茶園周邊景觀格局對茶小綠葉蟬種群遺傳結構的影響

李金玉,牛東升,陳 杰,尤士駿,*,尤民生,*

(1.福建農(nóng)林大學應用生態(tài)研究所,閩臺作物有害生物生態(tài)防控國家重點實驗室,福州 350002; 2.福建農(nóng)林大學,教育部害蟲生態(tài)防控國際合作聯(lián)合實驗室,福州 350002; 3.福建農(nóng)林大學,農(nóng)業(yè)部閩臺作物有害生物綜合治理重點實驗室,福州 350002)

由于茶樹為多年生常綠木本植物，傳統(tǒng)茶園中的生物群落結構通常比其他作物生態(tài)系統(tǒng)的群落結構復雜，并且在相當長的時間內可以保持動態(tài)平衡(陳李林等,2019)。近年來，隨著茶樹種植面積的持續(xù)增加，茶樹栽培制度也發(fā)生了變化，越來越多地采用集約化經(jīng)營和單一化種植的模式，導致茶園及其周圍的景觀環(huán)境也逐漸趨于簡單化，容易引發(fā)茶園病蟲害的流行和擴散(李樂,2012;周寧寧,2014;陳李林等,2019)。與此同時，大量使用化肥和農(nóng)藥致使茶園生態(tài)平衡日益遭到破壞，引起有害生物特別是刺吸式害蟲的發(fā)生危害不斷加重。

茶小綠葉蟬Empoascaonukii是茶園中分布最廣，為害持續(xù)時間最長，造成損失也最大的頭號害蟲，在我國可造成減產(chǎn)10%～15%，嚴重時減產(chǎn)50%以上(Chenetal.,2019)。有學者提出茶小綠葉蟬是在20世紀60年代侵入茶園后迅速上升為我國茶園害蟲區(qū)系中的頭號害蟲(陳宗懋,1979)，并普遍認為這可能與茶園景觀環(huán)境的簡單化過程以及化肥、農(nóng)藥施用水平的變化有關(李樂,2012;周寧寧,2014;Chenetal.,2019)。因此，在周邊景觀格局分布不同的茶園中對茶小綠葉蟬種群結構差異和擴散特點進行研究有助于理解其發(fā)生機制，進而為茶園景觀合理布局和開展可持續(xù)害蟲治理提供重要的信息。

近20年來，得益于分子技術和地理空間分析的快速發(fā)展，分子水平上的微觀分析手段與景觀生態(tài)學的宏觀統(tǒng)計工具相結合，對于連接景觀環(huán)境與生物種群結構、適應性和遷移擴散過程提供很大的幫助(Storferetal.,2007)。一些學者利用RAPD、線粒體基因序列和微衛(wèi)星分子標記對茶小綠葉蟬不同地理種群進行了分析(李樂,2012;Fuetal.,2014;周寧寧,2014;Zhangetal.,2016,2019)。這些研究的重點大多用于解析不同種群的親緣關系和確認是否屬于相同的優(yōu)勢種，較少通過基因流的估算和基因流格局的分析以獲得其種群遷移、擴散相關的信息，也沒有將這些遺傳結構、基因流和擴散信息與茶園景觀環(huán)境相關聯(lián)，并用于闡明茶小綠葉蟬在不同茶園景觀環(huán)境中的種群分布和擴散特點。本研究以福建省安溪縣為研究區(qū)域，選取了周邊景觀結構和組成不同的18個茶園采集茶小綠葉蟬，基于23個微衛(wèi)星分子標記對這些茶小綠葉蟬種群進行了遺傳結構和基因流格局的分析，探究在周邊景觀格局不同的茶園中茶小綠葉蟬的種群結構差異和擴散特點，為闡明其災變機理、優(yōu)化茶園景觀合理布局方案和害蟲可持續(xù)治理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域選擇和樣本采集

選擇福建省安溪縣作為研究區(qū)域，縣域范圍117°36′～118°17′E,24°50′～25°26′N，全縣總面積3 057.28 km2(稅偉等,2017)。區(qū)域內地勢從西北向東南傾斜，西北部山峰林立，東南部地勢相對平緩，以丘陵山地為主。茶園在全縣區(qū)域內均有分布，但由于明顯的地勢地貌差異，不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的種植模式有明顯差異：在位于南部的西坪等鄉(xiāng)鎮(zhèn)，主要采用單一化和集約化的種植模式，在茶園周圍少見自然和半自然生境或其他作物田；在位于西北部的桃舟和福田等鄉(xiāng)鎮(zhèn)，茶園大都分布于高海拔的山坡上，周圍經(jīng)常會有森林等自然和半自然生境分布；而在位于東部的蓬萊和湖頭等鄉(xiāng)鎮(zhèn)，種植模式則會更多樣化，茶園周圍經(jīng)常會有其他多種作物田的分布(稅偉等,2017)(表1)。

基于以上信息，在研究區(qū)域內選取了周邊景觀格局不同的18個茶園(其中茶樹有多年樹齡)進行研究(表1)，避開選擇新建茶園以避免近期茶苗移植對分析的影響。2018年8月，在選定的每個茶園中，隨機選擇位于其中央的5～10個點(彼此間隔20～100 m)，用掃網(wǎng)法采集至少50頭茶小綠葉蟬成蟲。本研究將來自同一樣點的個體作為一個種群用于后續(xù)的研究和分析。

表1 福建省安溪縣茶小綠葉蟬采樣點信息Table 1 Information of sampling sites of Empoasca onukii in Anxi County,Fujian Province,southeasterm China

1.2 微衛(wèi)星位點基因型檢測

本研究使用天根生化科技(北京)有限公司的微量樣品基因組提取試劑盒，對單頭茶小綠葉蟬進行基因組DNA的提取。為了保證樣品種類的一致性，分析個體在基因組提取之前首先進行初步形態(tài)學鑒定(Qinetal.,2015)，并參照Demichelis等(2010)的COI基因引物以及PCR反應體系和條件對每份基因組樣品進行擴增，將產(chǎn)物序列(經(jīng)ABI 3730XL測序成功)與NCBI中茶小綠葉蟬Empoascaonukii的線粒體全長序列(Liuetal.,2017)進行比對，僅保留可以比對上的樣品用于后續(xù)微衛(wèi)星位點的擴增和分析。

本研究選取23個微衛(wèi)星位點作為分子標記研究茶小綠葉蟬種群遺傳變異，引物序列信息參照Zhang等(2016)和李倩等(2016)(表2)。PCR擴增采用天根生化科技(北京)有限公司的多重PCR擴增試劑盒(KT109)，將4～6對引物組合在同一個體系中進行擴增，反應體系和條件參照其使用說明。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，利用ABI 3730XL測序儀(Applied Biosystems)結合GENEMAPPER 3.2軟件(Applied Biosystems)分析確定其中對應位點的片段長度和識別片段基因型，利用Micro-Checker(Van Oosterhoutetal.,2004)檢測是否存在因為無效等位基因和滑移導致的位點讀取錯誤的問題。最終，我們獲得了來自安溪縣18個樣點的530個個體的微衛(wèi)星基因型數(shù)據(jù)用于后續(xù)種群分析。

表2 本研究中所用的23個微衛(wèi)星位點的引物信息Table 2 Primer information of 23 microsatellite loci in this study

續(xù)表2 Table 2 continued

1.3 景觀格局分析

為了定量化解析茶園周邊景觀格局特征與茶小綠葉蟬種群遺傳信息之間的相關性，從地理數(shù)據(jù)云平臺(http:∥www.gscloud.cn/)下載獲取了2018年國家標準土地利用類型分類(land cover)原始影像圖，其分辨率大約為30 m，包括了6大類國家標準的土地利用類型分類。在該影像圖的基礎上，結合谷歌地球(Google Earth)的投影影像和采樣實地考察的照片資料，把研究區(qū)域內茶園單獨勾繪出來，構建了包含茶園、林地、草地、耕地、水域、建筑和未利用(裸地、巖石等)7個土地利用類型的矢量影像資料。利用該矢量數(shù)據(jù)，我們對研究區(qū)域的景觀組成和結構進行了分析。

使用ArcMap10.5分別生成統(tǒng)計了各采樣點周圍半徑500,1 000,1 500,2 000和2 500 m內各類土地利用類型的面積占比(分析中將水域、建筑和未利用合并為一個無植被的土地利用類型統(tǒng)計)，使用R(R Core Team,2018)中的cor函數(shù)對25個表示景觀組成的變量進行了相關性檢驗，只保留沒有明顯共線性關系(r<0.8)的11個景觀組成因子(表3)。同時，使用R軟件包raster(Hijmans and van Etten,2016)將景觀空間數(shù)據(jù)轉化生成阻力距離曲面的柵格數(shù)據(jù)，以表示不同土地利用類型對茶小綠葉蟬擴散的阻力大小(Chenetal.,2019)，分析獲得代表景觀結構的因子(表3)。此外，使用手持GPS(Garmin GPSMAP? 60CS)定位各采樣點海拔高度和經(jīng)緯度坐標(表1)，并基于經(jīng)緯度信息使用R軟件包geosphere 1.5-10(Hijmansetal.,2017)計算采樣點間地理距離，從而獲得海拔和地理距離的因子(表3)。

表3 本研究中所用的景觀環(huán)境變量信息Table 3 Landscape and environmental variables used in this study

1.4 種群遺傳多樣性分析

利用ARLEQUIN 3.5.2(Excoffier and Lischer,2010)計算各種群期望雜合度(expected heterozygosity,He)和觀察雜合度(observed heterozygosity,Ho)，用FSTAT 2.9.3(Goudet,2001)計算各種群的基因多樣性(gene diversity,DIV)和等位基因豐富度(allelic richness,AR)等遺傳多樣性參數(shù)。

1.5 種群遺傳結構分析

使用STRUCTURE 2.3.4(Pritchardetal.,2000)對18個種群進行貝葉斯聚類分析。選擇R軟件包adegenet 2.0.0(Jombart,2008)中不基于模型假設的DAPC(discriminant analysis of principal components)(Jombartetal.,2010)程序解析個體之間的遺傳關系。

1.6 種群遺傳分化分析

利用R軟件包adegenet 2.0.0中的dist.genpop函數(shù)計算種群間的遺傳距離，包括Nei氏遺傳距離(Nei’s genetic distance)(Nei,1972,1978)和Provesti氏遺傳距離(Provesti’s genetic distance)，并用ARLEQUIN 3.5.2(Excoffier and Lischer,2010)計算種群的遺傳分化指數(shù)(pairwiseFST)和顯著性檢驗P值。

1.7 種群基因流格局分析

使用BAYESASS 3.0.4(Wilson and Rannala,2003)估算樣點之間茶小綠葉蟬種群最近幾代的遷移率(m)，即每個世代中遷移個體在種群中所占的比例。設置程序運行10次，每次進行20 000 000次重復的MCMC搜索(MCMC interaction)，舍棄最初的2 000 000次重復的數(shù)據(jù)，每隔100次采樣一次以確保m值的可靠、準確。

1.8 茶園周邊景觀格局與茶小綠葉蟬種群遺傳的相關性分析

以11個景觀組成因子和3個景觀結構因子以及海拔(elevation)和地理距離(geo)(表3)為解釋變量(explanatory variable)，使用R軟件包ecodist(Goslee and Urban,2007)分析其與茶小綠葉蟬種群的Provesti氏遺傳距離、Nei氏遺傳距離和遺傳分化指數(shù)之間的Mantel相關性。

以16個景觀環(huán)境因子(表3)為解釋變量，以Provesti氏遺傳距離、Nei氏遺傳距離和遺傳分化值為響應變量(response variable)，使用R軟件包ecodist的MRM函數(shù)進行距離矩陣多元回歸(multiple regression on distance matrices,MRM)分析 (Wang,2013)，以進一步確認與研究區(qū)域內茶小綠葉蟬種群Provesti氏遺傳距離、Nei氏遺傳距離和遺傳分化指數(shù)有關的景觀環(huán)境因子。

使用R軟件包stats的一般線性模型(generalized linear mixed model,GLMM)分析采樣點周圍半徑1 000 m范圍內的草地面積占比 (1000m_Grassland) 和地理距離(geo)與茶小綠葉蟬種群Provesti氏遺傳距離、Nei氏遺傳距離和遺傳分化指數(shù)的線性關系，并分析各樣點1000m_Grassland值與茶小綠葉蟬種群遺傳多樣性(DIV,AR,He,Ho)的線性關系。

2 結果

2.1 種群遺傳多樣性

23個微衛(wèi)星位點在18個種群中均表現(xiàn)出多態(tài)性，等位基因數(shù)量從9(Eo-1-57)到52(Eo-51)不等；等位基因豐富度(AR)介于3.686(FQ)和4.397(HL)之間，平均值為4.5195；基因多樣性(DIV)介于0.676(FX)和0.734(HL)，平均值為0.7081；期望雜合度(He)介于0.659(FQ)和0.729(HL)，平均值為0.7567(表4)，位于安溪縣西部和北部樣點的茶小綠葉蟬種群(如FQ,XG,HZ等)表現(xiàn)出較低的遺傳多樣性水平。

表4 福建安溪茶小綠葉蟬種群的遺傳多樣性Table 4 Genetic diversity of Empoasca onukii populations in Anxi,Fujian

2.2 種群遺傳結構

STRUCTURE軟件推斷的K的最大可能值是2，表明研究區(qū)域內茶小綠葉蟬種群可以劃分為兩個遺傳類群(cluster)：一個類群包括安溪縣北部10個樣點的種群，另一個類群包括安溪縣南部8個樣點的種群(圖1:A,F)。在此基礎上，K=3～6時，安溪縣茶小綠葉蟬種群遺傳分化格局比較明顯(圖1)，大體上為位于安溪縣西北部5個相鄰樣點(FQ,XG,HZ,XH和HM)的茶小綠葉蟬種群組成一個類群，分別位于北部和中部的JD和WZ種群各自單獨成一個類群，位于東部的5個相鄰樣點的種群(FX,SG,HL,SL和MB)組成一個類群，位于南部的3個相鄰樣點的種群(LT,YY和MS)組成一個類群，同樣位于南部的另外3個不相鄰樣點的種群(JY,JB和XD)組成一個類群。結合安溪縣土地利用分類圖來看，位于東部的5個樣點(FX,SG,HL,SL和MB)以及FQ和WZ周圍的茶葉種植較少，有較多的其他土地利用類型的分布，與其他樣點之間處于相對隔離的狀態(tài)(即與其他樣點間沒有適宜生境茶園的連接)。據(jù)此，我們推測周邊景觀格局不同的茶園中的茶小綠葉蟬種群遺傳結構和基因交流模式可能存在差異。

不基于模型假設的DAPC分析將安溪縣18個茶小綠葉蟬種群劃分為4個類群(圖2)：JY,XD和JB為一個類群，F(xiàn)X,XG和XH為一個類群，F(xiàn)Q,MB,WZ,JD和HZ為一個類群，YY,MS,LT,SG和SL為一個類群?？傮w上仍然是南北種群分化明顯。

圖2 DAPC分析茶小綠葉蟬種群的遺傳關系Fig.2 Genetic correlation analysis of Empoasca onukii populations using DAPC點代表每個分析個體，橢圓代表種群，橢圓中心點之間距離的大小代表種群親緣關系的遠近。Dots represent the study individuals,inertia ellipses represent the populations,and the distance between the center points of the ellipses represents the genetic distance between populations.

2.3 種群遺傳分化

兩個不同種群間的Nei氏遺傳距離為0.042(MS-LT)～0.984(SL-FQ)，Provesti氏遺傳距離為0.207(MS-LT)～0.650(SL-FQ)(表5)。遺傳分化指數(shù)為0.002(MS-LT)～0.222(SL-FQ)，大部分均達到了統(tǒng)計學上的顯著性水平(P<0.05)(表6)。根據(jù)Wright等(1978)提出的標準(00.25，分化極大)，基于種群遺傳距離和遺傳分化指數(shù)，大部分茶小綠葉蟬種群的遺傳分化表現(xiàn)出中等到較高的水平。FQ與其他種群的群遺傳分化較大，HM,SL,SG,MS,LT和YY種群間遺傳分化也比較大。

表5 茶小綠葉蟬不同種群之間的Nei氏遺傳距離(下三角)和Provesti氏遺傳距離(上三角)值Table 5 Nei’s genetic distance (below diagonal) and Provesti’s genetic distance (above diagonal) values among different populations of Empoasca onukii

表6 茶小綠葉蟬不同種群之間的遺傳分化指數(shù)值(下三角)及其統(tǒng)計檢驗值(上三角)Table 6 Pairwaise FST values (below diagonal) and their statistic P values (above diagonal) among different populations of Empoasca onukii

2.4 種群基因流格局

BAYESASS的多次單獨運行獲得了較為一致的結果，在檢測的306對異地種群間，大部分種群間的現(xiàn)時基因流(Nm)很小，介于0.007～0.010之間(228對)，其余70對介于0.010～0.097之間，8對介于0.108～0.180之間；而在種群內部個體之間基因流基本都很大，介于0.674～0.854之間(表7)。說明茶小綠葉蟬異地種群之間的現(xiàn)時基因交流可能受限，其現(xiàn)時基因流主要發(fā)生在種群內部個體之間。

表7 茶小綠葉蟬不同種群之間(上下三角)和種群內部個體之間(對角線)最近幾代的基因流(Nm)值Table 7 Gene flow (Nm) values over recent generations among different populations of Empoasca onukii (below and above diagonal) and among individuals (on diagonal) in each population

2.5 茶園周邊景觀格局與茶小綠葉蟬種群遺傳變異的相關性

Simple Mantel分析顯示地理距離(geo)與Provesti氏遺傳距離(r=0.2938,P=0.0088)、Nei氏遺傳距離(r=0.2015,P=0.0455)以及遺傳分化指數(shù)(r=0.2052,P=0.0301)之間均存在顯著的相關性(表8)。在排除了地理距離(geo)的影響后，Partial Mantel分析顯示，11個景觀組成因子均與Provesti氏遺傳距離、Nei氏遺傳距離和遺傳分化指數(shù)顯著相關，而海拔(elevation)和與景觀結構有關的所有因子均沒有檢測到與Provesti氏遺傳距離、Nei氏遺傳距離和遺傳分化指數(shù)有顯著相關性。

表8 景觀因子與茶小綠葉蟬種群遺傳分化的Simple Mantel和Partial Mantel相關性分析結果Table 8 Results of Simple Mantel and Partial Mantel tests among landscape factors and genetic differentiation of Empoasca onukii populations

距離矩陣多元回歸分析表明，地理距離(geo)和采樣點周圍半徑1 000 m范圍內草地面積占比(1000m_Grassland)兩個景觀環(huán)境因子無論是組合在一起還是各自單獨對茶小綠葉蟬種群Provesti氏遺傳距離、Nei氏遺傳距離和遺傳分化指數(shù)的影響都是顯著的；這兩個因子對Provesti氏遺傳距離、Nei氏遺傳距離和遺傳分化指數(shù)的解釋比例有差異，決定系數(shù)R2分別為14.70%,7.72%和12.28%(表9)。

表9 距離矩陣多元回歸分析相關的景觀因子及其對茶小綠葉蟬種群遺傳變異的解釋比例Table 9 Related landscape factors and their explanatory proportion to the genetic variation of Empoasca onukii populations by multiple regression on distance matrix analysis

一般線性模型分析顯示，采樣點周圍半徑1 000 m范圍內草地面積占比和地理距離與茶小綠葉蟬種群Provesti氏遺傳距離、Nei氏遺傳距離和遺傳分化指數(shù)線性關系顯著(圖3)，種群遺傳距離隨著地理距離的增加而顯著變大(r=0.2015～0.2938,P=0.0002～0.0120)(圖3:A,B,C)，也隨著采樣點周圍半徑1 000 m范圍內草地面積占比的變大而顯著變大(r=0.1866～0.2604,P=0.0015～0.0226)(圖3:D,E,F)。同時，采樣點周圍半徑1 000 m范圍內草地面積占比與茶小綠葉蟬種群He和DIV之間的線性關系也是顯著的(圖4:A,C)，茶小綠葉蟬種群遺傳多樣性水平隨著采樣點周圍半徑1 000 m范圍內草地面積占比的變大而變大(r=0.4829～0.5222,P=0.0267～0.0426)。

圖3 一般線性模型分析茶小綠葉蟬種群Provesti氏遺傳距離(A,D)、Nei氏遺傳距離(B,E)和遺傳分化指數(shù)(C,F)與地理距離和采樣點周圍半徑1 000 m范圍內草地面積占比的線性關系Fig.3 Linear correlation between Provesti’s genetic distance (A,D),Nei’s genetic distance (B,E) and pairwise FST (C,F) of Empoasca onukii populations and geographical distance and the area percentage of grassland in the circular sector of 1 000 m radius around sampling site based on generalized linear mixed model

圖4 一般線性模型分析茶小綠葉蟬種群He (A),Ho (B),DIV(C)和AR(D)與采樣點周圍半徑1 000 m內草地面積占比的線性關系Fig.4 Linear correlation between He (A),Ho (B),DIV (C) and AR (D) of Empoasca onukii populations and the area percentage of grassland in the circular sector of 1 000 m radius around sampling site based on generalized linear mixed modelHe:期望雜合度Expected heterozygosity;HO:觀察雜合度Observed heterozygosity;DIV:基因多樣性Gene diversity;AR:等位基因豐富度Allelic richness.

3 討論

3.1 茶小綠葉蟬的自主擴散能力

本研究基于23對微衛(wèi)星位點的基因型數(shù)據(jù)對福建省安溪縣18個茶小綠葉蟬種群進行了分析，雖然是小尺度區(qū)域的研究，基于模型假設和不基于模型假設的分析結果顯示研究區(qū)域內茶小綠葉蟬種群遺傳分化結構明顯，遺傳距離和分化指數(shù)的分析顯示大部分種群間的遺傳分化達到了中等水平，多元回歸模型和一般線性模型以及Mantel分析顯示茶小綠葉蟬種群遺傳分化與地理距離顯著正相關，種群表現(xiàn)地理距離隔離格局，這些信息表明茶小綠葉蟬種群有明顯的遺傳分化格局。近期有其他研究者報道了基于微衛(wèi)星數(shù)據(jù)分析茶小綠葉蟬在中國四大茶區(qū)明顯的種群遺傳結構和地理距離隔離格局(Zhangetal.,2019)。Lo等(2019)基于微衛(wèi)星標記發(fā)現(xiàn)澳大利亞16個櫚椿Thaumastocorisperegrinus種群表現(xiàn)中等分化和地理距離隔離格局并據(jù)此推測櫚椿的自主擴散能力有限；Cao等(2019)對15個瓜薊馬Thripspalmi種群的微衛(wèi)星基因型分析發(fā)現(xiàn)種群表現(xiàn)出顯著的遺傳分化和地理距離隔離格局，基于BAYESASS估算的種群間的現(xiàn)時基因流明顯受限，推測種群間可能沒有持續(xù)的擴散事件。凡是具有遠距離和大范圍擴散的遷飛性昆蟲種群，往往不具有明顯的遺傳結構，異地種群間通?？梢詸z測到明顯的基因流。例如，遷飛性害蟲小菜蛾Plutellaxylostella種群的遺傳分化不明顯，具有明顯的基因流格局(Weietal.,2013,2017)；而采自相同區(qū)域的菜蛾盤絨繭峰Cotesiavestalis的種群間卻表現(xiàn)出很強的遺傳分化水平(Weietal.,2017)，因此認為菜蛾盤絨繭峰可能不會跟隨其寄主遠距離遷飛。Zhang等(2019)雖然未對基因流進行直接的估算與分析，但認為茶小綠葉蟬不同地理種群之間存在大量基因流。本研究基于BAYESASS對茶小綠葉蟬異地種群間的遷移率(基因流)進行了估算，BAYESASS估算的遷移率(m)通常被認為是種群5代以內(<5代)的情況(Wilson and Rannala,2003)，鑒于茶小綠葉蟬種群在中國茶區(qū)每年發(fā)生9～16代(Fuetal.,2014)，本研究估算的基因流可以反映茶小綠葉蟬種群“當代”(不到一年)的遷移擴散事件，也即幫助我們推測茶小綠葉蟬種群的擴散過程和遷移能力。BAYESASS分析顯示其研究區(qū)域內茶小綠葉蟬種群間的當代基因交流受限，其現(xiàn)時基因流往往僅限于種群內部個體之間，表明小尺度區(qū)域范圍內茶小綠葉蟬異地種群間可能缺乏自主的擴散和交流過程。根據(jù)以上信息，我們推測茶小綠葉蟬很可能不具有遠距離遷飛的習性，自主擴散的能力有限。周寧寧(2014)和陳世春等(2015)分別基于線粒體COI和16S rRNA基因序列對假眼小綠葉蟬Empoascavitis地理種群的分析也都認為茶小綠葉蟬可能是一類擴散能力有限的害蟲。

盡管茶小綠葉蟬的自主擴散能力有限，人類活動對茶小綠葉蟬種群的影響是不可忽視的，其中最主要的是茶苗在異地間的調運和移植過程可能可以為茶小綠葉蟬種群實現(xiàn)跨地區(qū)擴散和遠距離傳播創(chuàng)造很好的條件和機會。在過去幾十年中，隨著無性繁殖技術在茶樹上的運用和發(fā)展，由于其相對于茶籽播種來說更加快速高效，越來越多新茶園的建立選擇從異地調運茶苗，這為茶小綠葉蟬種群實現(xiàn)跨地區(qū)擴散和遠距離傳播創(chuàng)造了很好的條件和機會。茶小綠葉蟬種群具有跟隨寄主茶苗實現(xiàn)跨地區(qū)擴散和遠距離傳播的能力，茶小綠葉蟬通常將卵產(chǎn)入茶枝嫩梢或葉梢組織中，其成蟲和若蟲也很小(Shietal.,2015)，又具有久坐不動和大部分時間均棲息在葉背或嫩梢上吸食汁液為害的習性(邊磊等,2014)。在種植者沒有更多農(nóng)事操作和育苗知識的情況下，茶苗很可能受到茶小綠葉蟬侵染，并使其跟隨茶苗異地調運而實現(xiàn)遠距離傳播和異地擴散。因此，新建茶園仍要關注茶小綠葉蟬侵染和危害的問題。隨著未來新茶園的發(fā)展和舊茶園的替換，茶苗和茶樹在異地間的調運應進行嚴格的檢查以防止茶小綠葉蟬種群在更大區(qū)域范圍內的擴散和傳播。同時，相比于扦插等無性繁殖技術，組培和茶籽播種可以繁育出不帶蟲卵的茶苗，結合將這些“無蟲”苗木在溫室中培育的措施可以幫助減少潛在的茶小綠葉蟬侵染的風險，并避免更大范圍的傳播和擴散。

雖然人類活動影響不可忽視也不可控，但茶樹是多年生作物，一經(jīng)種植可以多年保持，因此在已經(jīng)建立的成熟茶園中，生態(tài)系統(tǒng)相對于其他作物系統(tǒng)更穩(wěn)定，人類活動對茶小綠葉蟬的助遷作用和機會會大大減少。因此研究中我們選擇其中茶樹具有一定樹齡的茶園采集樣本以避免近期茶苗移植對分析的影響，同時選用微衛(wèi)星分子標記和BAYESASS分析種群遺傳信息。一般認為高度可變的位點，如微衛(wèi)星分子標記適合于研究和反映生物種群短期的小尺度區(qū)域的遺傳結構和基因流(Wang,2010,2011)。而基于頻率分配檢測的方法BAYESASS被廣泛用于估算當前或以前幾代的遷移率來推斷最近的基因流動。由此研究中分析的當代種群遺傳分化結構和基因流空間格局主要反映茶小綠葉蟬種群的自主擴散或遷飛能力信息，而可能與茶苗異地調運過程關系較少。

3.2 茶園周邊景觀格局對茶小綠葉蟬種群遺傳結構的影響

本研究中，研究區(qū)域內茶小綠葉蟬種群大體上分為東部、西北部和南部種群的格局，結合茶園周邊景觀格局分析結果和采樣觀察記錄以及相關文獻記錄(稅偉等,2017)，位于南部的JB,LT和YY等種群所在鄉(xiāng)鎮(zhèn)，主要采用單一化和集約化的種植模式，在茶園周圍少見自然和半自然生境或其他作物田；位于西北部的FQ和XG等種群所在鄉(xiāng)鎮(zhèn)，茶園大都分布于高海拔的山坡上，周圍經(jīng)常會有大量森林等自然和半自然生境分布。而位于東部的FX,SG,HL,SL和MB等種群所在的鄉(xiāng)鎮(zhèn)，種植模式則會更多樣化，茶園周圍經(jīng)常會有更多居民點和其他作物田的分布。根據(jù)這些信息，我們推測周邊景觀格局不同的茶園中的茶小綠葉蟬種群遺傳結構和基因交流模式可能存在差異。

借助于景觀遺傳學的原理和方法，使用Mantel相關性分析、距離矩陣多元回歸模型MRM和一般線性模型GLMM定量化解析了地理距離、海拔、樣點周圍不同尺度范圍的景觀組成因子以及景觀結構與茶小綠葉蟬種群遺傳變異的相關性。結果顯示地理距離(geo)和采樣點周圍半徑1 000 m范圍內草地面積占比(1000m_Grassland)是與研究區(qū)域內茶小綠葉蟬種群遺傳分化顯著相關的因子，茶小綠葉蟬種群遺傳分化水平隨著采樣點間地理距離的變大而變大，也隨著采樣點間周圍草地面積差異值的變大而顯著變大，與周圍草地面積較小的茶園相比，有較多草地分布的茶園中的茶小綠葉蟬種群表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性水平。類似地，Dong等(2018)的研究發(fā)現(xiàn)棉蚜Aphisgossypii的遺傳多樣性水平與1 000 m和2 000 m范圍內的草地面積比例呈顯著正相關。已有的大量景觀生態(tài)學研究表明一些生境(special habitat)或土地利用類型(land cover)會影響昆蟲的定殖過程(Dongetal.,2015;Angelellaetal.,2016)。因此，景觀組成會影響昆蟲種群的建立和擴張過程，進而也可能影響其種群的遺傳結構和分化(Dongetal.,2018)，特別是對于這類自主擴散能力有限的昆蟲來說，景觀組成的影響作用可能會更明顯。

本研究中的土地利用類型空間分布格局可以簡單反映茶小綠葉蟬的棲境和寄主植物以及不適宜生境的分布。已有的研究還不能排除茶小綠葉蟬會在雜草上越冬、過渡和繁殖的可能性(陳李林等,2019;Chenetal.,2019)。雜草地對茶小綠葉蟬種群的遺傳多樣性具有積極作用，可能一方面茶小綠葉蟬種群在茶園受到農(nóng)事操作(如茶枝修剪和農(nóng)藥噴灑等)干擾時移動到雜草地過渡，干擾解除后再從雜草地移回茶園棲息地，景觀組成可能通過這樣的方式影響其種群的建立、定殖過程，進而影響其遺傳結構和分化；另一方面，雜草地生境本身也可能提供豐富的葉蟬資源，寄主和替代寄主分布通過選擇和繁殖影響茶小綠葉蟬種群的遺傳結構和分化。相比于雜草地，森林生境包含更多的多年生喬木樹種，這些高大的樹種可能大多數(shù)都不能成為茶小綠葉蟬合適的寄主植物，而且隨著森林面積的增加，適合于茶小綠葉蟬種群棲息的茶園面積減少，同時也不能排除森林生境中的高大樹種會阻斷茶小綠葉蟬種群間的交流、擴散和連續(xù)性的可能性。因此，在周圍有更多森林生境分布的樣點中的種群如FQ和XG等，葉蟬種群表現(xiàn)較低遺傳多樣性水平，一般線性模型的分析也顯示葉蟬種群遺傳多樣性水平與茶園周圍的森林生境面積呈負相關(數(shù)據(jù)未展示)。趙紫華等(2010)報道與麥田相鄰的自然和半自然生境棲境可有效地延緩麥蚜種群遷入作物田的時間并減少擴散傳播事件。從本研究的結果來看，不同的自然生境類型對害蟲種群的影響作用有差異。就茶小綠葉蟬而言，茶園周圍的雜草地生境對其種群建立、過渡和擴張可能是有利的，因此清除雜草可能是茶小綠葉蟬可持續(xù)治理策略很重要的一項內容。當然，非作物生境通常也被認為可能棲息著大量可作為生物防治資源的天敵物種(Tscharntkeetal.,2012;Gurretal.,2016)，茶小綠葉蟬有兩種主要的卵寄生蜂葉蟬三棒纓小蜂Stethyniumempoascae和微小裂骨纓小蜂Schizophragmaparvulas在田間的寄生率超過30%，被認為是茶小綠葉蟬可持續(xù)控制的重要天敵(李慧玲和林乃銓,2008;毛迎新等,2008)，那么雜草地生境對這兩種寄生蜂是否有益？如果有益，那雜草地生境對茶小綠葉蟬種群的促進作用和在保育天敵資源以更好發(fā)揮防控效能作用間的比較和權衡也是一個值得探討的復雜問題。

此外，景觀尺度可能也對茶小綠葉蟬種群的擴散和定殖有一定的影響，本研究在5個空間尺度(景觀半徑0.5～2.5 km不等)上研究了景觀組成因子對茶小綠葉蟬種群遺傳多樣性和變異的影響，結果顯示茶園周圍1 000 m半徑內的草地面積解釋了茶小綠葉蟬種群遺傳多樣性和變異的最大比例。盡管當前我們對茶小綠葉蟬種群的移動特性還了解得不多，但茶園周圍1 000 m半徑這個尺度范圍的景觀可能包含了茶小綠葉蟬種群的生態(tài)鄰域(ecological neighborhood)(Dongetal.,2018)，其中可能包含或者滿足了其可以或需要利用的生境尺度。

綜合以上信息來看，關于小尺度區(qū)域范圍內茶小綠葉蟬景觀遺傳學的研究可能有助于增進對茶小綠葉蟬定殖及其相應空間尺度和相關景觀格局的理解。但是，生物種群遺傳變異是一個復雜的過程，微衛(wèi)星分子標記(SSR)的統(tǒng)計功效也還比較有限，研究工作還比較初步，16個空間因子之外，可能還有其他相關的影響因子沒有被檢測或識別到。未來的工作可以考慮對茶小綠葉蟬種群及其相關天敵昆蟲種群在茶園景觀中的生態(tài)學過程進行更多的觀察和研究，如檢查可能充當茶小綠葉蟬替代寄主的植物物種、測量從茶園棲境遷出和從過渡棲境遷回茶園的最近(遠)距離等等，以進一步確認茶園周邊景觀格局對茶小綠葉蟬種群建立、定殖、擴張的影響。