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    酶法合成亞麻酸磷脂的結(jié)構(gòu)特性及抗氧化性

    2020-12-12 13:26:50肖志剛楊國強(qiáng)楊慶余王麗爽張雪萍郭世龍
    食品科學(xué) 2020年22期
    關(guān)鍵詞:酯交換亞麻酸籽油

    肖志剛,楊國強(qiáng),楊慶余,王麗爽,張雪萍,郭世龍,李 哲,楊 舒,2,

    (1.沈陽師范大學(xué)糧食學(xué)院,遼寧 沈陽 110034;2.沈陽大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧 沈陽 110034)

    牡丹籽油是一種天然植物油脂,已經(jīng)正式成為我國的新資源食用油品種之一[1]。在牡丹籽油中,亞麻酸含量高達(dá)50%以上,亞麻酸的含量高于大宗食用油,其與亞麻籽油的含量基本相近[2-4]。亞麻酸在人體內(nèi)可代謝生成DPA和DHA,同時(shí)它也是構(gòu)成細(xì)胞膜和生物酶的基礎(chǔ)物質(zhì),能夠提高機(jī)體免疫力,在抗氧化、降血脂、降血糖、提高腦神經(jīng)功能、緩解視疲勞、降血壓、減肥等方面具有重要作用。目前,對牡丹籽油的研究主要集中于提取工藝、脂肪酸組成分析、油脂穩(wěn)定性及影響因素、功能評價(jià)等方面,在一些食品領(lǐng)域的應(yīng)用還尚未開發(fā)[5-9]。

    大豆磷脂(soybean phospholipid,SP)是生物膜的一種基本成分,而且對機(jī)體的正常代謝有重要的調(diào)節(jié)功能,它被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飼料、化妝等行業(yè),這是由磷脂的多種功能特性決定的,比如抗氧化、乳化、潤濕等,SP的生理活性與其脂肪酸組成和極性末端的組成密切相關(guān)[10-13]。有關(guān)研究表明脂肪酸與磷脂經(jīng)酶催化發(fā)生酯化反應(yīng),得到改性磷脂,其理化性質(zhì)和生物活性較原磷脂均有不同程度改變,可有效提高脂肪酸在體內(nèi)的吸收與利用程度[14-17]。Ghosh等[18]采用微生物脂肪酶催化癸酸、月桂酸、豆蔻酸及亞麻酸甲酯與卵磷脂發(fā)生酯交換反應(yīng),卵磷脂改性后其表面活性增強(qiáng),從而使磷脂具有更好的應(yīng)用價(jià)值。

    有研究表明亞麻酸磷脂(linolenic acid phospholipid,LNA-P)對人與動(dòng)物的肝功能具有保護(hù)作用,它能調(diào)節(jié)膽固醇在人體內(nèi)的含量、有效降低膽固醇、高血脂及冠心病的發(fā)病率,促進(jìn)大腦發(fā)育與記憶力,能夠作為一種安全性高、無毒副作用的新型天然抗氧化劑[19-21]。Nathalie等[22]以Lipozyme TL IM為催化劑,在正己烷溶劑體系下催化卵磷脂與兩種富含共軛亞麻酸的油脂,即卵磷脂與亞麻籽油異構(gòu)化濃縮物和石榴籽油發(fā)生酯交換反應(yīng),以得到富含共軛亞油酸的卵磷脂。袁博等[23]研究發(fā)現(xiàn)大豆卵磷脂是一種抗氧化效果優(yōu)良的天然抗氧化劑。近年來國內(nèi)外關(guān)于改性磷脂的研究已有相關(guān)報(bào)道,常見用于和磷脂反應(yīng)的脂肪酸有中長鏈飽和脂肪酸、EPA、DHA、CLA和ARA等[24-25]。但它們研究主要集中在酶催化合成的工藝優(yōu)化、分離純化等,針對改性磷脂的結(jié)構(gòu)特性與抗氧化活性研究比較少。具有抗氧化能力的食物作為可以保護(hù)人體健康的天然抗氧化劑受到大眾越來越多的關(guān)注,因此對食物含有的抗氧化活性物質(zhì)及抗氧化能力進(jìn)行檢測和鑒定具有重要意義[26]。鑒于以上方面,由于牡丹籽油中亞麻酸含量達(dá)到50%以上,將牡丹籽油與SP經(jīng)酶催化進(jìn)行酯交換反應(yīng),有利于提高亞麻酸的結(jié)合率,同時(shí)能夠發(fā)揮亞麻酸的生理功效。

    為此,本實(shí)驗(yàn)以Lipozyme RM IM酶作為催化劑,SP與牡丹籽油為原料,通過添加不同含量的酶制備得到亞麻酸含量不同的LNA-P,采用氣相色譜、紅外光譜、差示掃描量熱儀及X射線衍射等分析儀器進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征和分析,并比較SP與LNA-P清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基、2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)陽離子自由基、羥自由基的能力進(jìn)行研究,以期為SP的抗氧化性開發(fā)與研究提供理論基礎(chǔ)與依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    SP(≥90%) 沈陽天峰生物工程技術(shù)有限公司;牡丹籽油 菏澤中禾健元生物科技有限公司;Lipozyme RM IM酶 諾維信(中國)有限公司;DPPH、ABTS+抗氧化活性測試試劑盒 阿拉丁試劑(上海)有限公司;正己烷 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;丙酮、無水乙醇、甲醇、氫氧化鈉、過硫酸鉀、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    GC-2014C氣相色譜儀 北京北分華譜分析儀器技術(shù)有限公司;UV-9000型紫外-可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;SHA-C恒溫振蕩培養(yǎng)箱 常州國華電器有限公司;AL104-IC電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;HH-6A數(shù)顯恒溫磁力攪拌水浴鍋 上海漢諾儀器有限公司;MODEL J-E多用途高效離心機(jī) 貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司;Nicolet 380型傅里葉紅外光譜儀 美國Thermo公司;Q20型差示掃描量熱儀 美國TA儀器公司;Ultima IV型X射線衍射儀 德國Bruker公司。

    1.3 方法

    1.3.1 LNA-P的制備方法

    將SP與牡丹籽油按1∶4質(zhì)量比混合均勻置于20 mL的玻璃瓶中,然后分別加入占體系質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、6%、8%、12%的酶和2 mL正己烷,所制備得到的樣品分別編號LNA-P-1、LNA-P-2、LNA-P-3、LNA-P-4。置于50 ℃恒溫水浴振蕩培養(yǎng)搖床中,以200 r/min的速率振蕩16 h后,待酯化反應(yīng)結(jié)束后低速4 000 r/min離心10 min,回收固定化酶,重復(fù)離心2 次,以便最大限度除去反應(yīng)酶,混合液50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),除去溶劑。反應(yīng)后的混合液加入3 倍體積的冷丙酮(0 ℃)洗滌,攪拌10 min后4 000 r/min離心,以洗脫游離的脂肪酸,直至取少量上清液于潔凈的玻璃片上,快速揮干后無油漬為止,所得固形物經(jīng)氮?dú)獯蹈杉吹玫絃NA-P,并保存于冰箱以備用。

    1.3.2 磷脂中亞麻酸含量的測定

    甲酯化:取樣品約30~50 mg于10 mL試管中,加入0.5 mol/L的KOH-甲醇溶液2 mL,置于70 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)約10 min,反應(yīng)過程不時(shí)振蕩,至磷脂溶解,冷卻2 min,然后加入1 mL BF3-甲醇溶液,置于70 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)5 min,使甲酯化完全[27]。然后冷卻,加入2 mL正己烷,經(jīng)過渦旋振蕩器振蕩,以促進(jìn)磷脂在正己烷中的溶解。然后吸取上層正己烷相溶液,待用。

    樣品經(jīng)甲酯化后用氣相色譜進(jìn)行脂肪酸分析。氣相色譜檢測條件:色譜柱HB-88(30 m×0.25 mm,0.2 μm)。升溫程序:60 ℃保持5 min,然后20 ℃/min升至210 ℃,保持2 min,再以20 ℃/min升溫至240 ℃,保持2 min。載氣為N2,流量1.1 mL/min,壓力0.5 MPa;燃?xì)鉃镠2,流量40 mL/min,壓力0.25 MPa;助燃?xì)鉃榭諝?,流?00 mL/min,壓力0.5 MPa;柱前壓20 psi;分流比30∶1;進(jìn)樣量1 μL;進(jìn)樣口溫度250 ℃,檢測器溫度280 ℃。計(jì)算采用面積歸一化法,合成率計(jì)算公式如下:

    1.3.3 紅外光譜分析

    稱取少量樣品,利用KBr壓片,通過Nicolet 380型傅里葉紅外光譜儀測定,測定參數(shù):分辨率為4 cm-1,每個(gè)樣品掃描32 次,選取掃描波長500~4 000 cm-1進(jìn)行分析。

    1.3.4 X射線衍射分析方法

    取適量的樣品進(jìn)行X射線衍射分析,測量的工作參數(shù)為:采用Cu-Kα靶、石墨單色器、40 kV和40 mA,及反發(fā)射狹縫為10 mm,接受狹縫0.3 mm,掃描速率5 °/min,掃描范圍2θ5°~70°,然后根據(jù)布拉格公式:d=λ/2sinθ,計(jì)算d值。

    1.3.5 差式掃描量熱儀分析方法

    采用DSC-Q2差式掃描量熱儀測定。用鋁盒分別稱取4.0~7.0 mg樣品,壓蓋密封,以空鋁盒為對照樣,掃描溫度范圍為100~170 ℃,升溫速率為10 ℃/min。

    1.3.6 抗氧化性分析

    1.3.6.1 DPPH自由基清除能力分析

    參照文獻(xiàn)[28]方法。以無水乙醇為溶劑,配制濃度為2×10-4mol/L的DPPH自由基溶液,配制相同質(zhì)量濃度為20 mg/mL的磷脂樣品溶液,精確吸取2 mL磷脂溶液,加入1 mL DPPH自由基溶液,搖勻后在暗室下放置30 min,在517 nm波長處測定上述溶液的吸光度。按照式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率,同一測定重復(fù)3 次。

    式中:A為樣品與DPPH自由基混合溶液的吸光度;A0為樣品與無水乙醇混合溶液的吸光度;A1為無水乙醇與DPPH自由基混合溶液的吸光度。

    1.3.6.2 ABTS陽離子自由基清除能力分析

    參照文獻(xiàn)[29]方法。將ABTS及過硫酸鉀用少量水溶解,再以無水乙醇為溶劑配制濃度為7×10-3mol/L的ABTS溶液與濃度為2.5×10-3mol/L的過硫酸鉀溶液,并將二者等體積混合,在暗處放置12 h后取混合溶液稀釋50 倍待用。配制相同質(zhì)量濃度為20 mg/mL的磷脂樣品溶液,精確吸取2 mL磷脂溶液,加入1 mL ABTS和過硫酸鉀混合溶液,搖勻后于室溫條件下避光30 min。以無水乙醇作為對照,在734 nm波長處分別測定上述溶液的吸光度。按照式(3)計(jì)算其清除率,同一測定重復(fù)3 次。

    式中:A為樣品與ABTS和過硫酸鉀混合溶液的吸光度;A0為樣品與無水乙醇混合溶液的吸光度;A1為無水乙醇與ABTS和過硫酸鉀混合溶液的吸光度。

    1.3.6.3 羥自由基清除能力分析

    參照文獻(xiàn)[30]方法。配制1.8 mmol/L硫酸亞鐵溶液、1.8 mmol/L過氧化氫溶液、1.8 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液、配制相同質(zhì)量濃度為20 mg/mL的磷脂樣品溶液,按順序加入到試管中,振蕩后靜置10 min,以蒸餾水為參比,于510 nm波長處測吸光度,代入式(4)計(jì)算清除率,同一測定重復(fù)3 次。

    式中:Ao為硫酸亞鐵、水楊酸-乙醇溶液、蒸餾水與過氧化氫混合溶液吸光度;Ai為硫酸亞鐵、水楊酸-乙醇溶液、樣品液與過氧化氫混合溶液的吸光度;Aj為硫酸亞鐵、蒸餾水、樣品液與過氧化氫混合溶液吸光度。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    采用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,均值之間的顯著差異通過Duncan多重范圍檢驗(yàn)得到,實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)經(jīng)Origin 9.1處理并作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 酶添加量對LNA-P合成率的影響

    圖1 SP和LNA-P的氣相色譜圖Fig. 1 GC profiles of SP and LNA-P

    圖2 酶添加量對亞麻酸合成率的影響Fig. 2 Effect of enzyme dosage on the synthesis rate of linolenic acid

    由圖1可知,酯化前后混合脂肪酸的組成在氣相色譜圖中表現(xiàn)出了明顯的差異,SP經(jīng)過酯化反應(yīng)后,可以發(fā)現(xiàn)亞麻酸的峰急劇升高。由圖2可知,酶添加量能顯著增強(qiáng)亞麻酸合成率(P<0.05),隨著加酶量的增加,亞麻酸合成率逐漸上升,以4%、6%、8%、12%的酶添加量分別制備得到合成率為8.4%(LNA-P-1)、13.7%(LNA-P-2)、18.4%(LNA-P-3)、23.4%(LNA-P-4),這是由于酶促反應(yīng)主要是酶活性基團(tuán)與底物作用的結(jié)果,隨著加酶量的增加,活性基團(tuán)增加,酶活性的位點(diǎn)不斷增加,加速了酶促反應(yīng),杜俊民等[31]以較高純度的亞麻酸乙酯為?;w與磷脂進(jìn)行酯交換反應(yīng),隨著脂肪酶量達(dá)到最大,其亞麻酸的結(jié)合率可達(dá)20%,這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。說明經(jīng)Lipozyme RM IM酶催化合成了富含LNA-P。

    2.2 分子間化學(xué)鍵變化的分析

    圖3 SP和LNA-P的紅外圖譜Fig. 3 IR spectra of SP and LNA-P

    由圖3可知,在2 916、2 850 cm-1出現(xiàn)的峰是C—H伸縮振動(dòng)吸收峰;由于SP中具有許多C—H的結(jié)構(gòu)。在1 736、1 462 cm-1,出現(xiàn)的尖峰分別為C=O的伸縮振動(dòng)區(qū)和—OH彎曲振動(dòng)吸收峰;而酯交換后的LNA-P在1 736、1 462 cm-1的吸收峰未發(fā)生明顯的變化,這說明SP中C=O和—OH結(jié)構(gòu)未參與反應(yīng)。在1 235 cm-1和1 175、1 056 cm-1出現(xiàn)的吸收峰分別為C—O與C—O—C的伸縮振動(dòng)峰,經(jīng)酯交換反應(yīng)后LNA-P紅外圖譜中吸收峰位置移到1 223、1 152、1 038 cm-1位置上,說明SP中C—O和C—O—C結(jié)構(gòu)發(fā)生酯化反應(yīng),亞麻酸進(jìn)行了取代反應(yīng),形成了新的酯[32]。在967、817、711 cm-1出現(xiàn)的吸收峰為C—H的變形振動(dòng)峰,經(jīng)酯化反應(yīng)后吸收峰基本無變化,說明SP的C—H結(jié)構(gòu)未參加反應(yīng)。表明SP與牡丹籽油發(fā)生了酯交換反應(yīng),形成了LNA-P。

    2.3 晶型結(jié)構(gòu)特征的分析

    由圖4可以看出,SP在7.82°、20.47°處附近有明顯的衍射峰,其晶面間距d分別為11.296、4.334 ?,通過酯交換反應(yīng)后在7.82°、20.47°附近處的特征峰強(qiáng)度顯著消失與降低,這可能是因?yàn)轷ソ粨Q反應(yīng)過程破壞了原磷脂的結(jié)晶區(qū)域,形成了新的酯,亞麻酸取代了SP中脂肪酸組成結(jié)構(gòu),導(dǎo)致在7.82°、20.47°的衍射峰強(qiáng)度消失與降低,SP與LNA-P都在20.47°左右存在衍射峰,沒有呈晶體的趨勢,屬于無定型結(jié)構(gòu)[33]。表明其中的磷脂與牡丹籽油發(fā)生酯交換反應(yīng),晶型結(jié)構(gòu)被破壞,再重新組合形成LNA-P晶型結(jié)構(gòu)。

    圖4 SP和LNA-P的X-衍射圖譜Fig. 4 XRD patterns of SP and LNA-P

    2.4 差示掃描量熱儀分析

    圖5 SP和LNA-P的差式掃描量熱圖Fig. 5 DSC profiles of SP and LNA-P

    由圖5可以看出,SP是一種無定型物質(zhì),沒有固定熔融峰,因?yàn)镾P為混合物,關(guān)于其吸熱峰的報(bào)道多不一致[34-35]。圖5中LNA-P在DSC曲線上有多處峰的波動(dòng),可能是不同組分在不同的溫度條件下表現(xiàn)出不同的熱量變化。LNA-P有一個(gè)最大熔融峰,且隨著亞麻酸含量的增加,其熔融峰溫度逐漸升高,酯交換制備得到8.4%、13.7%、18.4%、23.4%的LNA-P熔融峰溫度分別為131.50、137.51、138.91、147.99 ℃。這可能是由于SP和牡丹籽油發(fā)生酯化反應(yīng)后形成了新的酯,SP的相變溫度發(fā)生變化,導(dǎo)致其熔融峰的溫度發(fā)生了變化,改變了其熱力學(xué)性質(zhì)。

    2.5 抗氧化性分析

    2.5.1 DPPH自由基清除能力分析

    圖6 SP與LNA-P的DPP自由基清除能力Fig. 6 DPPH radical scavenging capacities of SP and LNA-P

    由圖6可知,SP與LNA-P清除DPPH自由基能力存在顯著性的差異(P<0.05),隨著亞麻酸含量的升高,LNA-P對DPPH自由基清除率也逐漸增大,LNA-P-1、LNA-P-2、LNA-P-3、LNA-P-4,對DPPH自由基清除率分別為22.1%、26.1%、33.9%、45.2%。這是由于亞麻酸含量的增多,LNA-P與自由基發(fā)生氧化還原反應(yīng)的能力提高,更有利于捕捉自由基,使得DPPH自由基清除率提高[36-37]。表明LNA-P與SP相比具有更強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。

    2.5.2 ABTS陽離子自由基清除能力分析

    圖7 SP與LNA-P的ABTS陽離子自由基清除能力Fig. 7 ABTS cation radical scavenging abilities of SP and LNA-P

    由圖7可以看出,LNA-P對ABTS陽離子自由基的清除率顯著高于SP,LNA-P-1、LNA-P-2、LNA-P-3、LNA-P-4對ABTS陽離子自由基清除率分別為26.7%、29.5%、41.2%、52.2%。這是由于亞麻酸含量提高,LNA-P與ABTS陽離子自由基反應(yīng)過程中有新的共軛結(jié)構(gòu)生成,更易于捕捉自由基,使得ABTS陽離子自由基的清除率增強(qiáng)[38-39]。說明亞麻酸含量越高,LNA-P清除ABTS陽離子自由基能力越強(qiáng)。

    2.5.3 羥自由基清除能力分析

    圖8 SP與LNA-P的羥自由基清除能力Fig. 8 Hydroxyl radical scavenging capacities of SP and LNA-P

    由圖8可以看出,隨著亞麻酸含量的增加,LNA-P清除羥自由基的能力顯著升高,LNA-P-1、LNA-P-2、LNA-P-3、LNA-P-4,對羥自由基清除率分別為24.6%、37.5%、46.1%、73.4%。這可能由于亞麻酸自身具有一定的抗氧化性,LNA-P與羥自由基發(fā)生反應(yīng),使得羥基暴露增加,更有利于捕捉自由基,提高了自由基的清除率[40-41]。這表明亞麻酸含量越多,能顯著提高LNA-P對羥自由基清除能力。

    3 結(jié) 論

    通過對脂肪酶Lipozyme RMIM催化合成的LNA-P進(jìn)行了研究,以氣相色譜測定不同酶添加量下LNA-P的合成率。采用紅外光譜、X射線衍射及差示掃描量熱儀等分析手段對LNA-P進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征,研究LNA-P對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、羥自由基的清除能力。研究結(jié)果表明,SP與牡丹籽油經(jīng)Lipozyme RM IM酶催化合成LNA-P,酶添加量為4%、6%、8%、12%制備的LNA-P合成率分別為8.4%、13.7%、18.4%、23.4%,磷脂中的C—O與C—O—C鍵的吸收峰位置變化明顯,有典型的酯基特征結(jié)構(gòu),在差示掃描量熱儀分析中LNA-P的最大熔融峰的溫度呈升高趨勢,在LNA-P合成率為23.4%時(shí),熔融峰溫度達(dá)到最大為147.99 ℃,經(jīng)酯交換反應(yīng)后LNA-P在7.82°(d=11.296 ?)附近的衍射峰消失與在20.47°(d=4.334 ?)附近的衍射峰的強(qiáng)度降低。這都說明了SP與牡丹籽油發(fā)生了酯化反應(yīng),改變了SP的結(jié)構(gòu)與組成,形成了LNA-P。在抗氧化性實(shí)驗(yàn)中,亞麻酸結(jié)合率越高,LNA-P對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、羥自由基的清除率越高,LNA-P合成率為23.4%時(shí),對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、羥自由基清除率最大達(dá)到45.2%、52.2%和73.4%,說明了制備的LNA-P具有較強(qiáng)的抗氧化性能力。綜上所述,由于酶催化發(fā)生酯交換反應(yīng)將亞麻酸結(jié)合到SP分子結(jié)構(gòu)上合成LNA-P,SP的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,其抗氧化能力顯著提高,為SP的研究提供了有效的基礎(chǔ),為SP的抗氧化活性提供了有效的理論依據(jù)。

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