基于網絡藥理學預測菟絲子對阿爾茨海默病的作用靶點及細胞信號通路研究

趙 倩，凌志峰，鮮慈英，黃 斌，楊 夢，詹 杰，羅洪斌,2,3*

1.湖北民族大學醫(yī)學部(湖北 恩施 445000) 2.湖北民族大學神經精神共患病研究所(湖北 恩施 445000) 3.湖北民族大學科技學院(湖北 恩施 445000)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是一種起病隱匿且呈進行性發(fā)展的神經退行性疾病[1]。臨床上多以記憶減退、認知理解能力下降、反應遲鈍、性格和行為改變等表現(xiàn)為主要特征。隨著社會老齡化趨勢的不斷發(fā)展，AD的發(fā)病率日趨增高，嚴重影響老年人的生活質量及身心健康。因此，對于AD的發(fā)病機制及防治研究也日益受到科研人員的高度重視。臨床上AD的一線治療藥物主要為乙酰膽堿酯酶抑制劑(Acetycholinesterase 1,AchE1)和非競爭性的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑，但由于上述藥物有較多不良反應，給患者帶來了一定痛苦，故AD的臨床防治需尋找既能延緩疾病發(fā)展同時又較少不良反應的藥物。

AD在中醫(yī)中屬于癡呆范疇，中醫(yī)解釋為髓減腦消，神機失用。其病因病機復雜，總體可分為本虛標實，腎為先天之本，主骨生髓，而腦為髓海，腎精虧損，則腦失所養(yǎng)。情志不暢或驚恐導致肝郁氣滯、氣血瘀阻、痰蒙神竅也可致呆。故中醫(yī)對癡呆的治療多以補虛、活血化瘀、化痰開竅等為基本。

菟絲子(CuscutachinensisLam.)是旋花科菟絲子屬植物的種子，具有補陽益陰、固精縮尿、明目止瀉的功效，是常用的補益類中藥。該藥始載于《神農本草經》，2010版《中國藥典》收載，菟絲子具有滋補肝腎，固精縮尿，安胎，明目，止瀉等藥效，可用于陽痿遺精，尿有余瀝，尿頻，腰膝酸軟，目昏耳鳴，腎虛胎漏，胎動不安，脾腎虛瀉等[2]。菟絲子的現(xiàn)代藥理學研究表明[3-4]，其化學成分主要包括黃酮類、多糖類、生物堿類、萜類、甾體類、揮發(fā)油以及木質素等化合物，還含有大量的糖苷、16種氨基酸以及鈣、鎂、鐵、錳、銅、鋅等微量元素，具有營養(yǎng)神經、改善記憶、抗氧化、降低炎癥反應等多種作用。

目前關于菟絲子治療AD作用機制方面的報道較少。本研究運用網絡藥理學技術對菟絲子防治AD的作用靶點以及信號通路進行分析與總結，闡述菟絲子在防治AD中可能的作用靶點，為深入研究菟絲子防治AD作用機制提供理論依據(jù)和新的思路。

1 材料與方法

1.1菟絲子成分的整理與篩選以“菟絲子或tusizi”為關鍵詞在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫平臺(TCMSP)中查詢菟絲子的主要成分信息，以藥物口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18為條件，篩選出菟絲子的部分潛在有效成分。

1.2藥物與疾病相關靶點基因信息的收集在TCMSP中以“菟絲子或tusizi”為關鍵詞進行搜索，“Related Targets”選項所示即為所找藥物相關靶點，將顯示的菟絲子全部靶基因復制保存。然后通過運行perl軟件，用靶點基因數(shù)據(jù)庫(Uniprot)(https://www.uniprot.org/)對菟絲子的靶點基因進行標準化，導出數(shù)據(jù)。

在GeneCards(https://www.Genecards.org/)數(shù)據(jù)庫中以“Alzheimer’s disease”為關鍵詞進行檢索得到AD相關靶點基因并導出數(shù)據(jù)信息。

1.3藥物-疾病網絡模型的構建與分析先將整理歸納后的菟絲子有效成分和靶點基因導入到Cytoscape V3.2.1軟件，然后再把GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索到和AD相關的靶點基因也導入至Cytoscape V3.2.1軟件中，構建出藥物、疾病、靶點、成分之間相互作用的中藥調控網絡圖。再將所整理得到的菟絲子活性成分與靶點基因通過R×64 4.0.2軟件及相應腳本進行程序篩選，可得出兩者之間的交集，將篩選出的核心靶點基因輸入到String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，生成蛋白相互作用(PPI)核心基因網絡圖。最后將菟絲子可能對AD起作用的靶點基因導入R×64 4.0.2軟件中，使用相應腳本進行程序運算，進行基因本體(GO)功能富集分析可得到基因生物途徑(BP)、分子功能(MF)的分類。再進行基因組百科全書KEGG通路富集分析，得到菟絲子干預AD的通路圖。

2 結果

2.1菟絲子活性成分及靶點的篩選結果在TCMSP平臺中最終確定菟絲子潛在有效成分11個，見表1，經標準化分析后得到10個。TCMSP數(shù)據(jù)庫提供的菟絲子相關靶點共490個，經Uniprot標準化后對應基因的有108個。

表1 菟絲子潛在有效成分

2.2 AD作用靶點獲取結果從GeneCard數(shù)據(jù)庫中以“Alzheimer’s disease”為關鍵詞搜索AD相關靶基因，得到8 628個。

2.3藥物與疾病相關性分析

2.3.1 菟絲子主要有效成分-靶點基因-藥物-疾病網的建立 利用軟件R×64 4.0.2將藥物靶點及疾病靶點進行運算，所得交集即為菟絲子可能對AD起作用的相關靶點，共得到90個，見圖1。

圖1 菟絲子與AD靶點交集圖

利用Cytoscape V3.6.1軟件將菟絲子有效成分的相關靶基因與AD相關作用靶基因相對應，構建出菟絲子主要有效成分-靶點基因-藥物-疾病網。其相互作用見圖2：該網絡共包含102個節(jié)點，其中藥物節(jié)點和疾病節(jié)點各1個，成分基因節(jié)點10個，疾病基因節(jié)點90個。由圖可知，菟絲子的有效成分可作用于多靶點，同一靶點也可對應多種成分，故此網絡提示菟絲子對AD的干預可能具有多成分、多靶點的特點。其中可能起到關鍵作用的成分為槲皮素(quercetin)、山奈黃素(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)。

注：藍色代表疾病，黃色代表疾病相關作用靶點，紫色代表藥物，綠色代表藥物有效成分圖2 菟絲子主要成分-靶點基因-藥物-疾病網絡圖

2.3.2 PPI網絡構建及關鍵靶點篩選 運用R軟件將疾病與藥物的靶點進行分析和篩選，將所得共同靶點輸入String網站，進行蛋白相互作用分析，在菟絲子干預AD的相互作用網絡圖中，選取關聯(lián)程度排名前30個靶點，其中關聯(lián)度最高的5個靶點分別為半胱氨酸蛋白酶3(CASP3)、重組人2,4-雙烯酰輔酶A還原酶1(DECR1)、促分裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、ESR1、內皮-氧化氮合酶3(NOS3)，這些靶點可能是此干預作用的關鍵靶點，見圖3、圖4。

圖3 菟絲子與AD蛋白相互作用PPI網絡圖

圖4 菟絲子干預AD的PPI核心靶點基因

2.3.3 GO生物功能分析 將菟絲子干預AD的潛在靶點輸入R×64 4.0.2軟件，進行GO功能富集分析，結果顯示，其生物途徑主要富集于DNA結合轉錄因子結合，此過程涉及12個靶點，可能為最主要的生物過程，此外也與泛素樣蛋白連接酶結合、RNA聚合酶II特異性DNA結合轉錄因子結合、泛素蛋白連接酶結合等方面有一定關系。其分子功能主要富集于DNA結合轉錄激活劑活性和RNA聚合酶II特異性、DNA結合轉錄激活因子活性等方面，見圖5、圖6。

圖5 GO功能富集分析柱狀圖

圖6 GO功能富集分析氣泡圖

2.3.4 KEGG通路富集分析 將上述所得潛在靶點運用R軟件進行通路富集分析，結果顯示，該干預過程在PI3K-Akt信號通路、卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染、人巨細胞病毒感染、蛋白聚糖在癌癥中的信號通路最為富集，可能是菟絲子干預AD的最主要信號通路，見圖7、圖8、圖9、圖10。此外，該干預過程與流體剪切應力與動脈粥樣硬化、乙型肝炎、MAPK信號通路也有一定關系。

圖7 KEGG通路富集分析柱狀圖

圖8 KEGG通路富集分析氣泡圖

圖9 PI3K-Akt信號通路圖

圖10 卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染通路圖

3 討論

隨著老齡化社會的到來，AD的發(fā)病率日趨增高，但其發(fā)病原因至今未明，當前較為公認的發(fā)病機制主要有：膽堿能假說、毒性β淀粉樣(Aβ)蛋白的沉積假說、Tau蛋白過度磷酸化假說、自由基損傷假說、炎癥假說等。從病理學角度看，AD的病理改變主要出現(xiàn)在主導學習與記憶功能的大腦皮層和海馬區(qū)域，包括膽堿乙酰轉移酶(ChAT)和乙酰膽堿(Ach)含量顯著減少、腦部出現(xiàn)大量由Aβ蛋白組成的老年斑、神經纖維纏結和神經元細胞凋亡等方面[5]，且這些病理改變之間會形成一個惡性病理循環(huán)[6]，因此AD患者臨床上主要表現(xiàn)為不可逆的漸進性記憶喪失和認知功能障礙。

AD的病理過程涉及多條信號通路與基因調控，因此聯(lián)合分析幾大數(shù)據(jù)庫，能夠更全面地把握AD的發(fā)病原因及其潛在發(fā)病機制。本次研究運用TCMSP數(shù)據(jù)庫共篩選出菟絲子干預AD的標準化后潛在有效成分10個[7]，相關靶點108個，與AD的相交靶點共有90個，提示菟絲子靶點映射AD的治療概率是83.33%(90/108)，說明藥物-疾病靶點映射率很可觀。通過相關軟件分析預測，得到菟絲子可能對AD起作用的主要作用靶點為CASP3、DECR1、MAPK8、ESR1、NOS3，菟絲子中的有效成分可直接作用于這些靶點，也可通過其他靶點產生間接相關性。CASP3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶[8],該基因編碼的蛋白質也參與了淀粉樣前體蛋白APP的裂解[9]，APP裂解后產生Aβ，在AD患者大腦中過多堆積，形成老年斑，造成周圍神經元變性與凋亡，誘導AD的發(fā)生。ESR1是雌激素受體1,已有研究表明[10]雌激素表達水平的高低與GSK-3β的活性密切相關，GSK-3β是一種重要的絲/蘇氨酸蛋白激酶，主要作用于神經細胞的分化與增殖，在神經退行性疾病中具有重要的影響。GSK-3β異常活躍會導致Tau蛋白的異常磷酸化，造成神經元纖維纏結，最終導致AD的發(fā)生。說明菟絲子對AD的干預也可從調節(jié)體內雌激素的途徑發(fā)揮作用。DECR1是一種在不飽和脂肪酸的β-氧化途徑中起催化反應的限速酶，參與體內脂肪堆積的調節(jié)，說明AD的產生可能與肥胖因素存在某種潛在關系，但此觀點尚未得到證實。MAPK8參與調控細胞的生長、分化、凋亡、對藥物及環(huán)境的應激適應、炎癥反應等多種重要的細胞生理及病理過程[11-12]。MAPK8高表達會誘導Tau蛋白的異常磷酸化[13]，故而引起AD的發(fā)病。NOS3存在于神經元中，具有協(xié)助細胞通訊的作用。由此可見菟絲子的干預作用也可能通過以上途徑來實現(xiàn)。

疾病-藥物靶點相互作用網絡圖顯示出菟絲子對AD的干預過程屬于多成分作用于多靶點的結果。PPI網絡說明菟絲子的靶點蛋白之間發(fā)揮著相互作用。在GO功能富集化分析結果顯示得出菟絲子作用于AD主要的生物過程包括DNA結合轉錄因子結合、泛素樣蛋白連接酶結合、RNA聚合酶II特異性DNA結合轉錄因子結合、泛素蛋白連接酶結合等方面。KEGG通路富集分析結果表明PI3K-Akt信號通路、卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染是菟絲子干預AD的重要信號通路。

PI3K-Akt信號通路作為AD發(fā)病機制中的一條經典通路，在誘導APP過度裂解、Aβ過度堆積、Tau蛋白過度磷酸化和細胞凋亡方面有著密切聯(lián)系，對神經突觸可塑性具有重要影響[14]。PI3K的表達能夠激活AKT的磷酸化位點，從而激活AKT，進而導致GSK-3β的Ser9位點磷酸化，Ser9位點屬于非活性位點，使得GSK-3β的活性被抑制[15]。然而在AD中，由于該信號通路部分蛋白表達異常，導致GSK-3β過度表達而活性上升。GSK-3β又是Tau蛋白磷酸化的重要激酶之一，其過表達將誘導產生過多載脂蛋白E4(Apo-E4)和Aβ，造成Aβ過度堆積，形成老年斑，引起細胞凋亡和Tau蛋白過度磷酸化。相反，毒性Aβ堆積也進一步升高GSK-3β的活性，加重Tau蛋白的過度磷酸化和神經元死亡，使神經元微管結構不斷受到損害，造成神經元細胞功能進一步損傷，引起神經元發(fā)生不可逆的慢性病變，最終導致AD的發(fā)生。由此可見，本研究推測PI3K-Akt信號通路是菟絲子干預AD的重要信號通路之一。

神經細胞是神經系統(tǒng)中最基本的結構，是傳遞信息和影響學習記憶能力的重要功能單位。大量研究表明[16]皰疹病毒與AD的發(fā)病相關，其中1型單純皰疹病毒(HSV-1)是一種DNA嗜神經性病毒，會誘導AD標志物的累積；人皰疹病毒4(HHV4，也稱為EBV)是一種與多種癌癥相關的皰疹病毒，在臨床上也與各種神經系統(tǒng)疾病有關，例如原發(fā)性中樞神經系統(tǒng)淋巴瘤，多發(fā)性硬化癥，AD，小腦過失癥和腦炎等，是老年人認知能力下降和發(fā)展為AD的環(huán)境危險因素。另有研究表明[17]卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒(KSHV)與EBV一樣，能夠高效感染神經細胞并進行子代復制，其感染具有一定時間的潛伏期和定期激活特點，這種感染直接導致了系統(tǒng)免疫反應的壓力，誘導相應的慢性炎癥反應(激活神經炎癥標志物—星形膠質細胞)，使神經細胞變得腫脹，繼而破裂，導致其凋亡，最終引起神經系統(tǒng)退行性病變。故卡波西肉瘤相關皰疹病毒信號通路提示菟絲子對于感染該病毒導致的炎癥反應具有一定的改善作用。

菟絲子的現(xiàn)代藥理研究已證實其具有延緩衰老、營養(yǎng)神經、抗氧化、調節(jié)免疫、預防心腦血管等多種藥理作用，作為臨床常用中藥，菟絲子也能通過補腎填精、補陽益陰起到濡養(yǎng)腦竅的作用，故通過運用網絡藥理學方法預測菟絲子干預AD主要作用靶點基因具有一定可行性和研究基礎。本研究構建出了相關靶點基因相互作用網絡，通過對菟絲子干預AD靶點基因的生物過程與通路富集分析，清楚地闡明了菟絲子干預AD的潛在作用機制，得出菟絲子可能在抑制Tau蛋白異常磷酸化、調節(jié)PI3K信號通路相關蛋白的表達、降低病毒感染導致的炎癥反應、增強神經元突觸可塑性、調節(jié)雌激素等方面具有一定作用，為后續(xù)研究菟絲子干預AD的相關作用機制及研發(fā)相關藥物提供了一定的理論支持及科學依據(jù)，具有潛在的藥物研究應用價值。