外周血CTCs、cfDNA聯(lián)合檢測在肝癌早期篩查中的應用價值分析

閻其均 翁羽 朱付英

肝癌是我國臨床常見惡性腫瘤，其發(fā)生率及死亡率較高，是威脅人類健康的重大疾病之一[1]。肝癌早期常無典型癥狀，多數(shù)患者明確診斷時已處于中晚期，錯失最佳治療時機，嚴重影響患者生存率。因此，對肝癌早期診斷、及時治療顯得尤為重要。

對穿刺獲取或手術切除的病灶組織進行病理學檢查是診斷肝癌的金標準，但肝穿刺會對患者造成一定程度損傷，另手術切除獲取病理組織的方法只適用于確定行肝切除術的患者，因此，肝組織活檢在臨床診斷的應用中受到一定限制。循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）是指自發(fā)或因診療操作而進入血液循環(huán)中的腫瘤細胞，cfDNA是指存在于外周血液的胞外DNA。CTCs和cfDNA對腫瘤的早期篩查及預后評估具有重要價值，可通過非侵入性操作取樣，被稱為“液體活檢”[2]。有研究[3-5]表明，腫瘤患者血漿循環(huán)游離DNA（cfDNA）水平顯著高于正常人；原發(fā)性肝癌患者外周血中含有CTCs；血漿cfDNA檢測在胃癌的臨床診斷中具有一定輔助作用。基于此，本研究探討外周血CTCs聯(lián)合cfDNA檢測在早期肝癌篩查中的應用價值，為臨床早發(fā)現(xiàn)、早治療提供參考依據(jù)。

資料與方法

1 一般資料 選取我院2017年9月～2019年8月收治的182例高度疑似肝癌患者，其中男117例，女65例，年齡23～81歲，平均（48.96±8.17）歲。納入標準：有肝區(qū)疼痛、食欲下降、腹脹、發(fā)熱或乏力消瘦等癥狀，觸診時發(fā)現(xiàn)肝腫大或上腹部包塊，超聲或CT、MRI檢查發(fā)現(xiàn)肝內有實質性占位者；入院后均接受外周血CTCs、cfDNA檢測；意識清楚，無精神疾??；均知情同意且自愿參與。排除標準：有心肺腎等重要臟器疾病者；入院時已發(fā)現(xiàn)其他部位腫瘤或出現(xiàn)腫瘤轉移者；有血液系統(tǒng)疾病者；納入研究前1年曾接受過化療、免疫治療等。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會審批。

2 方法

2.1 試劑及儀器：血漿DNA提取試劑盒購自北京金麥格生物有限公司，抗熒光淬滅劑購自美國CST公司，紅細胞裂解液購自中國SurEXam公司，甲醛溶液購自成都民生消毒劑有限公司，離心機購自Thermo公司，熒光顯微鏡購自日本尼康（Nikon）公司。血漿DNA提取試劑盒購自上海歐孚生物科技有限公司，SYBR Green Real Master Mix購自北京天根公司，離心機購自Thermo公司，分光光度計購自Thermo公司，熒光定量PCR儀購自Bio-Rad公司。

2.2 外周血CTCs檢測：用EDTA-K2抗凝管采集患者術前空腹血5 mL，混勻后將5 mL血液置于樣本保存管內，室溫下放置30 min后離心5 min（3 000 r/min），棄上清，將管內剩余液體經過濾器過濾后，用甲醛溶液在室溫下固定60 min；在24孔板中加入紅細胞裂解液，將濾膜放入其中，室溫孵育，去除液體，PBS沖洗3次；然后將濾膜放置入含探針工作液的24孔板中，40℃孵育3h，去除液體，洗滌3次，再將濾膜放入含擴增緩沖液的24孔板中，40℃孵育3 min，去除液體，洗滌3次，加入含顯色工作液的24孔板中，40℃孵育30 min，去除液體，洗滌，最后將濾膜細胞面朝上而放置于載玻片上，在樣本上加入抗熒光淬滅劑（含DAPI）后，放置5 min，在顯微鏡下觀察結果。判斷標準[6]：細胞內CD45(-)、EpCAM(+)、CK8/18/19(+)，顯微鏡下呈紅色熒光信號，則判斷為上皮型CTCs；細胞內CD45(-)、vimentin(+)、twist(+)，顯微鏡下呈綠色熒光信號，則判斷為間質性CTCs；若細胞內同時呈現(xiàn)紅色熒光和綠色熒光信號，則判斷為混合型CTCs。

2.3 外周血cfDNA檢測：用EDTA-K2抗凝管采集患者靜脈血5 mL，離心15 min（3 000 r/min）分離血漿；以人基因組DNA為標準品，采用紫外分光光度計對其原始濃度進行測量，倍比稀釋其濃度至400 ng/mL、40 ng/mL、4 ng/mL、0.4 ng/mL、0.04 ng/mL。內參使用ALU重復序列，引物序列上游：5'-CCTGAGGTAAGGTCAGCGAG-3'，下游：5'-CCCGAGTAAGGAGGATTACA-3'。根據(jù)標準品濃度梯度構建標準曲線，對待測樣品進行定量檢測，PCR總體系為20 μL，包括9 μL的SYBR Green Real Master Mix、上下游引物各1 μL、蒸餾水7 μL、模板2 μL；反應條件：94℃預變性1 min；94℃30s，62℃20s，72℃30s，共45個循環(huán)。所有樣本均設3復孔，取其平均值。

3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS21.0軟件，計量資料用（ ±s）表示，兩樣本比較采用t檢驗，多樣本比較采用單因素方差分析；外周血CTCs、cfDNA水平與肝功能指標、相關腫瘤標志物的關系采用Pearson相關性分析；另采用ROC曲線分析外周血CTCs、cfDNA聯(lián)合檢測對早期肝癌的篩查價值；P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 外周血CTCs、cfDNA檢測結果 182例患者外周血CTCs平均為（3.45±0.69）個/5 mL，cfDNA平均為（17.26±3.51）ng/mL。

2 癌癥組與良性組患者肝功能及腫瘤標志物水平比較根據(jù)病理學結果診斷分為癌癥組139例，良性組43例（肝囊腫10例、肝膿腫13例、肝內膽管結石15例、肝血管瘤5例）。癌癥組血清AFP、γ-GT、CEA、ALT、AST、ALP水平均高于良性組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

3 癌癥組與良性組患者外周血CTCs、cfDNA水平比較 癌癥組患者外周血CTCs、cfDNA水平均高于良性組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表1 癌癥組與良性組患者肝功能及腫瘤標志物水平比較（ ±s）

表2 癌癥組與良性組患者外周血CTCs、cfDNA水平對比（ ±s）

4 癌癥組患者外周血CTCs、cfDNA水平與肝功能指標及腫瘤標志物的相關性 經Pearson相關性分析發(fā)現(xiàn)，癌癥組患者外周血CTCs、cfDNA水平與AFP、γ-GT、CEA、ALT、AST、ALP水平均呈正相關性（P＜0.05），見表3。

5 肝癌不同分期外周血CTCs、cfDNA水平比較 肝癌不同分期外周血CTCs、cfDNA水平比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），外周血CTCs、cfDNA水平肝癌Ⅳ期＞Ⅲ期＞Ⅱ期＞Ⅰ期，見表4。

表3 癌癥組患者外周血CTCs、cfDNA水平與肝功能指標及腫瘤標志物的相關性

6 診斷效能 經ROC曲線分析，外周血CTCs診斷肝癌的cut-off值為4個/5 mL，其靈敏度、特異度、AUC分別為75.54%、86.05%、0.854；外周血cfDNA診斷肝癌的cut-off值為19.38 ng/mL，其靈敏度、特異度、AUC分別為78.42%、79.07%、0.831；外周血CTCs聯(lián)合cfDNA診斷肝癌的靈敏度、特異度、AUC分別為82.01%、90.70%、0.923。見圖1及表5。

表4 肝癌不同分期之間外周血CTCs、cfDNA對比（ ±s）

表5 外周血CTCs、cfDNA單項及聯(lián)合檢測對肝癌的診斷效能

討 論

肝癌屬消化系統(tǒng)惡性腫瘤，多由病毒性肝炎、酒精性肝硬化或長期攝入黃曲霉素及亞硝胺等化學致癌物質所導致[7]。肝癌發(fā)病較為隱匿，初期多無明顯癥狀，如何提高肝癌早期診斷率仍是現(xiàn)階段臨床關注的重點、熱點問題[8]。肝組織活檢是確診肝癌的重要手段，但因其有創(chuàng)傷性，臨床應用受到限制。因此，積極尋求早期篩查肝癌的其他方法具有重要的臨床價值。

本研究中，182例高度疑似肝癌患者中確診為肝癌的有139例，確診為肝臟良性病變的有43例。與良性組比較，癌癥組外周血CTCs、cfDNA水平明顯升高，且CTCs、cfDNA水平隨著肝癌分期逐漸升高，提示肝癌患者外周血CTCs、cfDNA水平異常上升，與肝癌臨床分期密切相關。CTCs包括從腫瘤原發(fā)病灶、轉移病灶脫落及診療操作導致進入血循環(huán)的腫瘤細胞[9]。有研究[10]顯示，在肝細胞癌形成和生長早期，即有腫瘤細胞從實體瘤脫落而進入血液循環(huán)，并隨著血行而轉移。另有研究[11]顯示，在296例肝細胞癌患者中，有191例患者（64.53%）外周血中檢測到CTCs，也證實了多數(shù)肝癌患者外周血CTCs含量升高。此外，隨著腫瘤進展，遠處轉移病灶增多，釋放入外周血中的CTCs數(shù)量越多。cfDNA主要來源于細胞壞死或凋亡，與正常細胞凋亡產生較小的cfDNA片段相比，腫瘤細胞釋放或腫瘤負荷狀態(tài)下細胞壞死產生的cfDNA片段更大更多，這使得檢測cfDNA的敏感性更高[12]。有研究[13]表明，腫瘤患者血液中cfDNA水平顯著高于正常人，且cfDNA含有與腫瘤相關的某些分子特性或改變。另有研究[14]顯示，肝細胞癌患者血漿cfDNA濃度中位值顯著高于健康對照者、肝硬化及慢性活動性肝炎患者，本研究結果與此一致。腫瘤細胞惡性程度越高，經淋巴結轉移或血行播散，從死亡的癌細胞釋放入外周血的基因含量越高，因此分期越晚，cfDNA水平越高。另本研究結果顯示，癌癥組患者外周血CTCs、cfDNA水平與AFP、γ-GT、CEA、ALT、AST、ALP水平均呈正相關性，表明CTCs、cfDNA水平與肝癌患者肝損傷程度一致。

CTCs來源于腫瘤原發(fā)病灶或轉移灶，通過鑒定其計數(shù)及分子特征可一定程度地反映腫瘤特性，可作為腫瘤診斷的標記物[15]。原發(fā)性肝癌患者外周血CTCs與腫瘤體積及腫瘤分期顯著相關[16]，外周血CTCs計數(shù)有成為診斷原發(fā)性肝癌生物標記物的潛在價值[17]。此外，腫瘤生長過程中可持續(xù)釋放cfDNA至外周血中，并維持其來源的分子遺傳性，可通過檢測外周血cfDNA含量反映腫瘤的嚴重程度[18]。研究也證實[19]，血漿cfDNA在肝癌的臨床診斷中具有一定的靈敏度及特異度。但有研究[20]顯示，進入血液循環(huán)后有部分CTCs在機體免疫作用下發(fā)生凋亡，會導致漏檢的發(fā)生。非腫瘤患者亦可出現(xiàn)cfDNA的改變，且遺傳改變的cfDNA不能反映腫瘤類型及部位，因此，單一檢測診斷價值有限。本研究結果顯示，單獨檢測外周血CTCs、cfDNA篩查肝癌的靈敏度分別為75.54%、78.42%，特異度分別為86.05%、79.07%，二者聯(lián)合檢測靈敏度、特異度分別為82.01%和90.70%，提示外周血CTCs、cfDNA檢測雖對肝癌有一定的診斷價值，但聯(lián)合檢測時診斷價值更高。

綜上，肝癌患者外周血CTCs、cfDNA明顯升高，與AFP、γ-GT、CEA、ALT、AST、ALP水平呈正相關，外周血CTCs、cfDNA水平檢測對肝癌的早期篩查具有一定的臨床價值，但此二者聯(lián)合檢測時的價值更高，可推廣應用于臨床中。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突