結(jié)核病實驗室診斷技術(shù)研究進展

白 云，安黎云

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tu?ber?culosis， MTB）經(jīng)呼吸道傳播而引起的全身性慢性傳染病，又被稱為“白色瘟疫”［1］。 結(jié)核病是由單一致病菌引起的病死率最高的且是人類發(fā)展史最長的一種疾病，是全世界公共衛(wèi)生領(lǐng)域面臨的最嚴(yán)峻挑戰(zhàn)［2］。 據(jù)WHO 統(tǒng)計，全球每年死于結(jié)核病的人數(shù)高達300 萬人，我國結(jié)核病發(fā)病率高達99／10 萬人，是全球27 個耐多藥結(jié)核病、22 個結(jié)核病高感染率國家之一［3］。 同時由于艾滋病的流行、結(jié)核桿菌耐藥性的增強和多重耐藥菌株的出現(xiàn)、痰菌陽性結(jié)核病患者管理措施不當(dāng)，致使我國結(jié)核病防治工作非常嚴(yán)峻［4］。 另外由于實驗室檢測環(huán)節(jié)的薄弱，傳統(tǒng)檢測方法存在靈敏度低、檢測時間長、陽性率低等不足，也一定程度制約了結(jié)核病的盡早診斷和治療［5］。 肺外結(jié)核由于結(jié)核桿菌數(shù)量較少，且由于深部器官結(jié)核病灶標(biāo)本不易獲取，也需要更快速、更可靠的實驗室診斷方法［6?7］。 因此結(jié)核病的快速診斷新技術(shù)必將成為全球結(jié)核病研究和防控的優(yōu)先發(fā)展領(lǐng)域。 從100 多年前德國科學(xué)家Robert Koch 發(fā)現(xiàn)MTB，再到結(jié)核病細菌學(xué)、分子生物學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展，可以說結(jié)核病的發(fā)展史就是一部結(jié)核病臨床診治史，實驗室診斷在結(jié)核病的預(yù)防控制、診斷、治療過程中發(fā)揮著重要作用，是檢出致病菌、確診及選擇治療方案的主要手段，也是評估治療效果的有效方法［8］。 本文就以下幾個方面對我國結(jié)核病實驗室診斷技術(shù)的應(yīng)用進展闡述如下。

1 MTB 培養(yǎng)和藥物敏感試驗（藥敏試驗）

1.1痰涂片萋－尼染色鏡檢法 痰涂片萋－尼染色鏡檢法在結(jié)核病的防治工作中應(yīng)用范圍最廣泛，優(yōu)勢是操作快速、簡便、經(jīng)濟，缺點是靈敏性低，同時假陰性率較高，從而導(dǎo)致結(jié)核病的檢出率偏低。

1.2液基夾層杯法 液基夾層杯法首先對痰液進行徹底滅活后通過高速離心并加熱，將釋放出的MTB 集聚在彭氏夾層杯底部的基片上，然后進行萋－尼染色鏡檢［9］。 有研究發(fā)現(xiàn)，將754 份痰標(biāo)本同時采用直接痰涂片法與液基夾層杯法進行鏡檢，后者可將陽性檢出率提高至23．5%（177／754）［10］。1.3固體及液體培養(yǎng) MTB 培養(yǎng)是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，MTB 固體培養(yǎng)試驗的靈敏度高于MTB 涂片鏡檢［11］，以Middlebrook 為基礎(chǔ)的7HIO 培養(yǎng)基和改良羅氏培養(yǎng)基大多用于固體培養(yǎng)，菌陽性結(jié)果需要3～4 周，而菌陰性結(jié)果則需要8 周［12?13］。 MTB 液體培養(yǎng)法是應(yīng)用BACTEC MGIT 960 自動化培養(yǎng)系統(tǒng)經(jīng)測定液體培養(yǎng)基中氧氣消耗量來判定MTB 有無生長（即陰陽性），具體試驗原理：BACTEC MGIT 960 自動化培養(yǎng)系統(tǒng)的MGIT 培養(yǎng)管底部含有一定量氧淬滅熒光的硅樹脂成分，其可使細菌生長過程中吸收彌散的氧氣，隨之釋放二氧化碳，但隨氧氣進一步消耗，熒光劑不再受抑制，在紫外線照射下培養(yǎng)管便出現(xiàn)熒光，且熒光強度和氧氣消耗量呈正比。此液體培養(yǎng)法不僅敏感性較高，同時還可以縮短陽性結(jié)果報告時間（4～10 d），可使陰性結(jié)果報告時間縮短為42 d；但該方法缺點是對實驗室的生物安全級別要求很高，并且試劑完全依賴進口，成本較高，在資源匱乏的國家和地區(qū)尚不能大規(guī)模普及［14］。同時MTB 培養(yǎng)陽性敏感率僅為45%～80%，且培養(yǎng)周期長，并且要求標(biāo)本中含有活菌［15］。 但培養(yǎng)時間過長可能延誤診斷和治療，易導(dǎo)致疾病惡化。 另外，臨床工作中發(fā)現(xiàn)在曾經(jīng)接受抗結(jié)核治療的患者中，獲取含有活菌體液標(biāo)本非常不易。

1.4耐多藥結(jié)核病傳統(tǒng)實驗室診斷方法 藥敏試驗是耐多藥結(jié)核病的傳統(tǒng)實驗室診斷方法，同時也是我國大多數(shù)醫(yī)院常用的診斷方法之一［16］。 該方法存在對實驗室要求高、周期長、靈敏度低的缺點，容易導(dǎo)致結(jié)核病復(fù)發(fā)、獲得性耐藥及切口處竇道、瘺口形成，不利于早期快速診斷［17］。

2 分子診斷方法

21 世紀(jì)初隨分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，新型分子診斷技術(shù)應(yīng)運而生，因其具有較高的特異性、敏感度而在臨床受到極大青睞。 其中尤以MTB 快速分子診斷技術(shù)應(yīng)用廣泛，如實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、基因芯片技術(shù)、核酸線性探針技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)、交叉引物擴增技術(shù)（crossing priming amplification， CPA）及利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增試驗等，現(xiàn)逐一介紹如下。

2.1實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)工作原理是：在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中分別加入兩端標(biāo)有淬滅、熒光集團的探針［18］，探針序列與擴增處互補形成單鏈核苷酸序列，擴增后分析熔解曲線同時實時監(jiān)測熒光值動態(tài)變化，經(jīng)計算溫度熒光值和負導(dǎo)數(shù)獲得探針與該序列雜交產(chǎn)物熔解曲線的熔點（Tm 值），最終經(jīng)推斷該序列基因突變信息，評估MTB 是否對抗結(jié)核藥物耐藥。

2.2基因芯片技術(shù) 基因芯片又被稱為DNA 芯片、DNA 微陣列和寡核苷酸陣列，該技術(shù)是基于MTB 探針對不同抗結(jié)核藥物基因突變位點的不同，經(jīng)檢測基因突變位點上的DNA 片段來判定MTB 患者是否對抗結(jié)核藥物耐藥，同時各基因突變位點與對應(yīng)藥物耐藥性又有一定相關(guān)性［19］。 具體試驗方法：采用原位合成或顯微打印法將DNA 探針固定在支持物表面形成二維DNA 探針序列，后使其與標(biāo)記物樣品進行雜交，經(jīng)檢測雜交信號判斷基因突變位點，然后通過分析基因突變位點與抗結(jié)核藥物耐藥性間的關(guān)聯(lián)性，而實現(xiàn)被測樣品高效、快速檢測［20］。2.3核酸線性探針技術(shù) 核酸線性探針技術(shù)是結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴增、反向雜交、膜顯色技術(shù)經(jīng)引物擴增目的片段，后將擴增產(chǎn)物與膜上所固定的特異性探針進行雜交，經(jīng)酶顯色法判定雜交產(chǎn)物結(jié)果從而實現(xiàn)MTB 檢測的一種實驗室技術(shù)［21］。

2.4CPA CPA 是一種新型恒溫核酸擴增技術(shù)，包含具有置換鏈功能的嗜熱性脂肪芽孢桿菌聚合酶、兩條交叉引物和兩條擴增引物［22］。 這些寡聚核苷酸鏈能依靠具有高活性鏈置換特性的嗜熱性脂肪芽孢桿菌聚合酶，使DNA 實現(xiàn)不斷的循環(huán)擴增，從而確定受檢樣本中是否含有MTB［23］。 同時CPA 可與核酸試紙檢測技術(shù)、快速核酸提取技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用，經(jīng)多方面臨床驗證，此方法較傳統(tǒng)培養(yǎng)法敏感度和特異度高［24］。

2.5實時熒光核酸恒溫擴增技術(shù) 實時熒光核酸恒溫擴增技術(shù)是結(jié)合實時熒光檢測和核酸恒溫擴增技術(shù)的一種新型核酸檢測技術(shù)［25］。 該技術(shù)是在同一溫度下經(jīng)拷貝目標(biāo)病毒反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生的靶標(biāo)核酸上一個雙鏈DNA，后利用T7 RNA 多聚酶從該DNA拷貝產(chǎn)生的100～1000 個RNA；每個RNA 拷貝再從反轉(zhuǎn)錄開始進入下一擴增循環(huán)；同時將帶有熒光標(biāo)記的探針和這些復(fù)制RNA 進行特異性結(jié)合并產(chǎn)生熒光，再經(jīng)熒光檢測儀實時捕獲直觀反映擴增循環(huán)情況從而到達檢測目的［26］。

2.6環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù) 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)是利用具有鏈置換活性的DNA 聚合酶在約65℃條件下完成核酸擴增的反應(yīng)特點，來檢測MTB 目的DNA 片段，從而獲得診斷線索的一種檢測方法［27］。

2.7利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增試驗 利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增試驗是一種依托于Gene Xpert 平臺及realtime．PCR 技術(shù)的檢測MTB 及利福平耐藥的一種方法［28］。 Gene Xpert 平臺最初是美國用于快速檢測郵政系統(tǒng)含有炭疽病毒郵件的，后拓展用于多種病原微生物及細菌檢測。 利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增試驗是以半巢式實時定量PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)，以rpoB 基因為靶基因，擴增其上192 bp 片段DNA 進行檢測；因為≥95%的利福平耐藥菌株有rpoB 基因變異，同時該區(qū)域具有相同核酸序列。 同時使用6 種分子信標(biāo)來對應(yīng)檢測6 種探針，其中以探針A～E 命名的5 個相互重疊的分子探針選擇性覆蓋rpoB 基因的81 bp 核心區(qū)域，用來檢測利福平耐藥；另外1 個特異性探針對應(yīng)球芽孢桿菌作為內(nèi)參，來判斷DNA 擴增率及檢測率［29］。此外，大部分利福平耐藥菌株同時也會對異煙肼耐藥，故其也可作為耐多藥結(jié)核病的監(jiān)測指標(biāo)。 近年來，利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增試驗廣泛應(yīng)用于痰液、臨床分離菌株及少數(shù)肺外結(jié)核標(biāo)本的MTB 和利福平耐藥性檢測，具有檢測敏感度及特異度高、生物安全性好、操作簡便、耗時短等優(yōu)勢［30］，故WHO 將該技術(shù)推薦為MTB 分子藥敏檢測的首選方法。

3 免疫學(xué)診斷技術(shù)

3.1皮膚結(jié)核菌素感染檢測 結(jié)核菌素試驗及后來廣泛應(yīng)用的結(jié)核菌素純蛋白衍生物試驗，在結(jié)核病尤其是兒童結(jié)核病的輔助診斷中發(fā)揮重要作用，但因其方法原始并且存在許多弊端，如接種過卡介苗、免疫功能低下患者檢測靈敏度和特異度均低，限制了其在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用。

3.2γ?干擾素（IFN?γ）釋放試驗 近年來，在我國各級實驗室陸續(xù)開展IFN?γ 釋放試驗，并將其作為確定結(jié)核潛伏感染及診斷結(jié)核病的主要措施［31］，其主要包括兩種方法，現(xiàn)介紹如下。

3.2.1基于全血的酶聯(lián)免疫吸附試驗：經(jīng)使用MTB 特異性蛋白質(zhì)的多肽抗原，培養(yǎng)濾液蛋白10和TB7．7 參與全血共同孵育，二者能夠刺激感染MTB 者的T 細胞應(yīng)激發(fā)生IFN?γ 反應(yīng)，但是絕大多數(shù)的非MTB 及卡介苗菌株都不含有以上蛋白，故未感染者或卡介苗接種及結(jié)核潛伏感染者，不會產(chǎn)生相應(yīng)免疫應(yīng)答，可經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測IFN?γ來判斷是否存在MTB 特異性細胞免疫反應(yīng)［32］。

3.2.2基于外周血淋巴細胞的免疫斑點試驗：經(jīng)將外周血淋巴細胞、MTB 特異性混合性抗原A 和B 的多肽片段，與對照試劑混合后放入含抗IFN?γ 抗體的微孔培養(yǎng)板內(nèi)。 當(dāng)外周血單個核細胞存在MTB特異性T 細胞時，便會刺激培養(yǎng)液中混合抗原A 和B 分泌IFN?γ，同時被微孔板抗IFN?γ 抗體捕獲，后加入堿性磷酸酶標(biāo)記，并針對不同IFN?γ 表位的二抗與被捕獲的IFN?γ 結(jié)合，最終在反應(yīng)部位顯色底物被酶分解成色素沉淀斑點，每個斑點代表1 個MTB 特異效應(yīng)T 細胞，據(jù)斑點數(shù)量檢測體內(nèi)含有對MTB 反應(yīng)的效應(yīng)T 細胞數(shù)量［33］。

3.3T?SPOT 釋放試驗 T?SPOT 釋放試驗是利用酶聯(lián)免疫吸附試驗從單細胞水平來檢測細胞因子的免疫技術(shù)［34］。 雖然此技術(shù)對結(jié)核感染的診斷敏感性和特異性較其他方法差，但是其優(yōu)點在于標(biāo)本易采集且檢測耗時短，特別適用于漿膜腔滲出液、呼吸道分泌物及病灶分泌物等脫落細胞類檢測，可作為不易取得標(biāo)本、菌陰性肺結(jié)核、肺外結(jié)核、兒童及體弱等特殊群體的輔助診斷手段［35］。 且T?SPOT 釋放試驗可作為利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增試驗、結(jié)核菌素－PCR 檢測的有效補充，三者聯(lián)合應(yīng)用可極大提高肺結(jié)核早期診斷率，同時對疾病的控制、傳播和預(yù)防起到很大的作用。

4 小結(jié)

由于耐多藥結(jié)核菌的流行，人類免疫缺陷病毒感染、器官移植、免疫抑制劑大量不規(guī)范使用所導(dǎo)致免疫損害的增多，以及高齡人口免疫力低下等因素，使MTB 感染率日益增高，我國結(jié)核病防治工作面臨形勢非常嚴(yán)峻［36］。 我國結(jié)核病實驗室診斷體系由三部分組成：第一，以細菌學(xué)檢查為主要技術(shù)手段的國家、省、地（市）和區(qū)（縣）疾病預(yù)防控制機構(gòu)結(jié)核病實驗室體系，其中全國約1／3 的區(qū)（縣）級實驗室

已經(jīng)配備了分子診斷設(shè)備；第二，?？漆t(yī)院結(jié)核病實驗室和結(jié)核病定點醫(yī)院，可開展涂片鏡檢、藥敏試驗和分離培養(yǎng)等較全面的細菌學(xué)檢查，同時開展分子生物學(xué)技術(shù)及快速培養(yǎng)法對特殊患者進行鑒別診斷；第三，綜合醫(yī)療機構(gòu)的結(jié)核病實驗室，可開展細菌學(xué)檢查和一些新實驗室診斷方法。 目前，第三類醫(yī)療機構(gòu)的結(jié)核病實驗室正在逐步加入質(zhì)控體系并越來越規(guī)范化。 同時WHO 建議亟須研發(fā)更加快速、安全、準(zhǔn)確的結(jié)核病實驗室診斷技術(shù)，以應(yīng)對日益嚴(yán)重的耐多藥結(jié)核病疫情；應(yīng)用更多的快速、敏感度和特異度高的結(jié)核病實驗室診斷新技術(shù)及方法，來改善目前診斷方法相對落后的局面。