GC-MS結(jié)合保留指數(shù)分析輪鐘花根的揮發(fā)性成分*

王建霞，劉一涵，田云剛，郭洪偉，李 明，畢紹文，魏 華,3

(1.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000；2.曲靖市沾益區(qū)萬遠(yuǎn)中藥材種植農(nóng)民專業(yè)合作社，云南 曲靖 655000；3.湖南省土家醫(yī)藥研究中心，湖南 吉首 416000)

輪鐘花(Cyclocodonlancifolius(Roxburgh)Kurz)系桔?？?Campanulaceae)輪鐘花屬(Cyclocodon)多年生草本植物，主要分布于東南亞和我國的云南(東南部)、四川、貴州、湖南(西部和南部)，根可入藥，無毒，甘而微苦，有益氣補(bǔ)虛、祛瘀止痛之效[1-2].《中華本草》記載其有“治療勞倦氣虛乏力、跌打損傷、腸絞痛”等效用[3].輪鐘花為湖南湘西及貴州少數(shù)民族傳統(tǒng)藥用植物，其胡蘿卜狀肉質(zhì)根，具良好的滋補(bǔ)效果；其紫黑色漿果可食用，富含原花青素、果膠和多糖，具有較強(qiáng)的抗氧化作用[4-5].有研究表明，輪鐘花果實(shí)中主要含糖類、生物堿、黃酮、酚類、甾體、蒽醌類、三萜類和有機(jī)酸等化學(xué)成分[6]，但未見根的化學(xué)成分研究報(bào)道，也未見根的揮發(fā)性成分研究報(bào)道.基于此，筆者擬采用水蒸氣蒸餾法、索氏提取法及超聲輔助萃取法分別提取輪鐘花藥用部位——根的揮發(fā)性成分，利用GC-MS技術(shù)，并結(jié)合保留指數(shù)(Retention Index, RI)法對(duì)揮發(fā)性成分的種類進(jìn)行定性分析，以期為輪鐘花根的深度開發(fā)利用提供參考.

1 實(shí)驗(yàn)材料

儀器：島津GCMS-QP2010(日本島津公司)；步琪Rotavapor R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琪公司)；中藥材粉粹機(jī)(永康市鉑歐五金制品有限公司)；梅特勒-托利多LE204E分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；昆山舒美KQ-250DE超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)；KDM型調(diào)溫電熱套(山東鄄城光明儀器有限公司).

試劑：正構(gòu)烷烴混合對(duì)照品C7-C40(產(chǎn)品編號(hào)CDAA-M-690038-HC-1 mL，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；正己烷、石油醚(沸程30～60 ℃)、石油醚(沸程60～90 ℃)(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；無水硫酸鈉(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司).以上試劑均為分析純.蒸餾水.

待測物：輪鐘花于2018年12月采自云南省曲靖市沾益區(qū)炎方鄉(xiāng)小古山村，由畢邵文先生提供，經(jīng)吉首大學(xué)張代貴教授鑒定為桔?？戚嗙娀▽僦参镙嗙娀ǖ母瑧{證標(biāo)本(JIU. WU20181201)存于吉首大學(xué)“湖南省土家醫(yī)藥研究中心”.將待測材料于45 ℃烘箱烘干，粉碎，過2號(hào)篩備用.

2 提取方法

2.1 水蒸氣蒸餾法

準(zhǔn)確稱量輪鐘花根粉末10 g置于1 000 mL 圓底蒸餾瓶中，加入300 mL蒸餾水和玻璃珠數(shù)粒，隔夜浸泡.連續(xù)提取8 h至揮發(fā)油量不再增加后，收集餾液，置于分液漏斗中，使用正己烷萃取3次.萃取液加適量無水硫酸鈉脫水后，40 ℃減壓濃縮，即得.

2.2 索氏提取法

準(zhǔn)確稱量輪鐘花根粉末10 g置于濾紙筒，包實(shí)放入索氏提取管中.提取管上接冷凝管，下接裝有100 mL石油醚(沸程30～60 ℃)的250 mL三角瓶.置于40 ℃水浴鍋回流提取4 h，然后將三角瓶中收集的提取液40 ℃減壓濃縮，即得.

2.3 超聲輔助萃取法

準(zhǔn)確稱量輪鐘花根粉末10 g置于250 mL三角瓶中，按料液比1∶10加入石油醚(沸程60～90 ℃)，于40 ℃超聲儀內(nèi)超聲提取2次，每次30 min，超聲頻率40 kHz，超聲功率250 W.完成后抽濾，收集濾液，于40 ℃減壓濃縮，即得.

2.4 GC-MS分析條件

色譜條件：SH-Rtx-5MS氣相色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，載氣為高純He(純度大于99.99%)，載氣流量1 mL·min-1，進(jìn)樣量1.0 μL，進(jìn)樣口溫度250.0 ℃，分流比20∶1.程序升溫：初始溫度100 ℃，以5 ℃·min-1的速率升溫至200 ℃，保持5 min，再以6 ℃·min-1的速率升溫至280 ℃，保持20 min，溶劑延遲3 min.質(zhì)譜條件：EI離子源，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍m/z50～600 amu，離子源溫度230 ℃.

2.5 保留指數(shù)的測定

取正構(gòu)烷烴混合對(duì)照品(C7-C40)0.1 mL溶于1 mL正己烷中，取適量過膜備用，按照前述色譜條件進(jìn)行分析，記錄保留時(shí)間，計(jì)算各待測化合物的保留指數(shù)(RI).

3 結(jié)果分析

按上述GC-MS條件測定，三種方法提取輪鐘花根揮發(fā)性成分的總離子流圖(TIC)如圖1所示.

1—索氏提取法；2—水蒸氣蒸餾法；3—超聲輔助萃取法.圖1 輪鐘花根揮發(fā)性成分總離子流圖Fig. 1 Total Ion Chromatogram of Volatile Components of Roots in Cyclocodon lancifolius (Roxburgh) Kurz

運(yùn)用單一線性升溫公式[7]計(jì)算待測組分的RI值，并與美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院(NIST)化學(xué)數(shù)據(jù)庫(http:∥webbook.nist.gov/chemistry/)和NIST14s.lib標(biāo)準(zhǔn)譜庫中RI文獻(xiàn)值進(jìn)行對(duì)比，以保留指數(shù)接近且質(zhì)譜圖相似度較高組分為鑒定結(jié)果，采用峰面積歸一化法計(jì)算各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果列于表1.

表1 輪鐘花根揮發(fā)性成分

表1(續(xù))

由表1可知：輪鐘花根的揮發(fā)性成分共確定76種化合物，其中水蒸氣蒸餾法、索氏提取法和超聲輔助萃取法各確定24，45，39種化合物，分別占所提取揮發(fā)性成分的87.04%，95.06%，98.98%. 三種提取方法檢測出的相同成分僅3種，分別為棕櫚酸、亞油酸以及正二十九烷.

由表1還可以看出：水蒸氣蒸餾提取物揮發(fā)性組分中質(zhì)量分?jǐn)?shù)在3%以上的有7種，總質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)64.21%.其中，亞油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高(22.67%)，其次為Butyl 9,12,15-octadecatrienoate(15.88%)、丙烯酸-2,3-環(huán)氧丙酯十八烯酸(6.22%)、棕櫚酸(6.13%)、反油酸(5.33%)、Tricyclo[20.8.0.0(7,16)]triacontane, 1(22),7(16)-diepoxy(4.88%)、1-iodo-triacontane (3.1%).索氏提取物揮發(fā)性組分中質(zhì)量分?jǐn)?shù)在3%以上的有7種，總質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)48.86%.其中，亞油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高(18.25%)，其次為棕櫚酸(9.92%)、角鯊烯(5.86%)、油酸(4.7%)、三十一烷(3.48%)、維生素E(3.4%)、二十五烷(3.25%).超聲提取物揮發(fā)性組分中質(zhì)量分?jǐn)?shù)在3%以上的有9種，總質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)78.98%.其中，亞油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高(21.6%)，其次為植物甾醇(19.81%)、棕櫚酸(11.88%)、反油酸(6.42%)、維生素E(4.74%)、硬脂酸(4.43%)、亞油酸乙酯(3.47%)、環(huán)阿屯醇(3.41%)、二十酸(3.2%).由此可見，輪鐘花根的揮發(fā)性成分以酸類、烴類、酯類和醇類為主.

4 結(jié)語

筆者采用水蒸氣蒸餾法、索氏提取法和超聲輔助萃取法提取了輪鐘花根揮發(fā)性成分，因三種方法提取原理不一樣，所提取的揮發(fā)性成分種類及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)有一定的差異.水蒸氣蒸餾法操作簡單、成本低，超聲輔助萃取法提取時(shí)間短，能夠避免對(duì)熱不穩(wěn)定成分的破壞[8].在輪鐘花根的揮發(fā)性成分中，索氏法提取的種類最多，水蒸氣法提取的種類最少.同時(shí)利用三種方法提取輪鐘花根揮發(fā)性成分，并結(jié)合保留指數(shù)進(jìn)行定性分析，可以得到更全面和更準(zhǔn)確結(jié)果.

在三種方法的提取物中，酸類化合物亞油酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都是最高的.亞油酸作為人體必需的脂肪酸和重要的多不飽和脂肪酸，日常需求極高，具有抗粥狀動(dòng)脈硬化和增強(qiáng)肌體免疫能力等作用[9].同時(shí)，揮發(fā)性成分中還含有大量的植物甾醇，在超聲法提取物中，植物甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)就達(dá)19.81%.植物甾醇是一種天然甾體化合物，是植物細(xì)胞膜的重要組成部分，在植物油中分布較多，具有降低膽固醇、抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用[10-11].另一重要成分二十八烷醇，被認(rèn)為是一種天然的高級(jí)醇，具有抗疲勞、促進(jìn)新陳代謝和抗炎等多種生理功能[12-14].這都充分說明，輪鐘花作為傳統(tǒng)的藥用植物，具有不可忽視的新藥開發(fā)價(jià)值.近年來，人們對(duì)輪鐘花的開發(fā)利用日益重視，云南曲靖、湖南保靖等地已開始人工種植，以其果實(shí)銷售于市場，其根產(chǎn)量也必然會(huì)有所增加，測定根中的揮發(fā)性成分，對(duì)闡釋其藥效物質(zhì)和資源的綜合開發(fā)具有重要現(xiàn)實(shí)意義.