miRNA-34a、SIRT6對老齡小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡的影響及機制

吉楊松，饒 澄，龍依琳，謝天宏，王世飛

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉科，貴州 遵義 563099)

耳聾是常見疾病，發(fā)病機制多與聽覺皮層神經(jīng)有關(guān)[1]，聽覺皮層神經(jīng)不僅可以接收聽覺刺激，也可以處理早期的多感覺會聚，獼猴聽覺皮層神經(jīng)元對皮膚刺激也可產(chǎn)生反應(yīng)，提示聽覺皮層神經(jīng)元受損引起的耳聾機制可能更為復(fù)雜。細胞凋亡尤其是神經(jīng)元細胞的凋亡往往是不可逆的，聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡一旦發(fā)生，引起持續(xù)性的聽力下降，最終導(dǎo)致耳聾。給患者及其家屬帶來極大痛苦，也給社會帶來較大的經(jīng)濟負擔(dān)。增齡性聾(Age-related hearing loss,AHL)是指隨著年齡的增長而出現(xiàn)的雙耳對稱、緩慢進行性的感音神經(jīng)性聽力減退[2]。隨著我國人口老齡化的加劇，AHL的發(fā)病率呈逐年急劇增漲趨勢，需予以高度重視，AHL的致病因素復(fù)雜，國內(nèi)外近年來研究提示氧化應(yīng)激、線粒體突變、細胞凋亡、炎癥等多種途徑都參與了AHL的發(fā)生發(fā)展，并且各種途徑相互影響。因此，進一步明確AHL機制對老年性耳聾的進行預(yù)防、早期診斷、個性化治療及聽力言語康復(fù)具有重要意義。

本研究觀察敲除了miRNA-34a或SIRT6基因的老齡小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡的差別以及對其聽覺皮層神經(jīng)元中B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)的x蛋白(B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8(Cysteine aspartic protease8，Caspase8)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cysteine aspartic protease3，Caspase3)表達的影響，以期探討miRNA-34a、SIRT6對老齡小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡的作用機制及相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動物 miRNA-34a基因敲除小鼠10只，SIRT6基因敲除小鼠10只，野生型小鼠10只，上述小鼠來源于實驗動物均由南京大學(xué)模式動物研究所提供，按要求飼養(yǎng)于本單位實驗動物中心，喂養(yǎng)至16月齡并成活。獲遵義醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準。

1.2 藥品及試劑 Bcl-2單克隆抗體、Bax單克隆抗體、Caspase8單克隆抗體、Caspase3單克隆抗體均購于武漢博士德生物有限公司。轉(zhuǎn)移緩沖液、細胞裂解液、Bradford蛋白濃度測定試劑盒均購自美國R&D systems公司。

1.3 器材 -80 ℃冰箱(中科美菱，DW-HL388)；電子天平(民橋，F(xiàn)A-N)；超凈工作臺(北京亞泰隆，YT-CJ-2NB)；臺式冷凍離心機(湘儀，TGL-16)；熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS，IX51)；恒溫水浴箱(J-MAX，HH-2)；搖床(其林貝爾，TS-92)；顯微鏡(奧林巴斯，CX41-72C02)。

1.4 方法

1.4.1 動物分組 miRNA-34a基因敲除小鼠為miRNA-34a敲除組，SIRT6基因敲除小鼠為SIRT6敲除組，野生型小鼠為對照組，每組均為10只動物。

1.4.2 取材 喂養(yǎng)達16月齡后，腹腔注射0.1%戊巴比妥充分麻醉，斷頭后，從枕骨大孔處進入，用止血鉗將顱骨一片一片剝離，剝開頭頂上的顱骨后，就可用玻璃分針將整個腦組織輕輕掏出。取出后在冰上分離皮層,按小鼠大腦功能定位分區(qū)選擇A1區(qū)(聽覺皮層)。立即取出小鼠雙側(cè)聽覺皮層放入4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋、切片，留待作TUNEL檢測及免疫組化檢測。

1.4.3 TUNEL法檢測各組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡 TUNEL染色后，在顯微鏡下觀察各組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡情況，計算凋亡指數(shù)。

1.4.4 免疫組化檢測各組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡相關(guān)基因表達情況 將石蠟切片脫蠟后，在磷酸鹽緩沖液中沖洗3次，每次5分鐘，室溫孵育10 min后以蒸餾水沖洗3次，滴加Bcl-2、Bax、Caspase8、Caspase3單克隆抗體，室溫孵育2 h，以磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次2 min，滴加一抗后室溫孵育1 h，再以磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次2分鐘，滴加二抗后室溫孵育30 min，顯色劑顯色，自來水充分沖洗，復(fù)染，封片。在高倍顯微鏡下隨機選擇5個視野用于圖像分析，以平均積分光密度表示其表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡指數(shù)結(jié)果 miRNA-34a敲除組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡指數(shù)與SIRT6敲除組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，miRNA-34a敲除組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，SIRT6敲除組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖1)。

*：與SIRT6敲除組相比，P<0.05。圖1 各組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡指數(shù)

2.2 各組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡相關(guān)基因表達結(jié)果 miRNA-34a敲除組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元抑凋亡基因Bcl-2表達量與SIRT6敲除組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，miRNA-34a敲除組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，SIRT6敲除組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；miRNA-34a敲除組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元促凋亡基因Bax、Caspase8、Caspase3表達量與SIRT6組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，miRNA-34a敲除組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，SIRT6敲除組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖2)。

*：與SIRT6敲除組相比，P<0.05。圖2 各組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡因子表達比較

2.3 miRNA-34a與SIRT6相關(guān)性結(jié)果 對miRNA-34a敲除組與SIRT6敲除組老齡小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡指數(shù)行相關(guān)性分析，兩組呈負相關(guān)(r=0.629，P<0.05)。

3 討論

聽覺皮層神經(jīng)還可會聚動物的選擇和預(yù)期的報酬大小，對聲音的獎勵期望和選擇相關(guān)活動的影響主要在聽覺皮層的紋狀體后尾中[3]，將特定選擇的信息與整個聽覺皮質(zhì)層神經(jīng)元途徑的獎勵信號相結(jié)合，可能有助于聲音驅(qū)動行為的適應(yīng)[4]。電生理研究表明，聽覺皮層神經(jīng)元還可編碼聲音刺激的時間結(jié)構(gòu)，選擇性的關(guān)注一種聲音而忽略其他聲音刺激[5]，本研究未能對miRNA-34a與SIRT6基因敲除老齡小鼠進行各種聲音刺激，因此無法確定小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞不同凋亡情況與不同聲音刺激的相關(guān)性，今后的研究的中如能進行相關(guān)研究，則有助于了解聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡與神經(jīng)元對聲音刺激的定量改變，有利于聽覺皮層神經(jīng)元的保護研究。

增齡性聾(Age-related hearing loss,AHL)是指隨著年齡的增長而出現(xiàn)的雙耳對稱、緩慢進行性的感音神經(jīng)性聽力減退。隨著我國人口老齡化的加劇，AHL的發(fā)病率呈逐年急劇增漲趨勢，需予以高度重視，AHL的致病因素復(fù)雜，國內(nèi)外近年來研究提示氧化應(yīng)激、線粒體突變、細胞凋亡等多種途徑都參與了AHL的發(fā)生發(fā)展，并且各種途徑相互影響。中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育在不同的發(fā)育時期神經(jīng)炎癥相關(guān)因子子存在差異[6]，因此炎癥也在參與了AHL的進程。

MicroRNA(miRNA)是一組內(nèi)源性非編碼RNA(長度為22nt)，可通過與特定mRNA的3'-非翻譯區(qū)(3'-UTR)完全或部分互補來誘導(dǎo)靶基因沉默，以序列特異性方式參與轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)控，是重要的基因調(diào)節(jié)劑，參與到多種細胞過程[7]。miRNA-34a是一種較為保守的miRNA，通常作為癌癥的生物標記物，其介導(dǎo)癌癥細胞多與細胞增殖、細胞凋亡等相關(guān)。miRNA-34a在腦組織中主要通過介導(dǎo)細胞凋亡因子干預(yù)細胞生物過程，對miRNA的生理學(xué)和與疾病相關(guān)的機制的更多了解可能有助于開發(fā)診斷和治療各種疾病的新策略。miRNA有望成為神經(jīng)退行性疾病早期診治及病情評估的新思路和新方法[8]。

SIRT6是Sirtuin NAD+依賴性酶家族的成員，既往對長壽基因SIRT1研究較深入，SIRT1基因維持細胞染色質(zhì)沉默，保護細胞應(yīng)對氧化損傷[8]，其活性形式可與抑癌基因 P53 結(jié)合，參與 P53 介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)[9]，影響多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展及機體衰老進程的。目前另一長壽基因SIRT6逐漸被人們重視，因其在染色質(zhì)信號傳導(dǎo)和基因組維持中發(fā)揮重要作用。且SIRT6可以防止與衰老相關(guān)的疾病發(fā)生，甚至包括代謝疾病和癌癥。近年來的研究表明，SIRT6是一種復(fù)雜的酶，具有多種底物和催化活性，可介導(dǎo)多種細胞凋亡途徑，發(fā)揮抑制細胞凋亡作用[10]。SIRT6是一種營養(yǎng)傳感器和組蛋白脫乙酰基酶，SIRT6的缺失會導(dǎo)致其下游凋亡基因過度乙酰化，驅(qū)動凋亡因子表達[11]。SIRT6的下調(diào)可以模擬miRNA-34a，發(fā)揮促進細胞凋亡作用。

SIRT6能夠?qū)?PARP1、NF-κB 以及Hif-1α這三個轉(zhuǎn)錄因子在組蛋白上進行去乙?；鸬秸{(diào)控作用，使它們在參與其各自炎癥反應(yīng)、下游 DNA的損傷修復(fù)以及調(diào)控與糖類、脂類等能量代謝相關(guān)酶的表達或功能方面表現(xiàn)出有利于機體自身的效應(yīng)。生物體之所以能在演變過程 中維持基因組結(jié)構(gòu)與功能的相對穩(wěn)定，也許正是通過減少炎癥因子對機體的不良作用，減少DNA 的損傷，以及提高與能量代謝有關(guān)酶的正常生理活動，以達到改善能量代謝功能低下與紊亂狀態(tài)，從而顯現(xiàn)出延緩衰老的效應(yīng)。近年國內(nèi)有學(xué)者研究顯示，miR-34a在“老年”的年齡相關(guān)性聾模型C57BL/6小鼠聽皮層組織中高表達[12],SIRT6是一個理想的“長壽因子”，如何調(diào)控SIRT6，可能成為未來研究人類抗衰老及老年性疾病的關(guān)鍵點。

Bcl-2基因家族成員因含有不同Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域而分別發(fā)揮抗凋亡與促凋亡活性，Bcl-2含有完整的4個同源結(jié)構(gòu)域，可發(fā)揮抗凋亡活性，聽覺皮層神經(jīng)元細胞中，Bcl-2是miRNA-34a的直接靶標，可通過抑制Bcl-2表達，促進細胞凋亡[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，敲除miRNA-34a基因小鼠的聽覺皮層神經(jīng)元細胞中Bcl-2表達增高，敲除SIRT6基因小鼠的聽覺皮層神經(jīng)元細胞中Bcl-2表達降低，兩組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明miRNA-34a與SIRT6均可調(diào)控Bcl-2表達，進而調(diào)控聽覺皮層神經(jīng)元細胞的凋亡。

Bax是線粒體凋亡途徑的主要效應(yīng)基因，線粒體蛋白可與Bax復(fù)合，在缺氧時，Bax表達增高，引起細胞變性，進而發(fā)生凋亡。本研究對各組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞中Bax進行了檢測，發(fā)現(xiàn)miRNA-34a敲除組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞中Bax表達降低，SIRT6敲除組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞中Bax表達增高，兩組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明敲除SIRT6敲除可引起小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡，而這種凋亡的發(fā)生可能與缺氧相關(guān)，敲除miRNA-34a可抑制小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡，表明miRNA-34a可促進聽覺皮層神經(jīng)元凋亡、而SIRT6可抑制聽覺皮層神經(jīng)元凋亡，但二者對內(nèi)耳聽毛細胞的凋亡中的作用以及介導(dǎo)細胞生物過程的機制復(fù)雜，仍需深入研究。

外源性細胞凋亡途徑是細胞凋亡的主要途徑，以Caspase8為起始基因，Caspase8表達增高也可引起炎癥反應(yīng)，促進細胞炎癥因子表達，誘導(dǎo)細胞變性，從而發(fā)生凋亡，凋亡又可引起Caspase8過表達，形成惡性循環(huán)。因此，Caspase8過表達通常被認為是細胞凋亡的開始。此外，Caspase8也可可抑制RIPK3和MLKL介導(dǎo)的壞死性壞死，即使是失活的Caspase8也能引起小鼠胚胎致死。本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-34a敲除組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞中Caspase8表達降低，SIRT6敲除組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞中Caspase8表達增高，兩組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明miRNA-34a與SIRT6均參與調(diào)控外源性細胞凋亡途徑的發(fā)生。Caspase3是多種細胞凋亡途徑的最下游基因，Caspase3表達增高則可說明凋亡被執(zhí)行。本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-34a敲除組與SIRT6敲除組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞中Caspase3表達相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明敲除miRNA-34a與SIRT6基因后，小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞發(fā)生凋亡的情況有所不同，miRNA-34a可促進聽覺皮層神經(jīng)元凋亡、而SIRT6可抑制聽覺皮層神經(jīng)元凋亡。

近年來miRNA-34a與SIRT6在其他組織器官中的相關(guān)性研究較多，多數(shù)學(xué)者發(fā)現(xiàn)miRNA-34a與SIRT6在細胞凋亡中的作用負相關(guān)[14]，但在聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡中的作用罕見報道。本研究對miRNA-34a組與SIRT6在老齡小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡指數(shù)的相關(guān)性研究表明，兩者呈負相關(guān)，其中miRNA-34a促使小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡，SIRT6抑制小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡，二者在老齡小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡中的作用負相關(guān)，可通過敲除miRNA-34a或增加SIRT6阻止小鼠聽覺皮層神經(jīng)元的凋亡。

綜上所述，敲除miRNA-34a可以抑制老齡小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡，敲除SIRT6可以促進老齡小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡，兩者在調(diào)控老

齡小鼠聽覺皮層神經(jīng)元凋亡中負相關(guān)，其作用途徑可能與Bcl-2抗凋亡作用相關(guān)，也可能與線粒體凋亡途徑、外源性細胞凋亡途徑相關(guān)。miRNA-34a與SIRT6可能是治療聽覺皮層神經(jīng)元損傷及老年性聾的新靶點。