轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因玉米Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白表達及對亞洲玉米螟的室內(nèi)殺蟲效果

劉曉貝,白樹雄,王振營,王月琴,王勤英,何康來,*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學植物保護學院,河北保定 071000; 2.中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京 100193)

亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis是我國玉米生產(chǎn)上的重要害蟲。常年為害會導致玉米減產(chǎn)10%左右，大發(fā)生年份可減產(chǎn)30%以上甚至絕產(chǎn)(周大榮,1996;王振營等,2000)。亞洲玉米螟為害亦能夠加重玉米穗腐病的發(fā)生，導致玉米籽粒真菌毒素增加，影響食用安全(宋立秋等,2009)。全生育期有效表達Bt殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米為亞洲玉米螟的防治提供了新途徑(Heetal.,2003;王冬妍等,2004)。截至2018年，全球已有14個國家種植了轉(zhuǎn)基因玉米，種植面積達5 890萬hm2，其中轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米種植面積達550萬hm2。轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米表達的Cry1Ab,Cry1F和Vip3A蛋白是目前國際上商業(yè)化應用最廣泛的用于防治鱗翅目害蟲的Bt殺蟲蛋白。另外，疊加多基因(如MON89034，表達Cry2Ab2+Cry1A.105;Bt11×MIR162,表達Cry1Ab和Vip3A)和聚合多基因(如MON89034×TC1507×MON88017×DAS-59122，表達Cry2Ab2+Cry1A.105,Cry1F,Cry3Bb1和Cry34/35Ab1 Bt蛋白)的抗蟲玉米不僅能防治多種鱗翅目害蟲，還能防治鞘翅目玉米根螢葉甲Diabroticavirgiferavirgifera(ISAAA,2018)。轉(zhuǎn)基因抗蟲作物不僅能夠有效控制靶標害蟲的危害，提高作物產(chǎn)量；還能減少化學農(nóng)藥的使用，降低環(huán)境污染(Sheltonetal.,2001;Carrièreetal.,2003)；同時能為周邊種植非轉(zhuǎn)Bt作物的種植者帶來一定的經(jīng)濟效益(Wuetal.,2008;Hutchisonetal.,2010;Tabashnik,2010)。

長期大面積種植轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米，也會引發(fā)靶標害蟲產(chǎn)生抗性。2007年，在波多黎各，草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda對轉(zhuǎn)cry1F基因玉米TC1507產(chǎn)生抗性(Storeretal.,2012)；2018年，首次在加拿大新斯科舍發(fā)現(xiàn)對Cry1F殺蟲蛋白產(chǎn)生抗性的歐洲玉米螟Ostrinianubilalis種群(Schaafsmaetal.,2019)。雖然我國尚未進行轉(zhuǎn)基因玉米的商業(yè)化種植，但室內(nèi)汰選實驗表明亞洲玉米螟可對Cry1Ab和Cry1Ac等多種殺蟲蛋白產(chǎn)生抗性(Xuetal.,2010;王月琴等,2014;Zhangetal.,2014;Wangetal.,2016;Shabbiretal.,2018)。因此，商業(yè)化推廣某一轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的同時，必須同時實施合理的抗性治理措施，以保障其長期的可持續(xù)利用。轉(zhuǎn)雙基因作物能夠有效延緩抗性的產(chǎn)生，但是目前關于轉(zhuǎn)雙基因玉米對亞洲玉米螟的殺蟲效果缺乏相關報道。因此，本研究首先測定了轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因玉米心葉中Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白的表達量，同時評價了該轉(zhuǎn)基因事件對亞洲玉米螟的室內(nèi)殺蟲效果，以期為轉(zhuǎn)基因玉米的環(huán)境安全評價及靶標害蟲的抗性治理策略提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

亞洲玉米螟室內(nèi)敏感品系(ACB-BtS)：原始種群采自陜西省西安市，在室內(nèi)無瓊脂半人工飼料上連續(xù)飼養(yǎng)多代，飼養(yǎng)過程中未接觸任何的Bt制劑和Bt殺蟲蛋白。

亞洲玉米螟室內(nèi)抗性品系：以ACB-BtS為起始蟲源，在室內(nèi)無瓊脂半人工飼料中分別加入Cry1Ac和Cry1Ab 蛋白進行幼蟲全生育期汰選，分別得到亞洲玉米螟Cry1Ac抗性品系(ACB-AcR)和Cry1Ab抗性品系(ACB-AbR)。目前均已連續(xù)篩選200代以上，Cry1Ac和Cry1Ab抗性品系的抗性倍數(shù)分別達3 500和190倍(Zhangetal.,2017)。

實驗所用亞洲玉米螟品系均在溫度27±1℃，相對濕度70%～80%，光周期16L∶8D的條件下飼養(yǎng)。

1.2 供試玉米

供試玉米為轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030及其非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩紫?49(X249)，均由中國種子集團有限公司生命科學技術中心提供。ZZM030是以親本對照玉米X249為受體材料，插入外源基因cry1Ab/cry1Ac以及epsps所得，同時具有抗蟲和抗草甘膦除草劑的特性(張莉等,2019)。

1.3 轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因玉米心葉中Cry1Ab/Cry1Ac融合殺蟲蛋白表達量測定

Bt-Cry1Ab/Cry1Ac ELISA試劑盒為美國EnvirologixTM公司生產(chǎn)。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定轉(zhuǎn)基因玉米4葉期和8葉期心葉中Cry1Ab/Cry1Ac融合殺蟲蛋白的含量。測定方法同王培等(2012)，具體操作步驟如下：(1)測定開始前讓所有試劑達到室溫平衡；(2)裁剪清洗好的玉米葉片，用250 μL提取緩沖液提取大小為10 mm2的綠色玉米葉片；(3)向96孔酶標板的每個孔中加入50 μL Cry1Ab/Cry1Ac綴合物，之后立即加入50 μL提取緩沖液作為空白對照，加入50 μL蛋白作為陽性對照，加入50 μL樣品提取物到各自孔中，對照和處理分別測定3株和7株，1株為1個生物學重復，每重復測定3次，每孔為1次重復；(4)循環(huán)移動酶標板20～30 s，徹底混合孔內(nèi)液體；(5)用封口膜覆蓋酶標板，防止孔內(nèi)液體蒸發(fā)，并在室溫下孵育1～2 h；(6)孵育后，小心取下覆蓋物，洗板；(7)每孔加入100 μL底物并混合均勻，室溫孵育15 min；(8)每孔加入100 μL終止液并充分混勻，使溶液呈黃色；(9)在酶標儀630 nm處測定吸光值，根據(jù)OD值和標準曲線計算蛋白含量。根據(jù)制樣時所取玉米葉片鮮重計算單位組織鮮重的蛋白含量。

1.4 室內(nèi)生測

轉(zhuǎn)基因玉米葉片中殺蟲蛋白表達量隨葉片生長下降，本試驗采用玉米營養(yǎng)生長階段蛋白表達量相對較低時的葉片進行組織生測。

從田間采集6-8葉期的玉米植株各4～6株帶回室內(nèi)。剝開植株，選取內(nèi)層未展開的幼嫩心葉，先用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗1遍，用濾紙吸去表面水珠后晾干。用無菌剪刀將幼嫩心葉裁剪為長和寬均為1 cm左右大小的葉片，按照每孔1～2片放入24孔細胞培養(yǎng)板中(Corning 3524)。每孔接入1頭待測試品系的初孵幼蟲(孵化后0～12 h)，之后用封膜機將孔口封住，防治幼蟲逃逸。用解剖針在每孔封口膜上扎孔，保證空氣流通。將培養(yǎng)板放置于27±1℃，相對濕度70%～80%，光周期16L∶8D的條件下飼養(yǎng)。試驗共設置6個處理，每個處理為3次重復，每重復為24頭初孵幼蟲。

接蟲后每2 d調(diào)查1次，根據(jù)葉片組織被取食情況隨時添加或更換相同來源的新鮮葉片，并記錄幼蟲存活數(shù)(用毛筆輕觸幼蟲尾部，若幼蟲不動，視為死亡；若單頭存活幼蟲重量<0.1 mg，按死亡計算)。試驗觀察到第6天為止。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用t檢驗檢驗轉(zhuǎn)基因玉米4葉期和8葉期心葉中Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白表達量之間的差異顯著性；不同亞洲玉米螟品系幼蟲分別取食轉(zhuǎn)基因玉米和對照玉米葉片后的存活率間差異顯著性檢驗采用t檢驗，百分數(shù)進行了反正弦轉(zhuǎn)換。當任一處理或?qū)φ账兄貜偷拇婊盥蕿?00%或0時，則不進行統(tǒng)計檢驗。所有統(tǒng)計分析過程采用SPSS 22.0軟件計算。

2 結果

2.1 轉(zhuǎn)基因玉米心葉中殺蟲蛋白表達量

根據(jù)ELISA定量結果，轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030 4葉期和8葉期心葉中Cry1Ab/Cry1Ac融合殺蟲蛋白的表達量分別為10.62±2.00和2.94±1.08 μg/g FW，二者差異顯著(t=3.389,df=12,P=0.005)(圖1)。

圖1 轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因玉米心葉中Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白表達量Fig.1 Expression level of Cry1Ab/Cry1Ac fusion protein in whorl leaves of transgenic cry1Ab/cry1Ac maize圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；柱上不同小寫字母代表經(jīng)t檢驗差異顯著(t=3.389,df=12,P=0.005)。Data in the figure are mean±SE.Different lowercase letters above bars indicate significant differences according to t-test (t=3.389,df=12,P=0.005).

2.2 取食不同玉米心葉后不同亞洲玉米螟品系的存活率

室內(nèi)生測結果(表1)表明：ACB-BtS初孵幼蟲取食轉(zhuǎn)基因玉米ZZM030心葉2 d后的存活率僅為23.6%，4 d后存活率為0，而取食非轉(zhuǎn)基因玉米X249心葉4 d后的幼蟲存活率高達93.1%。ACB-AbR初孵幼蟲取食ZZM030葉片2,4 和6 d后，存活率均顯著低于取食X249對應的存活率；6 d 后有11.1%的個體存活，但存活個體較小，發(fā)育受到嚴重抑制；而取食X249葉片的初孵幼蟲發(fā)育正常，且6 d后的幼蟲存活率高達81.9%。ACB-AcR初孵幼蟲取食不同玉米心葉后的存活率存在顯著差異，6 d后取食ZZM030的存活率僅為12.5%，而取食X249的初孵幼蟲存活率高達77.8%。結果說明，轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030對不同品系的亞洲玉米螟均具有良好的防治效果。

表1 取食不同玉米心葉不同天數(shù)后不同品系亞洲玉米螟初孵幼蟲的存活率(%)Table 1 Survival rates (%) of the neonates of different strains of the Asian corn borer Ostrinia furnacalis fed on the whorl leaves of different maize lines for different days

3 討論

轉(zhuǎn)基因抗蟲作物高劑量表達目的殺蟲蛋白是轉(zhuǎn)基因作物可持續(xù)應用的關鍵。據(jù)報道，靶標害蟲在田間對轉(zhuǎn)基因抗蟲作物產(chǎn)生抗性是由于目的殺蟲蛋白的非高劑量表達。例如，在波多黎各，表達Cry1F殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米TC1507對草地貪夜蛾的防治效果一般，使得田間抗性種群產(chǎn)生，導致該轉(zhuǎn)基因事件被強制召回(Storeretal.,2012)。2009 年，在田間監(jiān)測到玉米根螢葉甲的抗性種群，轉(zhuǎn)基因玉米中Cry3Bb1殺蟲蛋白的非高劑量表達和適合度代價是該靶標害蟲產(chǎn)生抗性的主要原因(Gassmannetal.,2011)。因此，轉(zhuǎn)基因作物中目的殺蟲蛋白表達量的高低將直接影響該作物對于靶標害蟲的防治效果。在玉米心葉期，亞洲玉米螟初孵幼蟲主要為害取食未展開的幼嫩心葉，所以明確玉米心葉中目的殺蟲蛋白的表達量對于轉(zhuǎn)基因玉米的殺蟲效果評價具有重要意義。因此，本研究測定的轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因玉米4葉期和8葉期心葉中Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白的表達量分別為10.62和2.94 μg/g FW(圖1)，該轉(zhuǎn)基因玉米在這兩個時期心葉中殺蟲蛋白表達量均高于中國不同地理種群亞洲玉米螟對Cry1Ab蛋白的敏感基線LC50(0.10～0.81 μg/g)(Heetal.,2005)。生測試驗明確了轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac玉米ZZM030對ACB-BtS品系具有很好的殺蟲效果，4 d后殺蟲效果達到100%。這對于今后轉(zhuǎn)基因玉米的商業(yè)化種植，制定“高劑量”策略延緩抗性的產(chǎn)生具有重要的指導意義。

已有研究表明，室內(nèi)汰選的Cry1Ab抗性品系亞洲玉米螟可在轉(zhuǎn)cry1Ab基因玉米(MON810)的花絲上存活并化蛹(Xuetal.,2010)；也有研究表明，室內(nèi)汰選的Cry1Ac抗性品系亞洲玉米螟對轉(zhuǎn)cry1Ac基因玉米(Zh58Ac)的敏感性降低(Jiangetal.,2016)，在取食轉(zhuǎn)cry1Ac基因玉米(BT799)的花絲、苞葉和籽粒7 d后的存活率為81.3%～97.2%(王月琴等,2014)。這些研究結果均說明亞洲玉米螟有對田間轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米產(chǎn)生抗性的風險。本試驗通過評價轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030對ACB-AbR和ACB-AcR品系的殺蟲效果，進一步明確該轉(zhuǎn)基因玉米對玉米螟的抗性。結果表明：ACB-AcR和ACB-AbR品系在取食轉(zhuǎn)基因玉米ZZM030葉片6 d后雖然仍有少數(shù)存活(表1)，但是存活幼蟲的發(fā)育受到嚴重抑制，表明ACB-AcR和ACB-AbR品系對轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030具有一定的抗性。該研究結果一方面說明轉(zhuǎn)基因玉米的抗蟲性狀為功能顯性，另一方面說明轉(zhuǎn)基因玉米的抗蟲效果可能是玉米自身抗蟲物質(zhì)和Bt殺蟲蛋白相互作用的結果，在歐洲玉米螟Dipel抗性品系中有相似的現(xiàn)象(Huangetal.,2002)。

靶標害蟲對Bt殺蟲蛋白產(chǎn)生抗性是一種生物進化現(xiàn)象，是抗性基因被殺蟲蛋白選擇的結果。適合度指生物在所處環(huán)境中能夠生存并把它的特性遺傳給下一代的相對能力。因此，處在Bt選擇壓下的抗性基因型適合度一般比敏感基因型適合度高，但是，當不接觸Bt殺蟲蛋白時，抗性基因型的適合度一般表現(xiàn)為不利，即適合度劣勢(Tabashnik,1994;郭芳等,2009)。如對Vip3A產(chǎn)生抗性的草地貪夜蛾幼蟲在常規(guī)高粱上的發(fā)育歷期和蛹重顯著低于敏感品系(Chenetal.,2018)。本研究結果表明，同ACB-BtS敏感品系相比，取食非轉(zhuǎn)基因玉米X249相同天數(shù)后ACB-AbR和ACB-AcR兩個抗性品系存活率較低，但與ACB-BtS品系相比無顯著差異(P>0.1)，說明取食常規(guī)玉米時亞洲玉米螟抗性品系不存在適合度劣勢，而在抗性治理過程中，適合度劣勢有利于延緩抗性的產(chǎn)生。