人弓形蟲病診斷方法的研究進(jìn)展

劉文彩，黃 鵬

(1.南昌大學(xué)a.第一臨床醫(yī)學(xué)院2018級(jí)；b.公共衛(wèi)生學(xué)院循證醫(yī)學(xué)中心；2.江西省預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330006)

弓形蟲病正感染著全球超過30%的人口，逐漸成為一種全球性健康危害[1]，在我國弓形蟲感染率也超過10%[2]。臨床上該病主要引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害(如腦炎、癲癇、精神異常)以及孕婦的流產(chǎn)、早產(chǎn)、畸胎或死胎，其中畸胎發(fā)生率最高，且會(huì)傳染給胎兒[3]。本文擬對(duì)人弓形蟲病診斷方法的發(fā)展進(jìn)行綜述，以期為人弓形蟲病的診斷提供更多選擇。

1 傳統(tǒng)診斷方法

1.1 病原學(xué)診斷

病原學(xué)檢查主要通過對(duì)患者組織、體液或用其接種培養(yǎng)出的生物樣本進(jìn)行鏡檢，以觀察到寄生蟲作為診斷依據(jù)。此類檢查簡(jiǎn)單方便，具有確診意義，但陽性率不高，易漏檢。

1.1.1 涂片染色法

取急性期患者的各種體液如腦脊液、胸腔積液、腹水、羊水、痰液、骨髓或血液等，進(jìn)行離心后取沉淀物制作涂片，或采用組織切片經(jīng)吉姆薩(Giemsa)染液染色后直接鏡檢檢測(cè)弓形蟲滋養(yǎng)體[4]?；蛴眠@些體液和組織制片使用間接熒光染色法檢測(cè)：置于載玻片上干燥5～15 min，酒精固定15 min，加30 μL單抗，37 ℃溫育30 min，PBS洗滌干燥，添加二抗，37 ℃溫育30 min、干燥后鏡檢[5]。

1.1.2 動(dòng)物接種或細(xì)胞培養(yǎng)法

取患者的待檢樣本接種于小鼠腹腔，培養(yǎng)1周后剖殺取腹腔液鏡檢，或?qū)颖窘臃N于離體培養(yǎng)的細(xì)胞中培養(yǎng)9 h，然后進(jìn)行鏡檢[6]。其優(yōu)點(diǎn)是比直接涂片染色觀察檢出率更高，但其耗時(shí)較長(zhǎng)，同時(shí)可能具有擴(kuò)散病原體的風(fēng)險(xiǎn)[5]。

1.2 血清學(xué)診斷

血清學(xué)診斷方法是臨床實(shí)驗(yàn)室診斷弓形蟲病的首選和最常用的診斷方法。在臨床中，對(duì)于孕婦妊娠期弓形蟲病的檢測(cè)，血清學(xué)方法具有重要意義[7-8]。通過對(duì)IgG親和力的測(cè)定可以更好地估計(jì)被感染的時(shí)間并確定妊娠期間是否發(fā)生原發(fā)性弓形蟲的感染[7]。這些方法是基于宿主弓形蟲特異性免疫球蛋白對(duì)弓形蟲表面抗原的識(shí)別。不同的血清學(xué)診斷方法常常檢測(cè)不同的抗體。感染弓形蟲后，抗體(Ig)相繼產(chǎn)生，抗體產(chǎn)生的動(dòng)力學(xué)可能有助于確定感染的階段。感染后1周內(nèi)首次產(chǎn)生IgA和IgM，1個(gè)月內(nèi)滴度達(dá)到穩(wěn)定，1～6個(gè)月后下降。在某些個(gè)體中，IgM可在急性感染后很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)被檢測(cè)到，所以IgM陽性結(jié)果可能提示急性、近期或過去感染[9]。此外有一些方法可以進(jìn)行輔助檢測(cè)，如特異性IgA檢測(cè)、IgG效價(jià)分析和IgG親和度檢測(cè)，以便更好地確定感染階段。不過，特異性IgA不能作為急性感染的替代標(biāo)志物。特異性IgG在感染開始后2～3個(gè)月內(nèi)達(dá)到一個(gè)平臺(tái)期，然后降低并保留持續(xù)終生的殘留滴度。IgG陽性結(jié)果提示既往感染，但不能準(zhǔn)確判斷感染的時(shí)間。

1.2.1 染色試驗(yàn)(DT)

染色試驗(yàn)是根據(jù)Sabin和Feldman的微量滴定技術(shù)進(jìn)行的經(jīng)典血清學(xué)方法，具有良好的特異性、敏感性和可重復(fù)性[10]。其原理是活動(dòng)弓形蟲速殖子的細(xì)胞質(zhì)在接觸抗原抗體復(fù)合物時(shí)發(fā)生了改變，不能被甲藍(lán)染成藍(lán)色。當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陽性時(shí)免疫血清(含特異性抗體)60%以上胞外速殖子呈未染及新月形正常的形態(tài)；當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)(不含特異性抗體)，細(xì)胞外50%以上及細(xì)胞內(nèi)速殖子均表現(xiàn)為甲藍(lán)染色的深藍(lán)色，且呈圓形或卵圓形。在一項(xiàng)對(duì)婦女和綿羊、山羊中弓形蟲病診斷方法的對(duì)比研究[11]中顯示，DT法與ELISA IgG法、PCR法的檢測(cè)結(jié)果均無顯著差異(P>0.05)。但也有研究[12]顯示，在52個(gè)低濃度IgG(2～10 U·mL-1)樣本中用DT法檢測(cè)，3次均出現(xiàn)假陰性結(jié)果，這表示DT法對(duì)低水平IgG結(jié)果的解釋還存在著一定的不足。

1.2.2 間接血凝試驗(yàn)(IHA)

間接血凝試驗(yàn)法是將抗原(或抗體)包被在紅細(xì)胞的表面，使其成為致敏的載體，之后與相應(yīng)的抗體(或抗原)結(jié)合，從而使紅細(xì)胞拉聚在一起，出現(xiàn)可見的凝集反應(yīng)。該法有較好的特異性和敏感性，配合試劑盒使用操作簡(jiǎn)便，只需采取血液并離心得到血清樣本，在低溫條件下使用一定的稀釋度對(duì)樣本進(jìn)行滴度檢測(cè)即可。一項(xiàng)流行病學(xué)研究[13]使用IHA、間接免疫熒光試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)分別對(duì)不同的山羊群血清樣本進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果顯示三者陽性和陰性結(jié)果一致指數(shù)均較高(97.7%)，此外，三者之間的相關(guān)性也很高。但也有研究[14]表明IHA要比改良凝集試驗(yàn)(MAT)的檢測(cè)效果弱一些。

1.2.3 改良凝集試驗(yàn)(MAT)

MAT是利用制備的弓形蟲整蟲抗原可以識(shí)別不同動(dòng)物的抗體擴(kuò)大了可凝集的抗原抗體范圍的改良法，在血清中抗體和弓形蟲的速殖子表面上的抗原結(jié)合后才能夠發(fā)生交聯(lián)凝集反應(yīng)，有較好特異性，現(xiàn)在市場(chǎng)上已經(jīng)出現(xiàn)了商業(yè)化改良試劑盒，使用較簡(jiǎn)便。在埃及的一項(xiàng)對(duì)綿羊的血清樣品進(jìn)行弓形蟲病血清學(xué)檢測(cè)的比較研究中[15]，MAT法的靈敏度可達(dá)96%，特異性達(dá)到88.9%。在巴西的一項(xiàng)針對(duì)山羊的弓形蟲病血清學(xué)比較研究中[16]，以間接免疫熒光法(IFA)為標(biāo)準(zhǔn)，ELISA和MAT也表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)囊恢滦?kappa=0.74和0.61)。CASARTELLI ALVES等[17]學(xué)者的一項(xiàng)評(píng)估不同實(shí)驗(yàn)室診斷方法的研究顯示，MAT法的敏感性和特異性達(dá)到了76%和68%，是該項(xiàng)研究中效果最好的診斷方法。上述研究表明了MAT法具有較好的敏感性和特異性，與ELISA、IFA相比具有更短的耗時(shí)、更少的勞動(dòng)力需求、更簡(jiǎn)單的設(shè)備與操作和可以在任何物種的血清上進(jìn)行等優(yōu)點(diǎn)[18]。但若在具有高度溶血或脂質(zhì)的樣本中，MAT的陽性率可能會(huì)偏高[19]。

1.2.4 間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)

IFA采用完整蟲體為抗原，以熒光標(biāo)記的第二抗體檢測(cè)特異性抗體，當(dāng)大多數(shù)固定的速殖子(>50%)在1:64和1:50稀釋時(shí)對(duì)弓形蟲有完全的外周熒光，血清樣本即被認(rèn)為是陽性的[20]。該檢測(cè)方法可測(cè)同型及亞型抗體，在新生兒先天性弓形蟲病感染的檢測(cè)中用其檢測(cè)IgM，對(duì)疾病早期診斷和判定具有較大意義。在SINGH等[21]的一項(xiàng)檢測(cè)家養(yǎng)反芻動(dòng)物弓形蟲病抗體的研究中，基于重組SAG2抗原的ELISA法與IFA法相比，其檢測(cè)靈敏度在81.25%至87.10%，而特異性處于85.71%至91.43%，二者檢測(cè)結(jié)果顯示出了較高的一致性；通過IFA法發(fā)現(xiàn)111例(28.38%)血清陰性和280例(71.61%)血清陽性，通過ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)124例(33.70%)血清陰性，267例(68.28%)血清陽性，二者結(jié)果無顯著差異(P>0.05)，并且因其較高的準(zhǔn)確性及較為低廉的檢測(cè)費(fèi)用，IFA法與ELISA法在臨床上應(yīng)用于孕婦產(chǎn)前檢測(cè)弓形蟲病上具有積極的意義。在CASARTELLI ALVES等[17]的對(duì)多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室診斷方法檢測(cè)弓形蟲感染的對(duì)比研究中，IFA法的敏感性和特異性為80%和52%，雖略低于MAT但也顯示出了較好的檢測(cè)效果。但若在使用G蛋白非特異性結(jié)合抗體時(shí)，G蛋白與抗體的親和性差異也可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生偏差[19]。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

ELISA法可用在檢測(cè)宿主的多種特異性抗體如IgG、IgM和IgA等，現(xiàn)已存在多種改良法廣泛用于先天性和早期急性感染弓形蟲病的診斷[6]。其基本操作方法是先將抗原或抗體結(jié)合到固相上，再加入特異性的抗體或抗原形成抗原-抗體結(jié)合物，然后使用酶標(biāo)記的抗原或抗體去結(jié)合從而達(dá)到檢測(cè)的目的[20]。在GHONEIM等[11]的一項(xiàng)研究中用ELISA(檢測(cè)IgM和IgG)和DT染色法對(duì)綿羊弓形蟲病進(jìn)行檢測(cè)，陽性率分別為98.4%和90.3%。在CASARTELLI ALVES等[17]的對(duì)多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室弓形蟲診斷方法的對(duì)比研究中，ELASA法的敏感性和特異性分別為85%和56%，顯示出了較好的檢測(cè)效果。Singh和Sudan的兩項(xiàng)基于重組SAG2抗原的ELISA法檢測(cè)弓形蟲病的研究中，SINGH等[21]用來自綿羊、山羊和牛的168個(gè)現(xiàn)場(chǎng)血清樣品評(píng)估了重組蛋白的診斷潛力，并與IFA法進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果顯示recSAG2-ELISA的靈敏度為81.25%～87.10%，而特異性為85.71%～91.43%，具有較高的吻合性；SUDAN等[22]用258頭牛血清樣品評(píng)估了重組蛋白的診斷潛力，也與IFA法進(jìn)行了相比，recSAG2-ELISA的敏感性為80.00%，特異性為88.57%(CI=95%)，2次試驗(yàn)之間基本吻合。在一項(xiàng)對(duì)孕婦弓形蟲病感染的研究中[6]，研究者使用了ELISA和IFA(針對(duì)IgG和IgM抗體)分別對(duì)孕婦的感染進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果通過IFA發(fā)現(xiàn)111例(28.38%)血清陰性和280例(71.61%)血清陽性，通過ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)124例(33.70%)血清陰性，267例(68.28%)血清陽性，二者結(jié)果具有較好的一致性，且ELISA的效果優(yōu)于IFA。因其優(yōu)良的檢測(cè)性能與不復(fù)雜的檢測(cè)操作，當(dāng)高度懷疑感染及孕早期感染時(shí)，重復(fù)該血清學(xué)檢測(cè)和其他化驗(yàn)方法進(jìn)行結(jié)果快速確認(rèn)在臨床上對(duì)患者的診斷具有重要意義[23]。以上研究表明，ELISA法對(duì)弓形蟲抗體的檢測(cè)具有較好的效果，但可能由于使用多物種結(jié)合物而被低估[19]。

2 分子診斷方法

目前血清學(xué)方法診斷仍存在一些無法解決的局限性，如無法確認(rèn)先天性傳播或免疫缺陷患者的胎兒和大腦中是否存在弓形蟲。分子診斷技術(shù)的使用，可有效避免對(duì)子宮內(nèi)胎兒采用侵入性的檢測(cè)方法，近十年來已開發(fā)出不同的分子檢測(cè)方法，包括傳統(tǒng)PCR、巢式PCR(nested PCR)、實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)以及循環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)等來檢測(cè)生物樣本中的弓形蟲基因[24]。未來隨著生物信息學(xué)與基因組學(xué)的進(jìn)步，將會(huì)有越來越多的靶向基因被發(fā)現(xiàn)，這又將促進(jìn)弓形蟲分子診斷的進(jìn)一步發(fā)展。

2.1 傳統(tǒng)PCR

在傳統(tǒng)PCR方法中，一個(gè)特定的基因組片段可以被擴(kuò)增放大，從而產(chǎn)生數(shù)百萬個(gè)目標(biāo)DNA分子。BURG等[25]最早建立了弓形蟲的PCR檢測(cè)技術(shù)，擴(kuò)增了弓形蟲基因組的35個(gè)重復(fù)B1基因。之后，18S rRNA-基因、P30-基因、b1-基因、529-bp重復(fù)片段和AF146527等多個(gè)多拷貝靶向基因被用于不同生物樣本中弓形蟲的檢測(cè)[26]。PCR技術(shù)已成功地使用腦組織、房水、玻璃體液和羊水、胎盤用于診斷先天性和眼部弓形蟲病，此外，全血、尿、腦脊液、胸膜和腹腔液也已被有效地用于診斷免疫缺陷患者所患的弓形蟲病。在埃及的一項(xiàng)對(duì)婦女弓形蟲病的檢測(cè)手段的對(duì)比研究中[11]，ELISA、DT和PCR的檢測(cè)結(jié)果之間無顯著差異(P>0.05)。在一項(xiàng)對(duì)野生鳥類的弓形蟲感染的研究中[27]，使用IFA和PCR對(duì)216只動(dòng)物進(jìn)行了檢測(cè)，陽性率分別為11.6%和8.8%。這顯示了其與血清學(xué)診斷之間結(jié)果具有較好一致性。

2.2 巢式PCR

其可以用來增加DNA擴(kuò)增的特異性以檢測(cè)數(shù)量很少的病原體，并且可作為診斷不同弓形蟲病類型的一種有價(jià)值的、準(zhǔn)確的、特異的方法。此外，巢式PCR對(duì)河流、水井和海水中弓形蟲卵囊的檢測(cè)也具有較高的敏感性[28]。ALONSO等[29]的一項(xiàng)研究表明，巢式PCR是一種快速、靈敏、有效的檢測(cè)HIV患者弓形蟲病的分子診斷方法。

2.3 實(shí)時(shí)PCR

該方法是近年來發(fā)展起來的一種檢測(cè)方法，它對(duì)臨床樣本中的病原體具有較高的特異性和診斷準(zhǔn)確性，同時(shí)RT-PCR是檢測(cè)病原體較敏感的分子檢測(cè)方法，特別是在目標(biāo)DNA濃度較低時(shí)。RT-PCR較傳統(tǒng)PCR的主要優(yōu)點(diǎn)在于不需要打開反應(yīng)管，可以降低擴(kuò)增子遭受環(huán)境污染的風(fēng)險(xiǎn)，減少假陽性結(jié)果，此外，RT-PCR檢測(cè)與傳統(tǒng)PCR相比還具有更快速、靈敏和可重復(fù)性的特點(diǎn)。WELLS等[30-31]的研究表明，RT-PCR方法具有較高敏感性，并且與其他分子生物學(xué)方法相比有較好一致性。

2.4 多重PCR

多重PCR可以聯(lián)合使用多個(gè)引物集進(jìn)行病原體的檢測(cè)，可以實(shí)行巢式多重PCR檢測(cè)和實(shí)時(shí)多重PCR檢測(cè)。HALLU等[32]設(shè)計(jì)了一個(gè)多重PCR方案，該P(yáng)CR包含靶向人β球蛋白基因的引物(可作為內(nèi)部對(duì)照)和2個(gè)針對(duì)B1基因和5s基因的引物，結(jié)果顯示該法靈敏度為83.3%，特異性為100%。RAHUMATULLAH等[33]也開發(fā)出一種針對(duì)B1基因和ITS-1區(qū)域的多重PCR，其在檢測(cè)中敏感性可達(dá)97.5%～99.9%，效率達(dá)97%～99%，能檢測(cè)到10 pg的弓形蟲DNA，104個(gè)體液中的速殖子。上述研究表明了多重PCR在弓形蟲檢測(cè)的敏感性和特異性較單一PCR具有一定優(yōu)勢(shì)，也提示在基因位點(diǎn)的選擇上仍存在較大發(fā)展空間。

2.5 循環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)

LAMP是一種改良的PCR方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、高效、快速等優(yōu)點(diǎn)。該方法利用具有鏈沉降活性的DNA聚合酶(Bst)和4～6個(gè)特異性引物，在恒溫(60～65 ℃)條件下擴(kuò)增DNA，能識(shí)別目標(biāo)DNA中的6～8個(gè)不同區(qū)域[34]。LAMP與傳統(tǒng)PCR相比，具有不需要特別復(fù)雜的設(shè)備，不需要長(zhǎng)耗時(shí)，不需要提取DNA，對(duì)血液、血清和食品配料等PCR抑制劑的耐受性更強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)[34]。在一項(xiàng)使用LAMP和巢式PCR檢測(cè)白血病兒童弓形蟲抗體的研究中[24]，在50份血清陽性樣本(IgM+，IgG+)中，獲得的陽性結(jié)果LAMP分別占92%和86%，巢式PCR分析分別占82%和68%，LAMP體現(xiàn)出了較高的準(zhǔn)確率。同時(shí)在對(duì)10倍稀釋的弓形蟲DNA進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，LAMP在與巢式PCR的對(duì)比中顯示出了更高的靈敏度[26]。

3 診斷方法的聯(lián)合使用

診斷方法的聯(lián)合主要是血清學(xué)與分子技術(shù)的聯(lián)合診斷。聯(lián)合診斷可以提高檢測(cè)靈敏度、特異性和檢測(cè)效率，并且克服了現(xiàn)有手段的局限性，將兩種手段進(jìn)行優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)以獲得更理想的診斷效果。

ELISA-PCR聯(lián)合診斷弓形蟲病，既提高了檢測(cè)范圍，又提高了準(zhǔn)確度，且在聯(lián)合檢測(cè)中可以縮短操作時(shí)間，比單一方法具有更好的分析性能。其操作為先用ELISA法對(duì)患者血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，再對(duì)抗體陽性的患者取血樣進(jìn)行DNA提取和擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步分析有抗體親和性差異的結(jié)果[35]。一項(xiàng)對(duì)孕婦弓形蟲病的早期診斷研究[35]，從143名孕婦中收集血清，并用ELISA法檢測(cè)弓形蟲的IgM、IgA和IgG的親和力；從57個(gè)外周血和14個(gè)羊水樣本中提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示使用ELISA檢測(cè)143名婦女中有57名血清反應(yīng)陽性，其中9名女性的IgG抗體親和力低，表明存在急性感染；3名婦女表現(xiàn)出中等親和力。用PCR檢測(cè)出了9名表現(xiàn)出低親和力女性存在弓形蟲DNA，而對(duì)于中等親和力病例則呈陰性。該結(jié)果顯示，與ELISA相結(jié)合的PCR檢測(cè)比單獨(dú)使用ELISA法具有更好的分析性能，也彌補(bǔ)了酶聯(lián)試驗(yàn)在面對(duì)IgG親和力分析時(shí)的不足[35]。ROOZBEHANI等[36]研究了2120份孕婦血清樣本，發(fā)現(xiàn)結(jié)合PCR的酶聯(lián)熒光法與單獨(dú)進(jìn)行酶聯(lián)法在區(qū)分高、低風(fēng)險(xiǎn)感染和減少孕婦不必要治療的頻率方面更加可靠，多重PCR結(jié)合血清學(xué)方法對(duì)高危妊娠的檢測(cè)和先天性弓形體病的診斷具有重要意義，可對(duì)IgM陽性或不明確的孕婦進(jìn)行進(jìn)一步明確的診斷，比單一抗體檢測(cè)提高了精準(zhǔn)性[37]。在檢測(cè)孕婦的原發(fā)性急性弓形蟲病中，聯(lián)合診斷存在定義和選擇母嬰傳染高危病例的可能[38]。MARTINEZ等[39]也開發(fā)出一種ELISA-PCR結(jié)合測(cè)定法用于弓形蟲的檢測(cè)，其與單一Southern blotting法相比具有操作更加簡(jiǎn)便，用時(shí)更短等優(yōu)勢(shì)。

4 結(jié)語

幾十年來，對(duì)人弓形蟲病的檢測(cè)手段已經(jīng)有了長(zhǎng)足的進(jìn)展。傳統(tǒng)的檢測(cè)手段有病原學(xué)和血清學(xué)診斷，病原學(xué)診斷方法簡(jiǎn)單，且診斷結(jié)果具有確診意義，主要用于臨床急性感染的檢測(cè)，但因其檢出率不高，現(xiàn)已較少被采用；血清學(xué)檢查是目前實(shí)驗(yàn)室診斷弓形蟲病的首選和最常用的診斷方法，方法上具有多樣性，準(zhǔn)確率也較高，許多商業(yè)化試劑盒對(duì)弓形蟲病的檢測(cè)帶來了極大的便利性。隨著基因組學(xué)和生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，分子診斷的優(yōu)勢(shì)不斷體現(xiàn)，解決了血清學(xué)檢測(cè)的一些局限性，同時(shí)準(zhǔn)確性也較高，因此尋找更多有效的相關(guān)基因位點(diǎn)用于檢測(cè)可能是將來的研究方向。血清學(xué)、分子技術(shù)各有其優(yōu)勢(shì)和局限性，聯(lián)合診斷由于擴(kuò)展了檢測(cè)的深度與廣度，可能會(huì)是未來人弓形蟲病診斷技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)。