結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)在結(jié)核病臨床診斷中的應(yīng)用

張曉梅，黃 鵬

(1.南昌大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院循證醫(yī)學(xué)中心，南昌 330006；2.上饒市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 上饒 334000；3.江西省預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330006)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(MTB)引起的，以侵犯人體呼吸系統(tǒng)為主的傳染病。近年來，由于MTB耐藥性的增加，流動人口的增多，以及一些致人體自身免疫力明顯下降的疾病如人類免疫缺陷病毒(HIV)感染、血液病以及腫瘤等增多，結(jié)核病的發(fā)病率逐漸上升。2019年WHO[1]估計(jì)，2018年全世界約有1000萬人罹患結(jié)核病，有150萬人死于該疾病。我國是全球結(jié)核病高發(fā)區(qū)的國家之一，防控形勢比較嚴(yán)峻，早期診斷該疾病對于其防治具有重要意義。常見的結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法有很多，但都有一定的局限性。近年新發(fā)展的T-SPOT.TB具有靈敏度高、特異度高、結(jié)果快速等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛地應(yīng)用于臨床結(jié)核病的診斷[2]。本文通過對T-SPOT.TB在肺結(jié)核、肺外結(jié)核、結(jié)核潛伏感染中的臨床診斷應(yīng)用進(jìn)行綜述，旨在為臨床結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷提供更多依據(jù)或線索。

1 結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷的常規(guī)方法及其特點(diǎn)

常見的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有：涂片抗酸染色、結(jié)核菌素試驗(yàn)(TST)、抗結(jié)核分枝桿菌抗體(TB-Ab)檢測、結(jié)核分枝桿菌核酸(TB-DNA)檢測和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)等，這些方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。1)抗酸染色涂片檢查:特異度高，但是靈敏度較低。喻容等[3]的研究結(jié)果顯示，抗酸染色的靈敏度為17.25%；秦慶等[4]報(bào)道的靈敏度為11.46%，特異度為98.96%。2)TST:TST特異度較低，有學(xué)者[5-6]報(bào)道診斷小兒結(jié)核感染TST的靈敏度為66.7%，但特異度僅為40%；因其與卡介苗(BCG)和非結(jié)核分枝桿菌感染會產(chǎn)生交叉反應(yīng)，容易產(chǎn)生假陽性。3)TB-Ab檢測：TB-Ab是以體液免疫應(yīng)答為基礎(chǔ)的免疫學(xué)診斷方法，該方法操作簡單快速，容易判斷結(jié)果，但是引起TB-Ab試驗(yàn)假陽性和假陰性的因素較多，其靈敏度和特異度均較低，在確診的活動性結(jié)核病中TB-Ab的陽性率為61.5%[7]。4)TB-DNA檢測：PCR技術(shù)測定TB-DNA的靈敏度和特異度較高，在WANG等[8]的研究中肺結(jié)核和肺外結(jié)核總的靈敏度為92.11%，特異度為82.61%；但是PCR技術(shù)對實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和技術(shù)人員的要求均較高，且標(biāo)本容易污染，結(jié)果容易出現(xiàn)假陽性。新近發(fā)展的利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)(Xpert MTB/RIF)是目前國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)核病中最優(yōu)的一種方法。Xpert MTB/RIF不僅可以檢測TB-DNA，而且可以確認(rèn)利福平耐藥基因[9]。SHEN等[10]的Meta分析結(jié)果顯示：Xpert MTB/RIF診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核的總靈敏度為0.81(95%CI:0.77～084)，總特異度為0.99(95%CI:0.97～1.00)。5)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)：此技術(shù)仍是目前臨床上診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，但培養(yǎng)周期長，約需3～6周時(shí)間才能出結(jié)果，且培養(yǎng)要求較高，培養(yǎng)陽性率偏低。結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的方法包括傳統(tǒng)羅氏(L-J)固體培養(yǎng)法和MGIT 960液體培養(yǎng)法。MA等[11]對232例骨結(jié)核膿液標(biāo)本做了傳統(tǒng)L-J固體培養(yǎng)基和MGIT 960液體培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌的比較研究，結(jié)果顯示：2種方法檢出結(jié)核分枝桿菌總陽性率為31.0%(72/232)，在檢出的72例陽性標(biāo)本中，MGIT 960液體培養(yǎng)法陽性檢出率為94.4%，高于L-J固體培養(yǎng)法陽性檢出率(75.0%)。由此可見，MGIT 960液體培養(yǎng)法優(yōu)于傳統(tǒng)L-J法。但另有研究[12]報(bào)道，MGIT 960液體培養(yǎng)法培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌的陽性檢出率雖然高于L-J法，但是MGIT 960的污染率(15%)高于L-J的污染率(9.3%)。

2 結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)的原理及特點(diǎn)

體外γ-干擾素(IFN-γ)釋放試驗(yàn)(IGRA)近年來受到了臨床的廣泛關(guān)注，它是一項(xiàng)以T細(xì)胞免疫為基礎(chǔ)的檢查方法。目前應(yīng)用于臨床的IFN-γ釋放試驗(yàn)主要有2種：一種是QFT-GIT試驗(yàn)，該試驗(yàn)的方法是采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測結(jié)核特異性抗原刺激的致敏T細(xì)胞所釋放的IFN-γ濃度；另一種是T-SPOT.TB，該試驗(yàn)的方法是采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT)檢測外周血結(jié)核特異性抗原刺激分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞數(shù)量[13]。目前IGRA的檢測在臨床實(shí)驗(yàn)室中使用最廣泛的檢測方法是T-SPOT.TB。

T-SPOT.TB檢測的基本原理是采用ELISPOT技術(shù)，檢測分泌細(xì)胞因子的T細(xì)胞。結(jié)核感染的免疫應(yīng)答是以T細(xì)胞免疫應(yīng)答為主，機(jī)體感染MTB后，體內(nèi)產(chǎn)生抗原特異性效應(yīng)T細(xì)胞，當(dāng)再次被結(jié)核抗原刺激時(shí)，這些效應(yīng)T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ[2]。實(shí)驗(yàn)時(shí)，采集靜脈全血，分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，PBMCs和結(jié)核特異RD1區(qū)的抗原即ESAT-6和CFP-10，加入到包被了抗IFN-γ抗體的板孔內(nèi)培養(yǎng)；加入的特異性抗原刺激所有的致敏T細(xì)胞分泌IFN-γ，IFN-γ被反應(yīng)板上的抗IFN-γ抗體捕獲，洗去細(xì)胞后，捕獲的IFN-γ與加入的酶標(biāo)二抗結(jié)合，加入底物進(jìn)行酶聯(lián)顯色，在反應(yīng)板底部形成斑點(diǎn)，每一個(gè)斑點(diǎn)代表了一個(gè)分泌細(xì)胞因子IFN-γ的T細(xì)胞，根據(jù)斑點(diǎn)數(shù)量可以判斷體內(nèi)是否存在針對MTB免疫反應(yīng)的效應(yīng)T細(xì)胞的數(shù)量[14]。由于ESAT-6和CFP-10均來自MTB基因組RDl區(qū)域，除結(jié)核分枝桿菌存在RDl區(qū)外，其他的如牛分枝桿菌、BCG和大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌該區(qū)域均缺失，因此T-SPOT.TB方法不受BCG、環(huán)境分枝桿菌感染等的影響，具有靈敏度高、特異度高等特點(diǎn)[2,5]。

3 T-SPOT.TB的應(yīng)用

3.1 外周血T-SPOT.TB在肺結(jié)核臨床診斷中的應(yīng)用

《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-肺結(jié)核診斷(WS288-2017)》指南[15]中提出肺結(jié)核診斷的實(shí)驗(yàn)室免疫學(xué)檢查需IGRA陽性。一項(xiàng)來自波蘭的研究[16]顯示：IGRA和TST的靈敏度在菌陽性和菌陰性的病例中結(jié)果基本無區(qū)別，IGRA靈敏度菌陽性組為55.8%，菌陰性組為64.9%，TST的靈敏度菌陽性組為65.1%，菌陰性組為55.6%。由此可見，IGRA和TST對菌陰性肺結(jié)核病人的診斷價(jià)值差異不明顯，但是IGRA可評估病情的進(jìn)展，隨著肺結(jié)核病情的加重，IGRA水平會下降。在韓國延世大學(xué)針對224例菌陰性疑似肺結(jié)核病例全血IGRA的回顧性研究[17]中指出，在肺結(jié)核的診斷中IGRA優(yōu)于TST，94例活動性肺結(jié)核IGRA的靈敏度(81.9%)、陰性預(yù)測值(82.7%)分別高于TST的靈敏度(58.1%)和陰性預(yù)測值(51.9%)。FENG等[18]通過檢測180例活動性結(jié)核病人的T-SPOT.TB和TST，結(jié)果顯示：活動性肺結(jié)核組T-SPOT.TB的靈敏度(95.6%)、特異度(69.2%)明顯高于TST，T-SPOT.TB的診斷比值比(DOR)為10.71，提示T-SPOT.TB對肺結(jié)核有較高的診斷價(jià)值。雖然TST診斷結(jié)核也有一定作用，但是不能區(qū)分是接種了疫苗還是結(jié)核分枝桿菌感染。胡玉欣等[19]在選取菌陰性肺結(jié)核患者進(jìn)行T-SPOT.TB的研究中顯示：T-SPOT.TB靈敏度和特異度分別為95.5%和89.6%，其結(jié)果優(yōu)于抗結(jié)核分枝桿菌抗體和血沉實(shí)驗(yàn)，在結(jié)合患者結(jié)核病病史、結(jié)核接觸史以及影像學(xué)檢查進(jìn)行的基于Logistic回歸模型ROC曲線提示，T-SPOT.TB在肺結(jié)核的診斷中具有較高的診斷價(jià)值(ROC曲線下面積為0.937)。

另有研究[20-21]報(bào)道，T-SPOT.TB試驗(yàn)不僅對肺結(jié)核的診斷有較高的臨床價(jià)值，而且可以判斷肺結(jié)核的抗結(jié)核治療的療效。蘭景雙等[20]研究發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核T-SPOT.TB的靈敏度和特異度分別為95.1%和91.3%，結(jié)核患者治療30、60、90和120 d的T-SPOT.TB陽性率分別為83.5%、67.7%、35.4%和10.2%，提示T-SPOT.TB是否轉(zhuǎn)陰可判斷治療療效。YAN等[21]對活動性肺結(jié)核和肺外結(jié)核檢測T-SPOT.TB研究中發(fā)現(xiàn)，抗結(jié)核治療前的靈敏度為80.62%，治療期間的靈敏度為60.67%，且觀察了治療1個(gè)月、1年、1年以上的T-SPOT.TB陽性率，結(jié)果顯示隨著治療時(shí)間的延長，其靈敏度逐步下降。

3.2 外周血T-SPOT.TB在肺外結(jié)核臨床診斷中的應(yīng)用

肺外結(jié)核是指發(fā)生在肺部以外的其他器官的結(jié)核病，常見有結(jié)核性淋巴結(jié)炎、骨關(guān)節(jié)結(jié)核、結(jié)核性心包炎、神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核以及泌尿系統(tǒng)結(jié)核等。肺外結(jié)核通常沒有特定的臨床表現(xiàn)，給臨床早期診斷帶來了困難。有研究[18]顯示T-SPOT.TB對肺外結(jié)核的診斷有很高的價(jià)值。TANG等[22]對86例骨關(guān)節(jié)結(jié)核病人進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)室檢查顯示，T-SPOT.TB的靈敏度為81.4%，高于Xpert MTB/RIF(70.9%)，但是T-SPOT.TB的特異度低于XpertMTB/RIF，兩個(gè)項(xiàng)目聯(lián)合檢測則診斷價(jià)值更高，其靈敏度和特異度分別為91.9%和96.7%。王香梅等[23]認(rèn)為，T-SPOT.TB診斷肺外結(jié)核的靈敏度為87.5%，特異度為90.6%，陽性預(yù)測價(jià)值為84.8%,陰性預(yù)測值為92.3%，均明顯高于TST，且T-SPOT.TB的ROC曲線下面積(0.886)高于TST(0.612)。一項(xiàng)關(guān)于IGRA診斷結(jié)核性淋巴結(jié)炎的Meta分析[24]結(jié)果顯示，T-SPOT.TB診斷結(jié)核性淋巴結(jié)炎的總靈敏度為0.90(95%CI:0.86～0.94)，總特異度為0.74(95%CI:0.69～0.78)，ROC曲線下面積為0.98，提示該法具有較高的診斷準(zhǔn)確性，可作為對結(jié)核病非侵入性診斷工具的補(bǔ)充。ZHOU等[25]的Meta分析結(jié)果顯示：T-SPOT.TB診斷肺外結(jié)核的總靈敏度和總特異度分別為0.82(95%CI:0.77～087)和0.75(95%CI:0.67～0.83)，略高于QFT-GIT試驗(yàn)的0.78(95%CI:0.71～0.84)和0.71(95%CI:0.63～0.78)。

3.3 外周血T-SPOT.TB在結(jié)核潛伏感染臨床診斷中的應(yīng)用

機(jī)體最初感染MTB后，大部分感染者機(jī)體有免疫反應(yīng)但表現(xiàn)為無臨床癥狀特征的潛伏結(jié)核感染(LTBI)，5%～15%的潛伏結(jié)核感染者在2～5年內(nèi)會發(fā)展為活動性結(jié)核病[26]。在免疫力低下及長期大量使用糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑的人群中潛伏結(jié)核感染發(fā)展為活動性結(jié)核風(fēng)險(xiǎn)更高，如HIV感染者、自身免疫性疾病、血液病等。有研究[27]報(bào)道，HIV合并結(jié)核潛伏感染的患者CD4+T淋巴細(xì)胞下降明顯，約有14%的患者CD4+T淋巴細(xì)胞<100 μL-1，因此，T-SPOT.TB的陽性率很低，僅有11%，低于QFT-GIT試驗(yàn)。YU等研究[28]報(bào)道，T-SPOT.TB用于診斷HIV合并結(jié)核感染的靈敏度和特異度分別為41.3%和94.6%，高于TST(12.9%和91.8%)，2種試驗(yàn)方法并聯(lián)可提高靈敏度(45.2%)，串聯(lián)可提高特異度(100%)。

自身免疫性疾病人群中結(jié)核潛伏感染比較常見。趙麗萍等[29]采用T-SPOT.TB篩查226例患者，發(fā)現(xiàn)風(fēng)濕免疫病組T-SPOT.TB的試驗(yàn)陽性率(39.39%)與非風(fēng)濕免疫病組陽性率(46.53%)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示T-SPOT.TB試驗(yàn)對風(fēng)濕免疫病患者篩查結(jié)核分枝桿菌潛伏感染有一定診斷價(jià)值。畢艷等[30]分析研究了T-SPOT.TB在結(jié)核潛伏感染者免疫抑制劑治療的臨床應(yīng)用，結(jié)果顯示T-SPOT.TB的陽性率和確診率(36.4%、94.9%)高于TST(28.4%、69.6%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且對T-SPOT.TB陽性的病人進(jìn)行預(yù)防性抗結(jié)核治療，隨訪1年后無1例結(jié)核病發(fā)生。因此，T-SPOT.TB檢測在自身免疫性疾病的結(jié)核潛伏感染診治中具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

國外2項(xiàng)IGRA在結(jié)核潛伏感染診斷的系統(tǒng)評價(jià)和Meta分析[31-32]結(jié)果表明，T-SPOT.TB在結(jié)核潛伏感染臨床診斷中有較高的臨床價(jià)值，且評價(jià)指標(biāo)優(yōu)于QFT-GIT和TST。來自加拿大[31]的T-SPOT.TB診斷結(jié)核潛伏感染的系統(tǒng)評價(jià)結(jié)果顯示，T-SPOT.TB的總靈敏度為0.90(95%CI:0.86～0.93)，總特異度為0.93(95%CI:0.86～1.00)，明顯高于TST。DIEL等[32]的Meta分析顯示，T-SPOT.TB在潛伏感染中總特異度達(dá)到100%(95%CI:97.6%～100%)，而TST的總特異度為88.7%(95%CI:84.6%～92.0%)。

3.4 體液T-SPOT.TB在結(jié)核病臨床診斷中的應(yīng)用

T-SPOT.TB除了對外周血的T細(xì)胞進(jìn)行檢測外，越來越多的實(shí)驗(yàn)證明[33-37]在體液中進(jìn)行T-SPOT.TB檢測更有助于結(jié)核病的診斷。機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌后，效應(yīng)T細(xì)胞從外周血向活動性結(jié)核感染部位集中，此時(shí)體液T-SPOT.TB檢測比外周血特異度更高，而腦脊液由于血腦屏障的作用，其T-SPOT.TB的靈敏度低于外周血[14,38-39]。ZHANG等[33]采用漿膜腔積液T-SPOT.TB診斷結(jié)核性漿膜炎的前瞻性研究顯示，漿膜腔積液T-SPOT.TB的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、陽性似然比均高于外周血，陰性似然比低于外周血。一項(xiàng)在心包積液T-SPOT.TB診斷結(jié)核性心包炎的研究[34]中，心包積液T-SPOT.TB各項(xiàng)評價(jià)指標(biāo)均高于外周血，2種試驗(yàn)并聯(lián)提高了靈敏度(100%)，串聯(lián)提高了特異度(97.0.%)。XU等[35]的研究聯(lián)合檢測胸腔積液T-SPOT.TB和胸腔積液ADA診斷結(jié)核性胸膜炎的結(jié)果顯示：胸腔積液T-SPOT.TB的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、陽性似然比、ROC曲線面積均高于外周血，陰性似然比低于外周血，3種試驗(yàn)聯(lián)合的Logistic回歸結(jié)果顯示：靈敏度、特異度、ROC曲線下面積分別為0.979(95%CI:93.4～99.6)、0.875(95%CI:82.0～89.6)、0.964(95%CI:0.934～0.995)。LIAO等[36]也報(bào)道了胸腔積液T-SPOT.TB有很高的診斷價(jià)值，靈敏度為95.7%，特異度為100%。

在IGRA診斷結(jié)核性胸膜炎的Meta分析[37]中，胸水T-SPOT.TB的靈敏度為0.95(95%CI:0.93～0.97)，特異度為0.84(95%CI:0.78～0.89)，DOR為88.5，ROC曲線下面積為0.98；外周血T-SPOT.TB的靈敏度為0.82(95%CI:0.78～0.85)，特異度為0.77(95%CI:0.69～0.83)，DOR為19.82，ROC曲線下面積為0.89。由此可見，胸水T-SPOT.TB各項(xiàng)評價(jià)指標(biāo)比外周血的診斷效能更高。

4 ELISPOT試驗(yàn)在臨床結(jié)核病診斷中的應(yīng)用展望

就目前研究來看，T-SPOT.TB尚不能完全鑒別診斷潛伏性結(jié)核感染與活動性結(jié)核感染，而且試劑盒成本較高。不過，有文獻(xiàn)[40-41]報(bào)道，丙氨酸脫氫酶(ALaDH)抗原刺激T細(xì)胞產(chǎn)生的白介素-2(IL-2)的ELISPOT試驗(yàn)可用于區(qū)分活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核感染，且診斷結(jié)核病的靈敏度、特異度、ROC曲線下面積均高于T-SPOT.TB試驗(yàn)。LI等[42]報(bào)道由北京金豪制藥公司生產(chǎn)的結(jié)核感染T細(xì)胞試劑(TS-SPOT試劑盒)成本更低，且TS-SPOT各項(xiàng)試驗(yàn)評價(jià)指標(biāo)與T-SPOT.TB相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，2種試驗(yàn)的Kappa值為0.91(0.85～0.95)，具有良好的一致性。

5 結(jié)語

綜上，結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)不受機(jī)體免疫狀態(tài)影響，其選用的結(jié)核特異性抗原(ESAT-6，CFP-l0)不受環(huán)境分枝桿菌和卡介苗的影響，故優(yōu)于傳統(tǒng)的抗結(jié)核分枝桿菌抗體和結(jié)核菌素試驗(yàn)。結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)在肺結(jié)核、肺外結(jié)核、結(jié)核潛伏感染的診斷和篩查中都有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值，尤其是體液T-SPOT.TB的檢測對結(jié)核病的診斷具有更高的診斷價(jià)值。盡管T-SPOT.TB還不能完全鑒別診斷結(jié)核潛伏感染與活動性結(jié)核感染，且試劑盒成本較高，但隨著相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展，仍可寄望其在結(jié)核病的診斷方面發(fā)揮更大作用。