MicroRNAs與紅系生長發(fā)育、增殖、分化及凋亡相關(guān)性研究進(jìn)展

趙星云 卞茂紅

miRNA是一種內(nèi)源性長約21～26個(gè)堿基的非編碼單鏈小分子RNA[1]。它在紅細(xì)胞的生長發(fā)育、增殖、分化及凋亡的過程中參與調(diào)控。以下是對miRNA參與紅系凋亡機(jī)制的介紹。

1 miRNA

1.1 miRNA的生成與作用：在細(xì)胞核內(nèi)，編碼miRNA的基因先轉(zhuǎn)錄成原始miRNA轉(zhuǎn)錄本，其在RNaseⅢ核酸酶Drosha的作用下，被剪切成約70 nt的發(fā)夾狀前體miRNA(premiRNA)。pre-miRNA再從核內(nèi)運(yùn)輸?shù)桨|(zhì)中，被核酸酶Dicer剪切成長約22個(gè)核苷酸的雙螺旋miRNA。隨后雙螺旋解旋，互補(bǔ)鏈立即被降解，另一條鏈即為成熟的miRNA分子[2]。miRNA通過與靶基因的3'-末端非編碼區(qū)不完全互補(bǔ)配對來完成對下游基因的調(diào)節(jié)。對于互補(bǔ)配對程度高的靶基因（如大多數(shù)植物中），miRNA對靶基因mRNA進(jìn)行切割，而對于互補(bǔ)配對程度低的靶基因（如大多數(shù)動(dòng)物中），miRNA則對靶基因mRNA進(jìn)行翻譯抑制[3]。

1.2 miRNA功能鑒定的方法與材料：對miRNA進(jìn)行功能鑒定的方法，主要有微陣列芯片技術(shù)、實(shí)時(shí)PCR和RNA測序[4]，它們的完美結(jié)合可用于紅細(xì)胞中miRNA在不同階段的分析。另外，新一代測序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)在miRNA功能鑒定方面的應(yīng)用也得到了發(fā)展[5]。在這些技術(shù)中，往往需要首先調(diào)節(jié)miRNA在紅細(xì)胞中的表達(dá)量或表達(dá)活性，才能進(jìn)一步分析miRNA的功能，而這一過程即為功能獲得與喪失試驗(yàn)的核心步驟。其中功能獲得試驗(yàn)是將RNA低聚體注入斑馬魚的胚體中來促進(jìn)內(nèi)源性miRNA表達(dá)；而功能喪失試驗(yàn)則是通過向斑馬魚胚胎中注入嗎啉代來抑制內(nèi)源性miRNA表達(dá)[6]。相類似的還有：miRNA前體的異常表達(dá)、質(zhì)?；虿《据d體編碼的抑制劑以及模擬的或反義的寡核苷酸等，它們都可以用于功能獲得與喪失試驗(yàn)，為分析miRNA功能提供有效信息[7]。

在鑒定過程中主要使用的實(shí)驗(yàn)材料有細(xì)胞株（CD34+造血干細(xì)胞、K562細(xì)胞和小鼠紅白血病細(xì)胞等）[8-10]，工具酶（限制性內(nèi)切酶、溶菌酶和Taq DNA聚合酶等），以及相關(guān)的細(xì)胞因子、引物等。

1.3 miRNA靶基因的預(yù)測：對miRNA靶基因進(jìn)行預(yù)測可以在分子水平了解miRNA的作用。最常用的是生物信息學(xué)方法，預(yù)測軟件包括Targetscan、Pictar、miRanda、miRDB等[11]。雖然預(yù)測miRNA靶基因的軟件在不斷升級，但仍有一定的局限性。

而實(shí)驗(yàn)分析方法則是通過比較某miRNA過表達(dá)的細(xì)胞與對照細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄組與蛋白組水平來預(yù)測其靶基因的。其中，基因芯片分析法就是在轉(zhuǎn)錄組的水平上，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或反義核酸等方法來調(diào)節(jié)miRNA活性，之后再利用基因芯片分析mRNA的變化進(jìn)而找出相應(yīng)miRNA的靶基因[12]。而SILAC技術(shù)（stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC）則通過查看轉(zhuǎn)染miRNA后的蛋白表達(dá)水平變化來預(yù)測其靶基因[13,14]。

1.4 miRNA靶基因的驗(yàn)證：最直接的方法就是在轉(zhuǎn)染或敲除miRNA后，利用熒光定量PCR或Western blot[15,16]，分別監(jiān)測細(xì)胞中mRNA水平或蛋白水平的變化，從而確定miRNA與靶基因的對應(yīng)關(guān)系。這些方法能夠直接鑒定出miRNA的靶基因，準(zhǔn)確度高，但無法鑒定出miRNA的靶位點(diǎn)。

目前最常用的方法是熒光素酶報(bào)告基因法[17,18]。該方法首先構(gòu)建熒光素酶表達(dá)載體，將需要鑒定的miRNA靶基因3'UTR插入熒光素酶基因3'UTR中，然后將構(gòu)建好的重組載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，從而改變miRNA的表達(dá)水平，最后檢測熒光素酶的表達(dá)情況，以分析3'UTR中是否含有miRNA的靶位點(diǎn)。

2 miRNA與紅系的生長發(fā)育、增殖、分化及凋亡相關(guān)性

miRNA可以通過下調(diào)某些靶基因及蛋白的表達(dá)來調(diào)節(jié)紅系的生長發(fā)育、增殖、分化及凋亡[19]。

2.1 miRNA與紅系生長發(fā)育相關(guān)性

2.1.1 miR-144/451：miR-144和miR-451表達(dá)量在斑馬魚、小鼠及人類的紅系生長發(fā)育過程中均有所增加[20-22]。當(dāng)miR-451被敲除時(shí)，可延遲紅系的生長發(fā)育及分化[23,24]。在斑馬魚體內(nèi)，miR-144通過與Kruppel樣因子結(jié)合來調(diào)節(jié)α血紅蛋白的合成[25]，而miR-451則是通過與靶基因gata2結(jié)合來調(diào)節(jié)紅細(xì)胞成熟[26]。當(dāng)miR-144/451下調(diào)時(shí)，紅系的生長發(fā)育將受到一定程度上的抑制。

2.1.2 miR-142：miR-142可以在一定程度上調(diào)節(jié)紅細(xì)胞的形態(tài)、脆性及壽命，尤其是在調(diào)節(jié)紅細(xì)胞骨架方面有著重要作用。缺乏miR-142的紅細(xì)胞，其所含有的維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的蛋白下調(diào)，在通過血管時(shí)，紅細(xì)胞變形性下降，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，更易破碎。同時(shí)，miR-142還可用于抵抗氧化應(yīng)激，盡管這一機(jī)制尚不明確?？偟膩碚f，當(dāng)紅細(xì)胞內(nèi)缺乏miR-142時(shí)，該紅細(xì)胞更易出現(xiàn)不規(guī)則的形態(tài)、異常的機(jī)械調(diào)節(jié)，也更易受到氧化應(yīng)激對細(xì)胞本身的傷害[27]。

2.1.3 miR-191：在紅細(xì)胞分化的終末階段，很多miRNA下調(diào)，而miR-191異常增多，其在紅細(xì)胞的增殖與分化過程中基本沒有參與，但在脫核過程中起著重要的作用。研究表明，miR-191在小鼠紅細(xì)胞中直接與Riok3及Mxi1等基因相關(guān)。當(dāng)敲除Riok3與Mxi1時(shí)，miR-191上調(diào)，將阻止Gcn5的下調(diào)，從而阻止紅細(xì)胞的脫核過程[28]。

2.2 miRNA與紅系增殖、分化相關(guān)性

2.2.1 miR-223：在紅細(xì)胞增殖和分化的過程中，miR-223表達(dá)下降將會(huì)導(dǎo)致晚幼紅細(xì)胞的減少。LMO2是其靶基因，可編碼一種蛋白，該蛋白是DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄多聚體復(fù)合物的一部分，用于調(diào)節(jié)紅系分化相關(guān)的基因表達(dá)。當(dāng)miR-223下調(diào)時(shí)，其對靶基因的抑制解除，通過編碼相關(guān)蛋白，從而促進(jìn)紅系增殖、分化[29]。

2.2.2 miR-126/126*：miR-126及其互補(bǔ)序列miR-126*起源于EGFL7第七內(nèi)含子，并特異性高表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，可促進(jìn)胚胎時(shí)期的血管新生及維持血管的完整性。在體內(nèi)試驗(yàn)中，miR-126/126*在定向造血干細(xì)胞中的表達(dá)量較多，但隨著細(xì)胞生長發(fā)育，其表達(dá)量逐漸減少。這提示miR-126/126*在紅系生長發(fā)育及分化過程中，起到抑制作用。PTPN9蛋白作為miR-126/126*的靶基因，有著促進(jìn)紅細(xì)胞增殖及分化的作用。即PTPN9一定程度上可以解除miR-126/126*對紅系分化的抑制[30]。

2.2.3 miR-200a：miR-200a的表達(dá)量在紅系分化過程中逐漸減少，生物信息學(xué)及試驗(yàn)分析得知PDCD4和THRB都是miR-200a-3p的靶基因。對PDCD4和THRB進(jìn)行功能獲得與喪失試驗(yàn)顯示這兩個(gè)靶基因可促進(jìn)紅系基因的表達(dá)量。也就是說，miR-200a通過對PDCD4和THRB的調(diào)節(jié)來抑制紅系分化[31]。

2.2.4 miR-320a：miR-320a通過與靶基因SMAR1結(jié)合來抑制紅系分化。另外，SMAR1還可以通過與miR-221/222結(jié)合來調(diào)節(jié)紅系分化，其中miR-221/222在早期紅系分化中有重要作用[32]。因此，當(dāng)miR-320a上調(diào)時(shí)，可以通過與靶基因SMAR1結(jié)合來抑制紅系分化，也可以通過miR-221/222的路徑來調(diào)節(jié)紅系分化。

2.3 miRNA與紅系凋亡相關(guān)性

2.3.1 miR-503：凋亡是細(xì)胞維持正常發(fā)育及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的生理性死亡。miRNA的異常表達(dá)將引起異常的凋亡，最終導(dǎo)致貧血或癌癥的發(fā)生。紅細(xì)胞生命代謝過程中miR-503參與調(diào)控細(xì)胞周期阻滯和凋亡[33,34]。Roy等[35]對CD34+造血干細(xì)胞體外分化得到的CD235a+紅細(xì)胞內(nèi)miR-503進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)β-地中海貧血患者細(xì)胞內(nèi)miR-503表達(dá)水平顯著下調(diào)，且病情越重則miR-503表達(dá)水平越低。正常情況下miR-503能通過抑制細(xì)胞增殖基因CDC25A的表達(dá)使紅細(xì)胞的細(xì)胞周期靜止。由于地中海貧血患者紅細(xì)胞分化過程中miR-503表達(dá)量很低，無法有效抑制CDC25A的功能進(jìn)而導(dǎo)致無效紅細(xì)胞的生成和過度增殖。

3 展望 盡管對紅系生命代謝過程中所參與miRNAs的了解較過去有所增加，但對于它們的功能及其靶基因的探究仍是未來的巨大挑戰(zhàn)，這將為研究紅系分化提供新的思路。與此同時(shí)，通過完善紅細(xì)胞生命代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制，將為貧血等紅系疾病提供新的治療方案[36]。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突