果膠、BSA及殼寡糖相互作用及對(duì)BSA負(fù)載效果的影響

范麗萍，張立彥，陳列歡

（1.嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 梅州 514015；2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640；3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，廣東 廣州 510225）

由于蛋白質(zhì)或肽類功能食品或藥物在胃腸道環(huán)境中耐受性差，易變性或降解[1]，且不易在腸部吸收，不能實(shí)現(xiàn)靶向或定點(diǎn)釋放，降低其功能性或治療效果。蛋白質(zhì)或肽作為兩性電解質(zhì)，可以通過靜電作用與易解離的高分子聚合物形成聚電解質(zhì)復(fù)合物（polyelectrolyte complexes，PEC），實(shí)現(xiàn)包埋或負(fù)載，以改善其耐受性、穩(wěn)定性及易吸收性[2]，成為近年來研究的熱點(diǎn)。例如，殼聚糖（chitosan，CS）可與聚陰離子聚合物形成具有pH敏感性、酶敏性的PEC[3-5]，用于蛋白質(zhì)或肽類等的包埋及負(fù)載，實(shí)現(xiàn)其在胃腸道內(nèi)的輸送及控釋。其水解產(chǎn)物殼寡糖（chiooligosaccharide，COS）（聚合度2～20）也具有CS類似的解離性質(zhì)，但具有比CS更好的水溶性、生物降解性、低溶血活性以及低細(xì)胞毒性等特性[6]，與果膠形成的復(fù)合物pH敏感性更高，適應(yīng)的pH值范圍更寬[7]，因此比CS更適合作為載體使用，受到越來越多的關(guān)注[8-9]。

目前，關(guān)于蛋白質(zhì)負(fù)載的方法有溫孵式和并入式2 種[10]。在多組分體系及靜電復(fù)合作用為主的情況下，同性電荷組分間的競爭作用普遍存在，顯著影響目標(biāo)物的結(jié)合效率及包埋效果[11]。目前的研究多以探討陰、陽離聚電解質(zhì)相互作用及復(fù)合條件影響為主[12-16]，并未考慮多組分體系內(nèi)蛋白質(zhì)與同性電荷分子組分間的相互作用，以及對(duì)負(fù)載效果的影響。

基于上述，本實(shí)驗(yàn)選取COS、果膠及其復(fù)合物為負(fù)載載體，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）為負(fù)載蛋白質(zhì)模型，探討不同復(fù)合方式下上述物質(zhì)二元及三元復(fù)合物顯微狀態(tài)及超微結(jié)構(gòu)、分子間作用及BSA復(fù)合率和負(fù)載率，考察果膠、COS、BSA分子間的相互作用及對(duì)BSA負(fù)載效果的影響，為探究果膠及COS復(fù)合物負(fù)載BSA的機(jī)制及效果奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

COS（平均分子質(zhì)量1.2 kDa，脫乙酰度90.14%）浙江金殼生物化學(xué)有限公司；果膠（P9135-100G，半乳糖醛酸含量不少于74.0%，酯化度66.7%） 美國Sigma-Aldrich公司；BSA 上海伯奧生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-25 pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；BS224S分析天平 德國賽多利斯集團(tuán)；TGL-16超速離心機(jī) 上海安科儀器有限公司；SHA-BA恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司；LGJ-10冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；Model752紫外-可見分光光度計(jì) 上?，F(xiàn)科分光儀器有限公司；CX31型光學(xué)顯微鏡 日本Olympus公司；Tensor 37傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 德國Bruker公司；COXEM EM-20臺(tái)式掃描電鏡 韓國Coxem公司。

1.3 方法

1.3.1 COS、果膠及BSA二元及三元PEC的制備

1.3.1.1 果膠/BSA靜電復(fù)合溶液的制備

室溫下，向含有NaCl、質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL的果膠溶液中加入一定體積pH 3.5、25 mg/mL BSA溶液，振蕩均勻，使最終復(fù)合溶液中果膠質(zhì)量濃度為2 mg/mL、NaCl濃度為30 mmol/L，BSA質(zhì)量濃度為5 mg/mL，pH值為3.5。該方法簡記為“果膠＋BSA”。

1.3.1.2 COS/果膠復(fù)合溶液制備

室溫下，向含有NaCl、質(zhì)量濃度2.5 mg/mL的果膠溶液中加入一定體積的pH 3.5、10 mg/mL的COS溶液，振蕩均勻，使最終復(fù)合溶液中果膠和COS的質(zhì)量濃度分別為2 mg/mL和1.2 mg/mL，NaCl濃度為30 mmol/L，pH值為3.5。方法簡記為“果膠＋COS”。

1.3.1.3 COS＋BSA混合溶液制備

室溫下，向pH值為3.5，25 mg/mL的BSA溶液中加入一定體積的pH 3.5、10 mg/mL的COS溶液，調(diào)整溶液體積、pH值并振蕩均勻，使最終復(fù)合溶液中BSA和COS的質(zhì)量濃度分別為5 mg/mL和1.2 mg/mL。方法簡記為“COS＋BSA”。

1.3.1.4 COS、果膠及BSA三元復(fù)合溶液的制備

果膠＋BSA＋COS：向含有NaCl、pH 3.5、質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL的果膠溶液中加入一定質(zhì)量濃度25 mg/mL的BSA溶液，振蕩均勻后再加入一定體積pH 3.5、質(zhì)量濃度為10 mg/mL的COS溶液，振蕩均勻。最終復(fù)合溶液中果膠的質(zhì)量濃度為2 mg/mL，NaCl濃度為30 mmol/L，BSA質(zhì)量濃度為5 mg/mL，COS質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL，pH 3.5。

COS＋BSA＋果膠：取一定體積、pH 3.5、質(zhì)量濃度為10 mg/mL的COS溶液與BSA溶液（25 mg/mL，pH 3.5）均勻混合后，加入質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL的果膠溶液（pH 3.5），振蕩均勻。

COS＋果膠＋BSA：將上述COS/果膠復(fù)合溶液高速離心（8 000 r/min），沉淀經(jīng)冷凍干燥后浸泡于pH 3.5、5 mg/mL的BSA溶液中，30 min后取出復(fù)合物，瀝凈溶液，再次凍干后備用。

以上復(fù)合方式下，各物質(zhì)濃度條件是在前期研究中得出的較穩(wěn)定復(fù)合條件，復(fù)合溶液體系中果膠、COS及BSA、NaCl的濃度均一致，僅比較不同復(fù)合順序?qū)θ镔|(zhì)分子間相互作用的影響，不考察Na＋、Cl－對(duì)3 種大分子物質(zhì)間相互作用的影響。

1.3.2 溶液濁度的測定

將復(fù)合溶液振蕩10 s后，在600 nm波長處測定透光度T，并計(jì)算溶液濁度：

1.3.3 復(fù)合溶液狀態(tài)觀察

將試管中的復(fù)合溶液振蕩15 s混勻，拍照記錄溶液中復(fù)合物的宏觀狀態(tài)。復(fù)合溶液振蕩15 s后，滴加在載玻片上，利用光學(xué)顯微鏡觀察溶液及微粒的微觀狀態(tài)（放大40 倍），并拍照對(duì)比。

1.3.4 PEC得率的計(jì)算方法

COS/果膠溶液PEC得率計(jì)算：將COS/果膠復(fù)合溶液于磁力攪拌器上攪拌2 h，高速離心（8 000 r/min）后取沉淀，凍干。PEC得率按下式計(jì)算[17]：

負(fù)載BSA的PEC得率計(jì)算：將各復(fù)合方式所得PEC高速離心分離，收集沉淀物并冷凍干燥，得率按下式計(jì)算：

1.3.5 PEC對(duì)BSA的負(fù)載率及BSA復(fù)合率計(jì)算

將不同復(fù)合方式所得溶液進(jìn)行離心（8 000 r/min）分離，采用雙縮脲法測上清液中BSA溶液的濃度。PEC對(duì)BSA的負(fù)載率及BSA復(fù)合率按下式計(jì)算[17]：

1.3.6 PEC掃描電鏡觀察

將果膠、COS、BSA及各PEC貼在樣品臺(tái)上，噴金后用掃描電鏡觀察表觀形態(tài)并拍攝照片。

1.3.7 果膠、COS、BSA及各PEC的FTIR測定

取適量果膠、COS、BSA及各PEC凍干物，粉碎后直接壓片測定其FTIR。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Microsoft Excel 2007軟件求取實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0軟件的新復(fù)極差分析法Duncan比較各處理間差異的顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠、COS及BSA不同復(fù)合方式所得溶液的濁度比較

COS與CS類似，在pH值低于6.2時(shí)分子中的氨基質(zhì)子化形成—NH3＋，可與果膠分子上的—COO－通過靜電相互作用自組裝形成PEC[18]。而BSA在其等電點(diǎn)（pI 4.7）以下的溶液中帶正電荷，也可與果膠發(fā)生自組裝形成PEC[19]。

圖1 不同復(fù)合方式下溶液的濁度Fig. 1 Turbidities of complex solutions complexes obtained with different methods

由圖1可以看出，復(fù)合方式對(duì)溶液濁度及狀態(tài)有較大影響，各溶液狀態(tài)及濁度差別很大。果膠與BSA復(fù)合后溶液呈乳白色膠體狀態(tài)（果膠＋BSA），濁度最高。而COS與BSA所形成的溶液澄清透明（COS＋BSA），濁度在10以下，這是因?yàn)閜H 3.5條件下兩者都帶正電而未發(fā)生復(fù)合反應(yīng)。果膠與BSA復(fù)合后再添加COS（果膠＋BSA＋COS），所形成的復(fù)合溶液呈淡黃色（受COS顏色影響），溶液濁度與果膠＋BSA差異不顯著（P＞0.05），溶液靜置后PEC會(huì)沉淀析出。COS與BSA混合后再與果膠復(fù)合（COS＋BSA＋果膠），所形成的復(fù)合溶液濁度顯著低于果膠＋BSA（P＜0.05），與果膠＋BSA＋COS的濁度值差別不大（P＞0.05），但溶液狀態(tài)差異較大。在本研究條件下，果膠與COS復(fù)合后形成納米級(jí)極微小顆粒，溶液呈半透明膠體狀態(tài)。

2.2 不同復(fù)合溶液及微粒顯微狀態(tài)比較

由圖2可知，果膠與BSA形成的PEC呈尺寸較小的不規(guī)則顆粒，伴有少量大塊團(tuán)聚物，尺寸在微米級(jí)（COS＋BSA為澄清溶液，顯微鏡下無法觀察其微觀狀態(tài)，因此未列出）。果膠與BSA復(fù)合再加入COS后，PEC聚集成顏色較深、結(jié)構(gòu)較致密、尺寸更大的不規(guī)則微米級(jí)顆粒。分析原因，在pH 3.5、NaCl濃度為30 mmol/L時(shí)，BSA帶正電荷，果膠分子帶部分負(fù)電荷且分子鏈剛性較小，易卷曲、折疊[20]，可包裹橢圓形BSA形成較小的顆粒。果膠在與BSA形成PEC后再加入COS時(shí)，COS中的—會(huì)與顆粒表面果膠分子中游離—COO－結(jié)合，并使PEC顆粒團(tuán)聚，形成較大的三元PEC。同時(shí)，鏈狀COS也有可能與表面的BSA競爭果膠分子上的作用位點(diǎn)，使果膠分子拉長，三元PEC顆粒變大。COS＋BSA＋果膠形成的PEC顆粒不均勻，有較大團(tuán)塊出現(xiàn)，且結(jié)構(gòu)較致密，與圖1中顯示的溶液宏觀狀態(tài)相對(duì)應(yīng)。COS與果膠復(fù)合溶液中觀察不到明顯的PEC，此時(shí)PEC微粒太小，而有些則可能是水溶性的[21]。

圖2 不同復(fù)合方式下所得復(fù)合體系的微觀狀態(tài)Fig. 2 Microscopic morphology of complexes obtained with different methods

2.3 復(fù)合方式對(duì)BSA負(fù)載效果的影響

圖3 不同復(fù)合方式下BSA的負(fù)載率、復(fù)合率和PC得率Fig. 3 Loading and complexation rates of BSA and yield of BSA-loading PEC obtained with different methods

由圖3可知，果膠＋BSA復(fù)合時(shí)BSA負(fù)載率最高，為44.96%，其他3 種復(fù)合方式下負(fù)載率均較低且無顯著性差異（P＞0.05）。不同復(fù)合方式下BSA參與復(fù)合的復(fù)合率差異顯著（P＜0.05），高低順序?yàn)楣z＋BSA＞果膠＋BSA＋COS＞COS＋BSA＋果膠＞果膠＋COS＋BSA。COS＋BSA＋果膠和COS＋果膠＋BSA方式PEC得率最高且無顯著性差異（P＞0.05），果膠＋BSA＋COS時(shí)得率明顯降低（P＜0.05）。

果膠＋BSA方式下，BSA負(fù)載率和復(fù)合率最高，表明果膠分子與BSA結(jié)合非常充分，但再添加COS之后（果膠＋BSA＋COS），BSA負(fù)載率和復(fù)合率、PEC得率都明顯降低，說明PEC上部分BSA被COS替代，COS會(huì)與BSA競爭結(jié)合PEC表面的果膠分子。

COS＋BSA＋果膠方式下BSA復(fù)合率和負(fù)載率較前2 種方式都有所下降，由此可推測小分子且電荷密度較高的COS更易占據(jù)果膠分子上的負(fù)電荷基團(tuán)位點(diǎn)，優(yōu)先結(jié)合果膠。此方式下PEC得率較高的原因可能是因?yàn)镃OS為直鏈分子，與果膠形成的PEC為網(wǎng)狀或鏈狀，分子較展開[7]，暴露的游離—COO－較果膠＋BSA中PEC多（BSA為橢圓狀分子，與果膠形成的PEC顆粒較小[22]（圖2），果膠分子卷曲包裹，游離的—COO－易被包埋），更易于再進(jìn)一步結(jié)合COS或BSA而使PEC得率提高。

果膠/COS的PEC凍干后結(jié)構(gòu)致密、不易解離，BSA主要吸附在果膠/COS的PEC結(jié)構(gòu)上[16]，導(dǎo)致BSA復(fù)合率和負(fù)載率都不高，但得率較高。

2.4 不同復(fù)合方式所得PEC的超微結(jié)構(gòu)觀察

圖4 果膠、COS、BSA及不同復(fù)合方式所得PC掃描電鏡圖Fig. 4 SEM photographs of pectin, chiooligosaccharide, BSA and BSA-loading complexes obtained with different methods

由圖4可以看出，果膠為膠態(tài)顆粒，COS為球狀顆粒，而BSA則為片狀物。果膠＋BSA形成PEC主要呈現(xiàn)內(nèi)嵌圓形、橢圓形或不規(guī)則弧形等小孔隙的膠體樣結(jié)構(gòu)，孔隙分布較均勻，孔徑約在3～20 μm之間，表明形成的PEC較均勻。5 000 倍觀察圖可見網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中孔隙壁較厚，表面較光滑但有凹陷，推理認(rèn)為在本研究條件下果膠較柔軟、易包裹BSA分子[20]，使得孔壁較光滑。

PEC＋BSA形成二元PEC再與COS復(fù)合（果膠＋BSA＋COS），所得三元PEC中可見明顯的蜂窩孔狀結(jié)構(gòu)，孔隙呈較規(guī)則的圓形或橢圓形，但孔隙分布及孔徑都較不均勻，繼續(xù)放大可見部分孔隙壁層較薄，表面光滑均勻。結(jié)合圖3的結(jié)果，這可能是因?yàn)镃OS與顆粒表面果膠分子上游離—COO－復(fù)合，或與已復(fù)合的BSA競爭結(jié)合位點(diǎn)，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[7]，導(dǎo)致微粒表層及內(nèi)部PEC結(jié)構(gòu)不均勻，這也是微粒核-殼結(jié)構(gòu)的體現(xiàn)。

COS＋BSA＋PEC復(fù)合時(shí)，所形成的三元PEC呈膠體樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔隙不規(guī)則且較少，孔壁表面粗糙、有褶皺。從圖中可以看出PEC超微結(jié)構(gòu)更接近果膠＋BSA＋COS溶液中PEC的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，只是壁層較厚，可推測果膠分子趨向于先與COS結(jié)合并形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而后再與BSA復(fù)合，使壁膜增厚。由此佐證圖3的推測：COS、BSA與果膠分子競爭性結(jié)合，果膠分子更傾向于結(jié)合電荷密度更高的直鏈分子COS。沈亞麗[23]認(rèn)為帶相反電荷分子之間的靜電吸引作用與兩者分子所帶電荷密度呈線性正相關(guān)關(guān)系，可以為上述推測提供支持。

以凍干的COS/果膠溶液PEC吸附BSA（果膠＋COS＋BSA），PEC表現(xiàn)為均勻規(guī)則的密集網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)有細(xì)小且均勻的不規(guī)則孔隙，孔壁較厚且光滑。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，COS與果膠溶液PEC（果膠＋COS）凍干后結(jié)構(gòu)致密（圖4H），BSA加入后三元PEC卻呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其原因值得探討。

2.5 不同復(fù)合方式所得復(fù)合物的FTIR分析

圖5 果膠、COS、BSA及不同復(fù)合方式所得圖Fig. 5 FTIR spectra of pectin, chiooligosaccharide, BSA and complexes obtained with different methods

由圖5可知，COS的吸收特征峰與CS基本相同，分子上的O—H伸縮振動(dòng)吸收峰和N—H伸縮振動(dòng)吸收峰在3 750～3 050 cm－1處重疊成的一個(gè)寬峰，在1 632 cm－1處為未?；?-氨基葡萄糖胺中的N—H的伸縮振動(dòng)峰（酰胺I帶），1 520 cm－1處為N—H的彎曲振動(dòng)峰（酰胺II帶）[24]；果膠分子上的羧酸O—H締合伸縮振動(dòng)在3 700～3 100 cm－1區(qū)出現(xiàn)強(qiáng)峰，在1 748 cm－1處和1 647 cm－1處分別為酯羰基C＝O及羧基—COO－的伸縮振動(dòng)峰[23,25]；BSA的特征峰為3 287 cm－1氨基峰、1 645 cm－1（C＝O鍵伸縮（酰胺I帶））、1 535 cm－1（C—N鍵伸縮及N—H鍵合（酰胺II帶）和1 394 cm－1（N—H振動(dòng)（酰胺III帶）的乙酰氨基峰[26]。3 種物質(zhì)以不同方式復(fù)合后，所得復(fù)合物的紅外光譜圖不甚相同。

果膠與BSA復(fù)合時(shí)（PEC＋BSA），果膠分子C—H伸縮振動(dòng)峰及酯羰基C＝O分別紅移到2 912 cm－1和1 737 cm－1，且峰高度顯著減弱，表明這些基團(tuán)被包裹，果膠分子卷曲。另外，果膠1 647 cm－1處的羧基和BSA 1 535 cm－1處的酰胺II帶合并為1 522 cm－1較小的吸收峰，BSA的酰胺III帶也發(fā)生了紅移（1 387 cm－1），說明果膠分子上的—COO－與BSA分子上的—NH3＋之間通過靜電作用結(jié)合[27]，但BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)基本沒變（酰胺I帶由1 645 cm－1紅移至1 651 cm－1，仍為無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)）[28-29]。

PEC＋BSA＋COS三元PEC的—OH伸縮振動(dòng)峰較PEC＋BSA二元PEC進(jìn)一步藍(lán)移到3 469 cm－1處且峰強(qiáng)度變大，C—H伸縮振動(dòng)峰則紅移到2 943 cm－1處且峰強(qiáng)度增大，這是COS加入的體現(xiàn)。與PEC＋BSA相比，PEC酰胺I帶吸收峰位置及強(qiáng)度基本未變，反映此復(fù)合方式時(shí)COS結(jié)合量較少。PEC的酰胺II帶藍(lán)移到1 543 cm－1，其他各特征峰的波數(shù)變化不大，而強(qiáng)度略有增加（例如酰胺I帶及II帶），表明COS也主要以靜電作用結(jié)合在PEC＋BSA的PEC上。

對(duì)于COS＋BSA＋果膠方式形成的PEC，C—H伸縮振動(dòng)峰較果膠＋BSA＋COS中的PEC稍微紅移（2 935 cm－1）且峰強(qiáng)度變大，推測此時(shí)PEC微粒表面的果膠和/或COS的量較多且更伸展，易被檢測到。PEC酰胺II帶特征峰紅移至1 531 cm－1處，其他各特征峰的強(qiáng)度明顯變大（尤其是酰胺I帶及II帶吸收峰），表明各分子之間的作用力沒有改變。對(duì)比各物質(zhì)紅外光譜圖發(fā)現(xiàn)COS＋BSA＋果膠三元PEC的結(jié)構(gòu)更接近多糖分子或有COS加入時(shí)的PEC，可進(jìn)一步證明2.3節(jié)關(guān)于COS、BSA及果膠競爭結(jié)合的推測。另外，復(fù)合物酰胺I帶向高波數(shù)移動(dòng)（1 654 cm－1），表明BSA分子二級(jí)結(jié)構(gòu)由無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)向α-螺旋轉(zhuǎn)變[29]，這可能是由于此方式下COS加入使得果膠結(jié)構(gòu)變化，BSA為了更好地與果膠結(jié)合而發(fā)生結(jié)構(gòu)改變。

COS與果膠復(fù)合時(shí)（COS＋果膠），所形成的PEC的—OH伸縮振動(dòng)峰紅移到3 352 cm－1處，但強(qiáng)度顯著減弱，表明此時(shí)兩分子之間存在較強(qiáng)的氫鍵[25]，這與有BSA參與的PEC結(jié)構(gòu)顯著不同，推測是由于BSA為橢圓形分子，與果膠結(jié)合后使果膠分子卷曲，分子上易與COS形成氫鍵的基團(tuán)被包埋；另外，COS＋果膠二元PEC酰胺II帶吸收峰強(qiáng)度非常小，表明此時(shí)COS分子上的游離氨基—NH2充分復(fù)合，含量減少，信號(hào)降低[30]。在COS/果膠復(fù)合物上吸附BSA（COS＋果膠＋BSA），三元PEC的—OH伸縮振動(dòng)峰顯著藍(lán)移，推測BSA加入破壞了果膠及COS之間的氫鍵；果膠及COS其余各特征峰基本消失，表明此時(shí)PEC表面主要吸附覆蓋了BSA，紅外光譜表現(xiàn)BSA的基本特征；PEC酰胺II帶吸收峰幾乎消失，說明此時(shí)PEC中的游離氨基被完全復(fù)合；PEC的酰胺I帶吸收峰由BSA的1 645 cm－1紅移到1 628 cm－1，推測BSA結(jié)構(gòu)由無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊[26]，可能是BSA為了適應(yīng)COS/果膠復(fù)合物構(gòu)造而發(fā)生了結(jié)構(gòu)改變。

3 結(jié) 論

不同復(fù)合方式下，果膠、COS及BSA復(fù)合順序不同，所形成的二元及三元PEC結(jié)構(gòu)、狀態(tài)及對(duì)BSA的結(jié)合效果顯著不同，其紅外光譜差異也較大。

在果膠質(zhì)量濃度為2 mg/mL、NaCl濃度為30 mmol/L，BSA質(zhì)量濃度為5 mg/mL，pH值為3.5條件下，三者之間主要通過靜電作用進(jìn)行結(jié)合，其中COS會(huì)與BSA競爭結(jié)合果膠分子上的負(fù)電位點(diǎn)，降低PEC對(duì)BSA的復(fù)合及負(fù)載。

在三元物質(zhì)復(fù)合過程中，為了與果膠有效結(jié)合，BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，其加入會(huì)破壞果膠與COS之間形成的氫鍵。