例黃斑裂孔(macular hole, MH)患者31只術(shù)眼玻璃體液進行RT-PCR和ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，PDR患者玻璃體中骨膜蛋白的水平顯著高于MH患者，且伴有增生FVMs的PDR患者玻璃體液中骨膜蛋白濃度高于無FVMs患者。由此可見，骨膜蛋白參與PDR患者FVMs的增生。

Kobayashi等[20]通過ELISA法檢測PDR患者玻璃體CD163及骨膜蛋白濃度發(fā)現(xiàn)，CD163與骨膜蛋白呈顯著相關(guān)性；免疫組化實驗顯示，CD163和骨膜蛋白在FVMs中共定位，揭示了表型為CD163的M2型巨噬細胞可產(chǎn)生骨膜蛋白。2015年Yoshida等[24]通過體外試驗發(fā)現(xiàn)M-CSF處理的巨噬細胞IL-13也可顯著誘導CD163表達上調(diào)，但在程度低于M-CSF處理的巨噬細胞。此外，單純加入M-CSF因子，巨噬細胞并不增加骨膜蛋白mRNA的表達。然而，添加IL-13到M-CSF處理的巨噬細胞中卻可顯著提高骨膜蛋白mRNA的水平，約10倍。這些結(jié)果表明，骨膜蛋白、M2型巨噬細胞與PDR患者FVMs的形成有著密不可分的聯(lián)系。具體機制為：PDR患者招募的單核細胞通過巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colonystimulating factor，M-CSF)、IL-13極化為活化M2型巨噬細胞表達骨膜蛋白，骨膜蛋白通過與整合素αvβ3作用介導黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)激活通路[25]，上調(diào)VEGF受體2的表達，從而促進FVMs中新生血管的形成；又可使絲/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)發(fā)生磷酸化，從而激活相應信號通路并產(chǎn)生多種細胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子、血小板衍生生長因子等，打破抑血管生長因子和促血管生長因子之間的平衡且纖維細胞進一步增殖，進一步誘導新生血管的形成和纖維化[26，27]。此外，骨膜蛋白能與肌成纖維細胞相互作用，以促進FVMs在視網(wǎng)膜的黏附與侵襲[28]，從而增加了PDR患者并發(fā)癥如孔源性視網(wǎng)膜脫離的發(fā)生率以及玻璃體手術(shù)剝離FVMs的失敗率。

2.骨膜蛋白與增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變：PVR多見于孔源性視網(wǎng)膜脫離術(shù)后并發(fā)癥。PVR視網(wǎng)膜表面和玻璃體后可形成纖維細胞性增殖膜(ERMs)，增殖膜的收縮、牽拉可再次引起視網(wǎng)膜脫離，同樣是造成許多眼疾病惡化、視力喪失的重要原因。PVR的具體病因機制尚不明確，但在玻璃體和增殖膜中異常表達的細胞因子驅(qū)動著PVR整個病程的進展。其中，RPE細胞表達的骨膜蛋白在PVR增殖膜的形成中扮演著特殊角色。Ishikawa等[29]通過PCR檢測到PVR-ERMs中骨膜蛋白mRNA表達，但在正常視網(wǎng)膜中幾乎沒有，揭示骨膜蛋白主要由RPE細胞表達。此外，研究發(fā)現(xiàn)PVR患者玻璃體中的骨膜蛋白和TGF-β2的濃度顯著高于黃斑前膜患者，且骨膜蛋白濃度與TGF-β2濃度之間有很強的相關(guān)。TGF-β2可以促進PVR視網(wǎng)膜RPE細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞產(chǎn)生骨膜蛋白[30]。骨膜蛋白進一步以自分泌方式結(jié)合整合素激活FAK和AKT通路，以增強RPE細胞的增生、分化、遷移和黏附[28，30]，導致ERMs的形成。

3.骨膜蛋白與年齡相關(guān)性黃斑變性：AMD是60歲以上老年人群視力不可逆損害的首要原因，現(xiàn)已成為全球主要的老年性致盲眼病之一。AMD是一種遺傳與非遺傳因素共同作用的復雜性、難治性疾病。晚期AMD可出現(xiàn)脈絡膜病理性新生血管(CNV)及纖維化[31]，這一過程涉及血管內(nèi)皮細胞、RPE細胞、成纖維細胞、膠質(zhì)細胞和巨噬細胞等細胞的增殖、分化、遷移和黏附，同時血管內(nèi)皮生長因子、胎盤生長因子、結(jié)締組織生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子β及其受體[32，33]等細胞因子也參與其中。玻璃體腔注射抗VEGF是現(xiàn)階段臨床上延緩AMD進展的最有效治療手段。目前大量研究發(fā)現(xiàn)且證實抗VEGF治療在一定程度上可抑制CNV，但尚不能抑制纖維化的進展[32]。此外，最近有關(guān)報道[34-36]表明,玻璃體內(nèi)注射抗VEGF可導致視網(wǎng)膜損傷和促進脈絡膜纖維化。因此視網(wǎng)膜下或脈絡膜纖維化仍然是一種嚴重威脅視力的病理狀態(tài)。Nakama等[37]利用激光損傷視網(wǎng)膜構(gòu)建視網(wǎng)膜脈絡膜層纖維化的小鼠模型，通過研究發(fā)現(xiàn)實驗組視網(wǎng)膜色素上皮-脈絡膜復合物上骨膜蛋白mRNA的表達及骨膜蛋白的含量比對照組高，并在第14天的時候達到高峰。此外，免疫組織化學分析顯示，激光損傷后RPE65陽性的RPE細胞中出現(xiàn)骨膜蛋白陽性染色；在人類脈絡膜FVMs中，發(fā)現(xiàn)角蛋白陽性的RPE細胞中的骨膜蛋白表達增強。以上實驗結(jié)果均表明RPE細胞表達骨膜蛋白。骨膜蛋白在AMD的發(fā)生發(fā)展中同樣有著重要的作用，視網(wǎng)膜CNV的形成及纖維化的發(fā)生主要的機制是由RPE分泌的骨膜蛋白與整合素αvβ3相互作用。

四、新型骨膜蛋白靶向制劑

2018年劉舒靜等[38]研究發(fā)現(xiàn)降低骨膜蛋白可抑制糖尿病性視網(wǎng)膜病變的發(fā)展。雖然抗VEGF治療在臨床上應用廣泛，其在一定程度上可抑制視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生發(fā)展，但現(xiàn)階段不少實驗證明，玻璃體內(nèi)注射抗VEGF可導致視網(wǎng)膜損傷并可能促進視網(wǎng)膜纖維化[36]。因為本身VEGF在視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵的平衡作用，另外VEGF與血管內(nèi)皮生長因子受體-2(VEGFR2)結(jié)合并主要通過PLCγ/PKC/MAPK途徑促進視網(wǎng)膜新生血管[39]，而骨膜蛋白主要與整合素的結(jié)合并通過FAK/AKT途徑來促進新生血管[40]，且正常視網(wǎng)膜組織中骨膜蛋白含量極少。Yoshida等[23]也報道PDR患者玻璃體VEGF濃度與骨膜蛋白之間的相關(guān)性較弱。因此，針對視網(wǎng)膜和脈絡膜新生血管及纖維化，抗VEGF及針對骨膜蛋白靶向治療是相互獨立的。

RNA干擾(RNAi)技術(shù)主要是利用雙鏈RNA降解同源基因mRNA以實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后基因沉默，從而特異性抑制目的基因[41]。Nakama等[39]通過構(gòu)建OIR小鼠模型和體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞(HRECs)研究了骨膜蛋白在視網(wǎng)膜新生血管中所起的作用且評價了針對視網(wǎng)膜新生血管的骨膜蛋白的單鏈RNAi(NK0144)的治療效果。針對骨膜蛋白的單鏈RNAi試劑能顯著抑制OIR小鼠視網(wǎng)膜新生血管以及由IL-13驅(qū)動的HRECs的遷移和管的形成。除此之外，激光損傷Postn基因缺失的小鼠發(fā)現(xiàn)其脈絡膜新生血管及纖維化的平均面積均明顯小于野生型小鼠。因此，玻璃體內(nèi)注射單鏈靶向骨膜蛋白RNAi可能是一種安全、有效的阻斷玻璃體視網(wǎng)膜病變視網(wǎng)膜新生血管及纖維化的新的治療策略。

五、展望

過去十年中，隨著醫(yī)療的日益發(fā)展，臨床針對PDR、PVR及AMD等增生性玻璃體視網(wǎng)膜疾病的治療方法主要涉及抗VEGF治療、激光光凝、玻璃體切割術(shù)等，但多數(shù)患者術(shù)后視力恢復不佳，是否存在新的生物學標志和診治靶點是大家關(guān)注的重點。骨膜蛋白在增生性玻璃體視網(wǎng)膜疾病異常表達且在疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，可以通過抑制其表達阻礙玻璃體視網(wǎng)膜疾病的進一步發(fā)展，骨膜蛋白有望成為玻璃體視網(wǎng)膜疾病新的生物學標志和診治靶點。然而，現(xiàn)階段新型骨膜蛋白靶向制劑僅在少數(shù)體外及動物實驗中應用，證明其安全性及有效性仍需要更多的隨機對照實驗來驗證。