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    白假絲酵母環(huán)核苷酸磷酸二酯酶2的異源表達(dá)、純化與酶學(xué)特性分析

    2020-12-12 13:26:54李赤霞陳玉娟田元元王友升
    食品科學(xué) 2020年22期
    關(guān)鍵詞:凝膠電泳菌體條帶

    李赤霞,陳 瀅,張 萌,陳玉娟,田元元,王友升,3,

    (1.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京工商大學(xué)輕工科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 100048;

    2.山東凱普菲特生物科技有限公司,山東 日照 276800;3.日照華偉大健康產(chǎn)業(yè)研究院,山東 日照 276800)

    白假絲酵母(Candida albicans)屬于食源性致病酵母菌[1],近年來在國內(nèi)外食品中常檢出C. albicans,其中乳制品是易被其污染的第一大類產(chǎn)品[2]。C. albicans在正常情況下呈卵圓形,不引起疾病,而當(dāng)機(jī)體免疫力低下或菌群失調(diào)時(shí),會改變生長形式,出芽生成假菌絲并感染機(jī)體細(xì)胞,最終導(dǎo)致生理性疾病的發(fā)生[3]。C. albicans作為食品中的條件致病菌,其致死率可達(dá)40%[4],所以對其毒性和菌絲生長的研究極為重要。環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosinc monophosphate,cGMP)作為生物體內(nèi)第二信使調(diào)控著重要的生理代謝反應(yīng),而磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)是降解環(huán)核苷酸的一類酶[5]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在約30 種PDE,但是在真菌生物中,目前僅有兩類PDE被發(fā)現(xiàn),其中PDE1屬于II類PDE超家族成員,而PDE2屬于I類PDE超家族成員,其對cAMP具有較高的親和力[6-8],且PDE2與人類PDEs蛋白具有相似的折疊結(jié)構(gòu)[9]。研究表明,cAMP信號通路在酵母的細(xì)胞壁合成、細(xì)胞生長等生長代謝活動(dòng)以及致病毒性中起到重要作用[10-16];同時(shí),Wilson等[14]對C. albicansPDE的研究表明,pde2基因的缺失會導(dǎo)致菌絲發(fā)育不完全和細(xì)胞壁不完整,從而對其毒性產(chǎn)生影響;有學(xué)者證明部分抑菌劑對C. albicans抑菌作用的主要機(jī)制是抑制PDE2蛋白的表達(dá)[17-19]。所以目前對C. albicansPDE2蛋白的研究已成為其假菌絲生長和毒性調(diào)控的重要研究方向。

    本研究將大腸桿菌作為表達(dá)載體,通過異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)誘導(dǎo)目的蛋白異源表達(dá),利用3 種層析方法進(jìn)行純化,獲得高純度C. albicansPDE2蛋白,并通過高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)分析PDE2蛋白酶的特性。旨在為該蛋白的晶體學(xué)分析及C. albicans的生理病理機(jī)制研究提供前期基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 菌體與質(zhì)粒

    野生型C. albicans,大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Top10、BL21,質(zhì)粒pET28a和pGEM-T,均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.1.2 試劑

    NheI、EcoRI內(nèi)切酶 美國Biolab公司;DNA回收試劑盒、高純質(zhì)粒小提試劑盒、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Marker 美國Thermo公司;cAMP、cGMP、卡那霉素、Tris-base 美國Amresco公司;乙二胺四乙酸鈉中國北京西隴化工有限公司;氯仿 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;X-gal 美國Sigma公司;IPTG 美國Thermo Fisher Scientific公司;酵母浸粉、胰蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;氯化鈉 北京化工廠;瓊脂中國Biotopped公司。

    Ni-NTA agarose 德國Qiagen公司;Q-SepharoseTMFast Flow、SephacrylTMS200 High Resolution 美國GE Healthcare公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    French PressSL-650D超聲破碎儀 南京順流儀器公司;層析實(shí)驗(yàn)冷柜 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;HVE-50高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司;PHS-3D pH計(jì) 上海儀表有限公司;Forma Class II凈化工作臺美國Thermo公司;5810R臺式冷凍高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司;2695 HPLC儀 美國Waters公司。

    1.3 方法

    1.3.1 基因組DNA提取

    C. albicans在酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YPD)培養(yǎng)基中28 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)過夜,A600nm達(dá)到2.0~3.0后離心集菌,并參照王繼英等[20]的酚-氯仿法提取C. albicans的基因組DNA。

    1.3.2 重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建

    根據(jù)C. albicanspde2基因序列(NCBI Gene ID:3636877)設(shè)計(jì)引物,該基因CDS序列全長為1 716 bp[21]。上游引物序列為:5’-CGGCTAGCATGTCATTTGAAA TCACAAT-3’(下劃線為NheI酶切位點(diǎn));下游引物序列為:5’-CGGAATTCTACTATAATTGAGGTGCCAC-3’(下劃線為EcoRI酶切位點(diǎn))。引物擴(kuò)增目的基因片段連接至pGM-T載體,采用熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞,37 ℃培養(yǎng)16 h進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增,鑒定插入片段。將已鑒定目的基因片段連接到pET28a載體上,最終獲得pET28a-C. albicanspde2重組質(zhì)粒,重組質(zhì)粒通過NheI和EcoRI雙酶切鑒定[22]。

    1.3.3 pET28a-C. albicanspde2重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)

    將pET28a-C. albicans pde2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)37 ℃過夜培養(yǎng)后,接種至含0.4%葡萄糖的LB培養(yǎng)基中。0.1 mmol/L IPTG 12 ℃低溫誘導(dǎo)48 h后,10 000 r/min離心5 min收集菌體。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析誘導(dǎo)0、24、48 h菌體中目的蛋白的表達(dá)含量。

    1.3.4C. albicansPDE2蛋白分離純化

    1.3.4.1 菌體破碎

    按照1∶10的比例加入提取液并重新懸浮收集的表達(dá)菌體,超聲破碎(工作5 s,間歇8 s)菌體30 min,10 000 r/min離心30 min后,分別對破碎總蛋白、上清液蛋白以及沉淀蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測[23]。

    1.3.4.2 基于重組蛋白多重性質(zhì)的分離純化

    參照Zhang Wei等[24]的方法進(jìn)行Ni-NAT柱分離純化,將超聲破碎上清液蛋白加入至Ni-NAT柱吸附并洗脫收集目的蛋白。Ni-NAT純化后的C. albicansPDE2蛋白透析置換24 h后,加入牛凝血酶于室溫酶切3 h。酶切后的蛋白加入Q-Sepharose柱進(jìn)行分離純化后,超濾濃縮至10 mL左右。濃縮蛋白進(jìn)行Sephacryl S200分子篩純化[25]。Ni-NAT柱、Q-Sepharose柱和Sephacryl S200柱分離純化過程中測定蛋白收集液的A280nm,A280nm等于1被定義為蛋白濃度為1 U,收集蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和非變性凝膠電泳檢測分析。最終蛋白濃縮至10 mg/mL并冷凍保存。

    1.3.5C. albicansPDE2蛋白酶活力測定

    分離純化的C. albicansPDE2蛋白應(yīng)用HPLC進(jìn)行酶學(xué)特性測定,參照Hou Jing等[26]方法。反應(yīng)體系采用單一底物和雙底物兩種方式檢測重組蛋白的酶活特性,反應(yīng)溫度25 ℃,反應(yīng)時(shí)間30 min。根據(jù)cAMP和cGMP的峰面積,計(jì)算反應(yīng)底物的水解率。

    色譜條件:色譜柱:Intertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm,5 μm)。流動(dòng)相A為0.02 mol/L KH2PO4溶液,流動(dòng)相B為甲醇,洗脫條件為82% A、18% B。檢測波長252、258 nm,柱溫30 ℃,流速1 mL/min,進(jìn)樣量20 μL。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 C. albicans pde2基因克隆

    運(yùn)用酚-氯仿法提取C. albicans基因組DNA,結(jié)果見圖1a,在10 000 bp以上有明顯條帶,證明成功獲得了C. albicans基因組DNA。利用C. albicans pde2基因引物,通過PCR擴(kuò)增目的基因片段,DNA凝膠電泳如圖1b所示,在1 500~2 000 bp之間有明顯的條帶,大小與C. albicans pde2基因的大?。? 716 bp)一致,證明目的基因片段可以被正確擴(kuò)增。

    圖1 C. albicans基因組DNA(a)及目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(b)凝膠電泳Fig. 1 Agarose gel electrophoresis patterns of C. albicans genomic DNA (a) and PCR amplified product of target gene (b)

    2.2 重組質(zhì)粒載體構(gòu)建

    將擴(kuò)增所得C. albicans pde2目的片段與pGM-T載體相連,雙酶切驗(yàn)證電泳結(jié)果見圖2a,3 000 bp處條帶為載體pGM-T條帶,1 700 bp處條帶為目的基因條帶,證明成功獲得pGM-T-C. albicans pde2質(zhì)粒。將酶切后膠回收產(chǎn)物與pET28a載體酶切產(chǎn)物連接,獲得重組pET28a-C. albicans pde2質(zhì)粒。對所構(gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,由圖2b可知,酶切后在6 000 bp和1 700 bp左右有明顯條帶,其中6 000 bp處為pET28a質(zhì)粒載體條帶,1 700 bp左右的條帶為目的基因條帶,證明重組pET28a-C. albicans pde2質(zhì)粒構(gòu)建成功。

    圖2 C. albicans pde2目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與質(zhì)粒雙酶切瓊脂糖凝膠電泳Fig. 2 Agarose gel electrophoresis patterns of C. albicans pde2 and plasmid subjected to double enzymatic digestion

    2.3 pET28a-C. albicans pde2重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)

    IPTG低溫誘導(dǎo)48 h后收集菌體5 g/L,分別取樣誘導(dǎo)24 h和48 h的菌體,SDS-PAGE見圖3。誘導(dǎo)24 h,蛋白表達(dá)量較少,幾乎沒有目的蛋白條帶。誘導(dǎo)48 h后,60 kDa處蛋白含量顯著增加,該條帶與預(yù)期目的蛋白(約62 kDa)條帶一致,表明該誘導(dǎo)條件能夠在IPTG誘導(dǎo)48 h后獲得大量的目的蛋白,最終獲得菌體4.5 g/L。

    圖3 C. albicans PDE2蛋白不同誘導(dǎo)時(shí)間表達(dá)水平SDS-PAG分析Fig. 3 SDS-PAGE results of C. albicans PDE2 protein samples expressed at different times

    2.4 C. albicans PDE2蛋白的分離純化

    將C. albicansPDE2表達(dá)菌體超聲破碎后取樣進(jìn)行SDS-PAGE,結(jié)果如圖4a所示,離心上清液中目的蛋白含量極高,證明該誘導(dǎo)條件下目的蛋白水溶性較強(qiáng),形成極少量的包涵體。將離心上清液蛋白加入Ni-NAT親和層析柱中進(jìn)行分離純化,最終獲得70 U蛋白。對蛋白含量大于1 U收集管取樣進(jìn)行SDS-PAGE,結(jié)果見圖4b,目的蛋白條帶占比高,說明重組目的蛋白與Ni-NAT柱親和能力強(qiáng),且經(jīng)過蛋白純度明顯升高。證明Ni-NAT柱能夠?qū)δ康闹亟M蛋白進(jìn)行有效的分離純化。

    圖4 C. albicans PD2蛋白超聲破碎及Ni-NAT純化SDS-PAG結(jié)果Fig. 4 SDS gel electrophoresis profiles of crude PDE2 protein from ultrasonically disrupted C. albicans cells and Ni-NAT purified protein

    Ni-NAT柱分離純化后的蛋白,進(jìn)行24 h的透析置換。牛凝血酶切除目的蛋白的His-tag標(biāo)簽,使目的蛋白更好地與Q-Sepharose柱結(jié)合,結(jié)果見圖5a,經(jīng)過3 h的室溫酶切,蛋白分子質(zhì)量有明顯降低,證明該酶切條件適合重組目的蛋白。酶切后的蛋白質(zhì)經(jīng)過Q-Sepharose柱分離純化,共收集目的蛋白55 U,結(jié)果如圖5b所示,電泳結(jié)果幾乎沒有雜蛋白條帶,說明雜蛋白的含量明顯降低,因此證明Q-Sepharose柱可以使目標(biāo)蛋白得到進(jìn)一步分離純化。

    圖5 C. albicans PD2蛋白酶切(a)及Q-Sepharose柱純化(b)SDS-PAG結(jié)果Fig. 5 SDS gel electrophoresis profiles of enzymatically cleaved C. albicans PDE2 (a) and Q-Sepharose purified protein (b)

    將Q-Sepharose柱純化的蛋白濃縮并加入Sephacryl S200柱,通過分子篩分離純化,SDS-PAGE檢測結(jié)果如圖6a所示,Sephacryl S200柱純化后,目的蛋白純度得到進(jìn)一步提高。利用非變性凝膠電泳檢測濃縮后純化蛋白的活性,如圖6b所示,結(jié)果表明經(jīng)過多步純化后,目的蛋白條帶清晰可見且沒有雜蛋白條帶,說明Ni-NAT柱、Q-Sepharose柱和Sephacryl S200柱分離純化過程中C. albicansPDE2蛋白沒有發(fā)生凝聚,能夠維持其生理結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性,且蛋白純度得到極大提高。

    圖6 C. albicans PD2 Sephacryl S200柱純化SDS-PAG(a)及非變性凝膠電泳(b)結(jié)果Fig. 6 Purification of C. albicans PDE2 on Sephacryl S200 column (a)and non-denaturing gel electrophoresis results (b)

    表1 C. albicans PD2蛋白純化回收率Table 1 Recovery of purified C. albicans PD2 protein

    表1 C. albicans PD2蛋白純化回收率Table 1 Recovery of purified C. albicans PD2 protein

    菌體質(zhì)量/g Ni-NTA Q-Sepharose Sephacryl S200 平均蛋白收集量/(U/g)蛋白回收率/%10 70 100 55 78.57 28 40 2.8蛋白收集量/U蛋白回收率/%蛋白收集量/U蛋白回收率/%蛋白收集量/U

    以Ni-NTA柱純化得到的蛋白含量為100%,計(jì)算Q-Sepharose柱和Sephacryl S200柱純化過程中蛋白的回收率。如表1所示,C. albicansPDE2蛋白在每步純化過程中,損耗約30%蛋白,這可能是由于蛋白純度的增高導(dǎo)致,同時(shí)在經(jīng)歷柱層析時(shí),目的蛋白也存在著一定量的流失。最終平均每克表達(dá)菌體可獲得2.8 U目的蛋白。

    2.5 C. albicans PDE2蛋白酶活性分析

    應(yīng)用HPLC法測定所獲得的目的蛋白酶活力,測定不同濃度蛋白對cAMP和cGMP的水解率,且將底物設(shè)置為0.4 mmol/L的單底物與雙底物兩種體系,通過其對兩種體系的水解情況,確定其對于cAMP和cGMP的親和作用,結(jié)果如表2所示。在單底物的情況下,相同質(zhì)量濃度的C. albicansPDE2對cGMP的水解能力略低于cAMP,說明C. albicansPDE2對cAMP具有更高的親和力。在雙底物的體系中,0.385 mg/mL質(zhì)量濃度下,0.05 mmol/L和0.1 mmol/L濃度的cAMP能夠被完全水解,但0.05 mmol/L濃度的cGMP水解率僅達(dá)到了53.53%,說明雙底物體系中C. albicansPDE2優(yōu)先水解cAMP。因此,兩種體系均證明了C. albicansPDE2對cAMP具有更高的親和力。

    表2 不同質(zhì)量濃度C. albicans PD2對底物的水解率Table 2 ydrolysis efficiency of substrates by different concentrations of C. albicansPD2

    表2 不同質(zhì)量濃度C. albicans PD2對底物的水解率Table 2 ydrolysis efficiency of substrates by different concentrations of C. albicansPD2

    %酶質(zhì)量濃度/(mg/mL) 底物 cAMP/cGMP(0.4 mmol/L)0.05 mmol/L cAMP+0.35 mmol/L cGMP 0.1 mmol/L cAMP+0.3 mmol/L cGMP 0.2 mmol/L cAMP+0.2 mmol/L cGMP 0.35 mmol/L cAMP+0.05 mmol/L cGMP 0.385 cAMP 77.11±13.35 100.23±0.01 100.12±0.01 99.55±0.72 87.17±1.91 cGMP 61.15±24.09 64.12±6.77 63.66±9.53 55.96±27.48 53.53±1.58 0.077 cAMP 28.42±1.63 100.23±0.01 62.67±4.39 42.71±2.91 52.31±24.88 cGMP 20.81±0.19 16.39±2.09 15.92±3.3 19.51±0.82 27.05±16.62 0.015 3 cAMP 8.88±1.34 21.34±9.54 20.27±5.64 12.8±0.74 10.56±3.1 cGMP 7.48±0.13 5.9±2.67 8.62±0.62 9.56±1.13 7.62±0.4

    3 結(jié) 論

    目前,廣大研究學(xué)者對真菌的調(diào)控進(jìn)行了廣泛研究,其中環(huán)核苷酸磷酸酶PDE能夠?qū)φ婢鸬街匾恼{(diào)控作用。如Zhang Haifeng等[27]對稻瘟病菌的毒性作用機(jī)制的研究中,發(fā)現(xiàn)兩種pdeL/pdeH基因?qū)z生長、孢子生成等起到重要調(diào)控作用;有研究通過過量表達(dá)酵母菌的pde2基因,使酵母具有較高的乙醇耐受性[28-29]。因此以上結(jié)論充分證明了真菌胞內(nèi)PDE2對于菌體的生長代謝及致病性有著重要的調(diào)控作用。本研究通過IPTG誘導(dǎo)大量表達(dá)蛋白菌體,通過多種柱層析手段對目的蛋白進(jìn)行分離純化,最終得到高純度的C. albicansPDE2蛋白,平均每克表達(dá)菌體可獲得2.8 U蛋白。通過HPLC檢測底物減少量或產(chǎn)物生成量分析蛋白酶的水解能力,從而確定所獲得的酶活力。結(jié)果表明所純化的蛋白具有較高的水解cAMP和cGMP的能力,其在0.385 mg/mL質(zhì)量濃度下,對0.4 mmol/L的cAMP和cGMP的水解率達(dá)到60%~70%,這與前期報(bào)道釀酒酵母PDE1作用方式一致[30]。但是該酶對cAMP的親和力高于cGMP。本研究得到高純度、高活性的C. albicansPDE2,為蛋白的晶體學(xué)解析提供前期基礎(chǔ),以期進(jìn)一步篩選以該酶為靶點(diǎn)的天然活性物質(zhì),以及解析食品中C. albicans的生長和致病性調(diào)控機(jī)制。

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