固相萃取高效液相色譜法檢測(cè)速凍黑塌菜中3種合成著色劑

楊 俊, 陳 彬, 程曉宏 , 蔣林惠

南通市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心 (南通 226006)

黑塌菜又名塌棵菜，目前在江蘇南通及周邊地區(qū)都有種植，其葉片呈墨綠色，含有大量的膳食纖維、鈣、鐵、VC、VB1、VB2、胡蘿卜素等，經(jīng)霜凍后肥嫩鮮美而著稱。黑塌菜秋季播種、冬春上市，上市時(shí)間短，為保證市場(chǎng)需求，黑塌菜開(kāi)始向商品化生產(chǎn)發(fā)展，運(yùn)用速凍技術(shù)保鮮，并制定優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程和企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定速凍黑塌菜中不得使用合成著色劑[1-6]。

本文根據(jù)黑塌菜墨綠色澤，選擇檸檬黃、日落黃、亮藍(lán)3種能調(diào)和成墨綠色的合成著色劑，采用固相萃取高效液相色譜法測(cè)定速凍黑塌菜中的檸檬黃、日落黃、亮藍(lán)含量。該方法無(wú)需層析柱的填裝，采用DAD時(shí)間事件，根據(jù)3種合成著色劑出峰順序，切換不同著色劑的檢測(cè)波長(zhǎng)，提高了方法的靈敏度。本方法操作簡(jiǎn)便、精密度和準(zhǔn)確度良好，滿足速凍黑塌菜中3種合成著色劑同時(shí)檢測(cè)的需要。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1260 InfinityII型高效液相色譜儀配二極管陣列(DAD)檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司；MP-48型正壓固相萃取裝置，?？苾x器有限公司；Xcelvap型氮吹濃縮儀，美國(guó)Horizon公司；VM-2500型多管旋渦混合儀，廣東安勝儀器有限公司；TGL-16M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；PB-10型pH計(jì)，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；T25DS25型勻漿機(jī)，德國(guó)IKA公司。

甲醇(色譜純)，美國(guó)Fisher公司；CNW Poly-sery(SBEQ-CA73-6mL)合成著色劑專用固相萃取小柱，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；一水合檸檬酸(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：檸檬黃、日落黃、亮藍(lán)(北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司)，濃度均為1.0 mg/mL。

1.2 方法

1.2.1樣品處理

稱取5 g樣品置于50 mL離心管中，加入10 mL水，10 000 r/min勻漿1 min，10 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)50 mL離心管中，再次用10 mL水提取，合并上清液，用20%檸檬酸溶液調(diào)節(jié)上清液的pH=3～4，待用。

1.2.2樣品凈化

將固相萃取小柱放置在正壓固相萃取裝置上，使用前先采用5 mL甲醇活化，再用5 mL去離子水平衡。將待凈化樣品溶液全部上樣到小柱上，再用10 mL水分兩次沖洗離心管，并上樣到小柱上。用5 mL甲醇∶甲酸∶水(4∶2∶4，v/v/v)淋洗，10%氨水甲醇6 mL分兩次洗脫。洗脫液40 ℃氮吹至近干，加入1 mL流動(dòng)相復(fù)溶，過(guò)0.45 μm針式過(guò)濾器(PTFE)，上機(jī)測(cè)定。

1.2.3儀器條件

色譜柱：Poroshell 120 EC -C18(4.6 mm×150 mm×5 μm)；柱溫35 ℃；流動(dòng)相為0.02 mol乙酸銨溶液(A)-甲醇(B)；流速1.0 mL/min；梯度洗脫，0 min95%A、3 min65%A、7～10 min0%A，10.1～21 min95%A；進(jìn)樣量10 μL。二極管陣列檢測(cè)器時(shí)間事件：0～5.2 min檢測(cè)波長(zhǎng)為428 nm；5.2～6.5 min檢測(cè)波長(zhǎng)更改為484 nm；6.5～12 min檢測(cè)波長(zhǎng)更改為628 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

檸檬黃、日落黃、亮藍(lán)為水溶性合成著色劑，在水中有較好地溶解性，實(shí)驗(yàn)比較了超聲提取、渦旋振蕩提取和高速勻漿提取方法，發(fā)現(xiàn)黑塌菜經(jīng)10 000 r/min勻漿處理，能打碎樣品組織結(jié)構(gòu)，充分提取樣品中3種合成著色劑。由于黑塌菜葉片質(zhì)地較輕，實(shí)驗(yàn)比較了4 000 r/min、6 000 r/min和10 000 r/min轉(zhuǎn)速下的離心效果，采用較高的離心速度10 000 r/min能較好地分離樣品和提取溶液，保證樣品中的合成著色劑充分地溶解到提取溶劑中。

2.2 天然色素和糖分等雜質(zhì)的去除

黑塌菜經(jīng)霜凍后葉片含糖量增加，天然色素也會(huì)干擾樣品的分析。本文選用合成著色劑專用固相萃取小柱，上樣后，比較了甲醇、2%甲酸水、甲醇∶甲酸∶水(4∶2∶4, v/v/v)不同淋洗液淋洗效果，發(fā)現(xiàn)甲醇∶甲酸∶水(4∶2∶4, v/v/v)不僅能使天然色素分解褪色，而且能將樣品中糖分等雜質(zhì)除去，且回收率能達(dá)到要求。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

合成著色劑的高效液相色譜檢測(cè)波長(zhǎng)一般為254 nm，但不同著色劑的最大吸收波長(zhǎng)不一樣。我們分別提取了檸檬黃(258 nm、428 nm)、日落黃(484 nm)、亮藍(lán)(628 nm)最大吸收波長(zhǎng)，比較了加標(biāo)樣品中檸檬黃258 nm和428 nm的提取色譜圖，其中檸檬黃在258 nm處色譜圖附近干擾峰較多，而在428 nm處色譜圖無(wú)干擾峰，因而選擇428 nm作為檸檬黃檢測(cè)波長(zhǎng)。加標(biāo)樣品中日落黃和亮藍(lán)在其最大吸收波長(zhǎng)下的色譜圖附近也沒(méi)有干擾峰，選擇484 nm作為日落黃檢測(cè)波長(zhǎng)，628 nm作為亮藍(lán)檢測(cè)波長(zhǎng)。

通過(guò)DAD時(shí)間事件表，根據(jù)3種合成著色劑出峰順序，切換不同著色劑的檢測(cè)波長(zhǎng)。時(shí)間事件：0～5.2 min檢測(cè)波長(zhǎng)為428 nm；5.2～6.5 min檢測(cè)波長(zhǎng)更改為484 nm；6.5～12 min檢測(cè)波長(zhǎng)更改為628 nm。采集加標(biāo)樣品色譜圖，優(yōu)化檢測(cè)波長(zhǎng)下色譜圖干擾大幅減少，降低雜質(zhì)的共流出假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)提高了3種合成著色劑的靈敏度，見(jiàn)圖1。

2.4 方法的相關(guān)系數(shù)和檢出限

檸檬黃、日落黃、亮藍(lán)在0.1～20 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性。稱取5 g空白樣品，在接近檢出下限水平進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，檢出濃度均大于3倍基線噪聲，計(jì)算檢出限，見(jiàn)表1。

圖1 不同檢測(cè)波長(zhǎng)下色譜圖的比較

表1 3種合成著色劑的線性方程和檢出限

2.5 方法的精密度和回收率實(shí)驗(yàn)

分別稱取同一均勻的空白樣品5 g，分別加入低、中、高3種不同濃度的各種合成著色劑，濃度分別為0.5、2.0、10.0 mg/kg，每個(gè)濃度做6個(gè)平行，經(jīng)提取凈化后檢測(cè)，計(jì)算回收率和精密度，見(jiàn)表3。實(shí)驗(yàn)表明：3種濃度下速凍黑塌菜中合成著色劑的平均回收率在89.8%～105.9%之間，RSD在0.47%～5.62%之間。

表2 回收率試驗(yàn)和精密度(n=6)

3 結(jié)論

本文建立了速凍黑塌菜中3種合成著色劑檸檬黃、日落黃和亮藍(lán)的固相萃取小柱-高效液相色譜測(cè)定方法。樣品加水經(jīng)勻漿提取后，轉(zhuǎn)移至活化平衡后的固相萃取小柱，合成著色劑專用固相萃取小柱能選擇性地吸附3種合成著色劑，甲醇∶甲酸∶水(4∶2∶4, v/v/v)淋洗能使天然色素褪色，并將樣品中糖分等雜質(zhì)除去，10%氨水甲醇洗脫，氮吹至近干后，1 mL 0.02 mol乙酸銨溶液∶甲醇(95∶5, v/v/v)溶解，0.45 μm針式過(guò)濾器(PTFE)過(guò)濾后測(cè)定，保留時(shí)間定性，色譜峰面積定量。該方法無(wú)需層析柱的填裝，具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，精密度和準(zhǔn)確度良好，能滿足速凍黑塌菜中3種合成著色劑同時(shí)檢測(cè)的需要。