湖南龍山不同海拔中華蜜蜂種群遺傳多樣性的微衛(wèi)星DNA分析

徐 浩,陳孝梅,藺哲廣,吉 挺

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225009)

中華蜜蜂Apisceranacerana(簡稱中蜂)，作為東方蜜蜂Apiscerana的指名亞種，廣泛分布于除新疆以外的全國各地(國家畜禽遺傳資源委員會(huì),2011)。中華蜜蜂資源評(píng)價(jià)與保護(hù)研究對(duì)維持我國生態(tài)系統(tǒng)平衡起著關(guān)鍵作用，對(duì)保持生物多樣性具有重要的意義。近年來我國中華蜜蜂遺傳資源在諸多領(lǐng)域開展了大量研究，而在遺傳資源中遺傳多樣性是衡量物種適應(yīng)外界環(huán)境變化能力，反映物種進(jìn)化潛力的重要指標(biāo)，同時(shí)也是開展遺傳育種工作的的重要依據(jù)(陳靈芝和馬克平,2001)。龍山縣屬于湖南省西北部，地處云貴高原東北側(cè)與鄂西山地西南端結(jié)合部，武陵山脈斜貫全境，地勢(shì)北高南低，嶺谷相間、高差懸殊，氣候溫暖濕潤，冬少嚴(yán)寒，夏少酷暑，植被豐茂，自然洞穴多，適宜多種動(dòng)物繁殖生長。得天獨(dú)厚的自然環(huán)境使得蜜蜂資源豐富，掌握當(dāng)?shù)刂腥A蜜蜂遺傳資源概況以及合理保護(hù)與利用顯得尤為重要。

微衛(wèi)星DNA (microsatellite DNA)，又稱簡單串聯(lián)重復(fù)序列(simple sequence repeat,SSR)，由微衛(wèi)星核心序列及其兩端的側(cè)翼序列兩部分組成(Vaimanetal.,1995)，具有數(shù)量多、分布范圍廣、呈共顯性遺傳、多態(tài)性豐富和檢測(cè)方便等特點(diǎn)。目前微衛(wèi)星標(biāo)記在遺傳學(xué)中的應(yīng)用，特別是在群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性研究方面應(yīng)用廣泛(吉挺等,2007)。前人運(yùn)用微衛(wèi)星DNA遺傳標(biāo)記的方法已經(jīng)對(duì)吉林長白山地區(qū)(于瀛龍等,2013)、江蘇太湖地區(qū)(吉挺等,2014)、青藏高原地區(qū)(周丹銀等,2019)、秦巴山區(qū)(郭慧萍等,2016)、海南(徐新建等,2013)、沂蒙山(郗學(xué)鵬等,2018)等地區(qū)的東方蜜蜂進(jìn)行了種群遺傳多樣性分析。以前由于采樣地點(diǎn)的限制，研究東方蜜蜂種群遺傳多樣性的樣品都是分散在各地，而對(duì)于同一地區(qū)不同海拔樣本的微衛(wèi)星標(biāo)記分析遺傳多樣性的研究還沒有開展，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及山區(qū)道路的順暢，對(duì)于同一地區(qū)不同海拔的樣本采集研究很有必要。

已有研究發(fā)現(xiàn)在中國云南省，海拔高于2 000 m的中華蜜蜂種群比低地種群個(gè)體體積更大、體色更黑、體毛更長(Pereboom and Biesmeijer,2003;羅林娟和譚墾,2008)，這些形態(tài)上的變化可能代表著種群對(duì)生境的適應(yīng)，致使基因發(fā)生變化，從而影響種群遺傳多樣性。從海拔因素研究種群遺傳多樣性，對(duì)研究種群進(jìn)化，分析遺傳結(jié)構(gòu)具有重要意義，同時(shí)也可驗(yàn)證種群適應(yīng)環(huán)境使得基因組區(qū)域改變，能否影響種群遺傳多樣性。本研究利用11對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記引物對(duì)武陵山區(qū)湖南省龍山縣區(qū)域兩個(gè)不同海拔總計(jì)60群中華蜜蜂進(jìn)行微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，分析遺傳多樣性水平，探索海拔因素對(duì)蜜蜂遺傳多樣性的影響，為武陵山區(qū)蜜蜂遺傳資源的保護(hù)與利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

采集位于湖南省湘西土家族苗族自治州龍山縣大安鄉(xiāng)兩個(gè)不同海拔(1 080和665 m)的中華蜜蜂各30群(表1)，所采蜜蜂均為當(dāng)?shù)亻L期飼養(yǎng)的中華蜜蜂，每個(gè)蜂群采集成年工蜂10～20頭，保存于75%無水乙醇中。

1.2 主要試劑和儀器

血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(天根)，TaKaRa TaqTM(TaKaRa)，用于制作瓊脂糖凝膠的Agarose-Molecular Biology Grade(Biofroxx)，MASTERCYCL基因擴(kuò)增儀(Eppendorf)，微量紫外可見分光光度計(jì)(NanoDrop ND-1000)，5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf)，低速小型離心機(jī)(Sigma)，XW-80A漩渦振蕩器(IKA)，DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.3 微衛(wèi)星標(biāo)記引物PCR擴(kuò)增中華蜜蜂基因組DNA

本研究參考陳孝梅等(2019)設(shè)定的中華蜜蜂微衛(wèi)星引物，從中選擇了11對(duì)擴(kuò)增效果較好的微衛(wèi)星引物并設(shè)溫度梯度摸索退火溫度，具體引物信息見表2。

表2 引物信息Table 2 Primer information

從每群10～20頭中華蜜蜂成年工蜂隨機(jī)取1頭，采集其頭胸部，參照吉挺(2009)建立的方法提取DNA，用微量紫外分光光度計(jì)(NanoDrop ND-1000)測(cè)定其濃度，-20℃保存。PCR反應(yīng)體系(20 μL):10×Buffer 2.0 μL,dNTPs (10 mmol/L) 2.0 μL,上下游引物(10 pmol/μL)各1.0 μL,Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.2 μL,DNA模板(100 ng/μL) 1.0 μL,超純水12.8 μL。PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,53.8～63.9℃(具體見表2)退火50 s,72℃延伸50 s,30個(gè)循環(huán);72℃再延伸10 min,4℃保存。配制2%瓊脂糖凝膠80 mL，加入3 μL核酸染色劑，點(diǎn)樣6 μL,120 V電泳30 min，檢查產(chǎn)物的有無。

1.4 PCR產(chǎn)物STR分型測(cè)序

PCR熒光產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行STR分型測(cè)序，通過GeneMapper4.0軟件生成圖譜，從圖譜中讀取片段長度、峰值和峰面積，并從中分辨出純合子或雜合子(純合子：單峰；雜合子：雙蜂)，繪制出的圖表用于指標(biāo)分析。

1.5 種群遺傳多樣性分析

通過Excel Microsatellite-Toolkit軟件計(jì)算每個(gè)群體各基因座的優(yōu)勢(shì)等位基因頻率(dominant allele frequency,Pi)、期望雜合度(expected heterozygosity,He)和多態(tài)信息含量(polymorphism information content,PIC)(Park S,2001)。根據(jù)FSTAT程序(Goudet,1995)計(jì)算群內(nèi)近交系數(shù)(inbreeding coefficient,Fis)。用SPSS 25.0軟件分析兩個(gè)群體間Pi,He,PIC和Fis的差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分型結(jié)果

龍山縣高海拔(1 080 m)低海拔(665 m)中華蜜蜂種群中11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)共檢測(cè)到88個(gè)等位基因，各位點(diǎn)遺傳變異程度不等，單個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到2～12個(gè)等位基因，其中高海拔種群G中平均等位基因數(shù)為8.2，低海拔種群D中平均等位基因數(shù)為7.8，高海拔地區(qū)種群比低海拔地區(qū)種群等位基因數(shù)略高。

中華蜜蜂高海拔種群個(gè)體G13在BI299位點(diǎn)核心序列相差4 bp，表現(xiàn)為雙峰，為雜合子，基因型為146/150(圖1:A)；D16在A028位點(diǎn)核心序列表現(xiàn)為單峰，為純合子，基因型為110(圖1:B)。二者雜峰污染較少，擴(kuò)增效果良好。從分型結(jié)果來看高低海拔種群在A088和AG005C兩個(gè)位點(diǎn)均為純合子，11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中低海拔種群的純合子數(shù)比高海拔的純合子數(shù)略多，但無顯著性差異(P=0.724>0.05)，具體見表3。

圖1 湖南省龍山縣部分中華蜜蜂種群個(gè)體在微衛(wèi)星位點(diǎn)上的STR分型結(jié)果Fig.1 STR typing results at microsatellite loci for some individuals of Apis cerana cerana populations in Longshan County,Hunan ProvinceA:G13蜂群個(gè)體在微衛(wèi)星BI299位點(diǎn)的STR分型結(jié)果STR typing result for individuals of G13 colony at the microsatellite site BI299;B:D16蜂群個(gè)體在微衛(wèi)星A028位點(diǎn)的STR分型結(jié)果STR typing result for individuals of D16 colony at the microsatellite site A028.

表3 湖南省龍山縣高低海拔中華蜜蜂種群微衛(wèi)星位點(diǎn)純合子與雜合子分布情況Table 3 Distribution of homozygotes and heterozygotes of microsatellite loci in high and low altitude populations of Apis cerana cerana in Longshan County,Hunan Province

2.2 高低海拔中華蜜蜂種群Pi比較

本研究采用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，利用one-way ANOVA分析方法對(duì)G和D兩個(gè)群體的Pi進(jìn)行處理，分析龍山縣高低海拔的中華蜜蜂種群遺傳多樣性。結(jié)果表明，龍山高海拔和低海拔的中華蜜蜂種群的遺傳多樣性均較豐富，兩者均具有較高的遺傳多樣性，G和D兩個(gè)群體在這11個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記檢測(cè)出的優(yōu)勢(shì)等位基因上無顯著性差異(PPi=0.721>0.05)(表4)。

表4 湖南省龍山縣高低海拔中華蜜蜂種群在11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)等位基因及其頻率Table 4 Dominant alleles and their frequencies in 11 microsatellite loci of high and low altitude populations of Apis cerana cerana in Longshan County,Hunan Province

2.3 高低海拔中華蜜蜂種群He,PIC和Fis比較

中華蜜蜂高海拔種群的He,PIC和Fis平均值分別為0.593,0.556和0.121，均略低于低海拔種群的0.631,0.587和0.187，對(duì)兩個(gè)不同種群的He,PIC和Fis進(jìn)行one-way ANOVA分析結(jié)果顯示，兩個(gè)種群間He,PIC和Fis均無顯著性差異(PHe=0.759>0.05,PPIC=0.802>0.05,PFis=0.767>0.05)(表5)。

表5 湖南省龍山縣高低海拔中華蜜蜂種群在11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的PIC,Fis和He的比較Table 5 Comparison of PIC,Fis and He in 11 microsatellite loci of high and low altitude populations of Apis cerana cerana in Longshan County,Hunan Province

本研究中，龍山縣高海拔與低海拔中蜂種群的PIC平均值均略高于0.5(PICG=0.556,PICD=0.587)，位點(diǎn)為高度多態(tài)性位點(diǎn)，且低海拔中蜂種群的PIC值比高海拔的略高。兩個(gè)種群的He平均值都較高(HeG=0.593,HeD=0.631)，反映了二者都有著相對(duì)豐富的遺傳多樣性。兩個(gè)種群的Fis平均值均大于0(FisG=0.121,FisD=0.187)。

3 討論

優(yōu)勢(shì)等位基因頻率(Pi)是指一個(gè)群體中某一基因?qū)ζ涞任换虻南鄬?duì)比率(張翠霞,2008)。優(yōu)勢(shì)等位基因，即該物種中最原始、最保守的等位基因，其余等位基因是進(jìn)化過程中由該等位基因突變形成，因此微衛(wèi)星的多態(tài)性能夠反映物種的進(jìn)化歷史(鐘金城等,2006)。本研究中龍山高海拔和低海拔的中華蜜蜂種群在這11個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記檢測(cè)出的優(yōu)勢(shì)等位基因上無顯著性差異(PPi=0.721>0.05)(表4)，表明龍山縣地區(qū)高低海拔的中華蜜蜂種群遺傳分化較小，而海拔因素不能直接影響其多樣性程度。

群體內(nèi)近交系數(shù)(Fis)常用于衡量群體內(nèi)偏離哈代-溫伯格平衡的程度，當(dāng)Fis=0時(shí)，表示配對(duì)方式為隨機(jī)交配；當(dāng)Fis>0時(shí)，表示群體內(nèi)發(fā)生了近親交配；當(dāng)Fis<0時(shí)，表示異型交配(楊香娣,2016)。本研究中龍山縣中華蜜蜂高海拔種群與低海拔種群Fis平均值均大于0(FisG=0.121,FisD=0.187)(表5)，說明兩個(gè)種群中均出現(xiàn)近親交配的現(xiàn)象，這與當(dāng)?shù)丨h(huán)境密切相關(guān)，因?yàn)楦叩秃０蔚闹腥A蜜蜂群體均分布在武陵山脈中，環(huán)境較為封閉，中蜂近親交配在所難免，需要引起關(guān)注并采取保護(hù)種群的措施。

在微衛(wèi)星數(shù)據(jù)分析中常用的多樣性分析指標(biāo)，其中很重要的一個(gè)是基于等位基因分布的雜合度分析(Nei,1987;Leberg,2002)。通常群體中微衛(wèi)星座位雜合子的比例用雜合度(H)來表示，即某一基因座上等位基因間雜合的程度(王利剛,2006)。群體平均雜合度以0.5為界，高于0.5表明該群體擁有豐富的遺傳多樣性；平均雜合度低于0.5時(shí)，表明該群體遺傳多樣性較低，群體受到高強(qiáng)度的選擇。觀察雜合度(Ho)容易受樣本大小的影響，一般不采用，而期望雜合度(He)更能夠反映群體的遺傳多樣性(包文斌等,2007)。本研究中，中華蜜蜂高海拔和低海拔兩個(gè)種群的He都較高(HeG=0.593,HeD=0.631)(表5)，反映了二者都有著相對(duì)豐富的遺傳多樣性。種群遺傳多樣性越高，種群適應(yīng)性越強(qiáng)。龍山縣高海拔中蜂種群與低海拔種群均具有較高的遺傳多樣性，遺傳多樣性高的原因：其一，地處武陵山脈，植被豐茂，氣候溫暖濕潤，資源相當(dāng)豐富，適宜中蜂種群生存，能夠維持較高的種群遺傳多樣性；其二，通過實(shí)地采樣考察，隨著精準(zhǔn)扶貧，政府鼓勵(lì)蜂農(nóng)飼養(yǎng)中蜂，導(dǎo)致外來蜂群涌入當(dāng)?shù)?，外來蜂群等位基因的滲入也是當(dāng)?shù)剡z傳多樣性高的原因之一。

多態(tài)信息含量(PIC)是衡量群體內(nèi)遺傳變異程度的指標(biāo)，其數(shù)值的高低與群體內(nèi)遺傳變異的大小成反比，數(shù)值高，遺傳變異則大，反之則群體內(nèi)遺傳變異就小(廖信軍等,2006)。當(dāng)PIC>0.5時(shí)，該位點(diǎn)為高度多態(tài)位點(diǎn)；當(dāng)0.25

本研究利用11對(duì)熒光標(biāo)記微衛(wèi)星引物的分析結(jié)果表明，龍山縣高海拔與低海拔中蜂種群之間的Pi,He,PIC和Fis均無顯著性差異，說明在龍山縣高海拔與低海拔對(duì)中蜂種群遺傳多樣性無明顯影響。生活在不同海拔的中蜂種群，為了適應(yīng)環(huán)境，致使基因組區(qū)域發(fā)生改變(Montero-Mendieta,2019)，但本研究得出結(jié)論種群遺傳多樣性無明顯變化，即中蜂種群為適應(yīng)海拔因素的變化使得基因組區(qū)域發(fā)生改變，也不會(huì)在很大程度上影響中蜂種群的遺傳多樣性。同時(shí)Montero-Mendieta(2019)中高海拔中蜂種群等位基因數(shù)相比于低海拔種群的等位基因數(shù)略高與本研究結(jié)果一致，多的等位基因數(shù)可能與高海拔環(huán)境的適應(yīng)相關(guān)，對(duì)高低海拔適應(yīng)性機(jī)制及相關(guān)基因的研究有待諸多學(xué)者進(jìn)一步的研究。