米諾環(huán)素對缺血性腦卒中血腦屏障重塑的影響及其機制*

李蕊蕊, 林園凱, 張格, 李姣, 黃薇園△

海南省人民醫(yī)院(海南醫(yī)學院附屬海南醫(yī)院) 1放射科， 2病理科(海南?？?570311)

血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)是腦微血管特有的屏障結構。微血管內皮細胞及微血管內皮細胞之間的緊密連接是形成屏障作用的最主要結構基礎。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)家族通過降解細胞外基質及基底膜成分，在腦缺血微血管損傷中扮演著重要角色。腦缺血再灌注促進了MMP-9活性增強，破壞了神經(jīng)血管基質，從而破壞了BBB的完整性，誘發(fā)了不可逆的神經(jīng)細胞凋亡，并與血管源性腦水腫以及出血性轉化等預后不良因素密切相關[1-2]。拮抗MMP可減輕BBB破壞，減輕缺血再灌注損傷及出血性轉換的發(fā)生，減少梗死體積，保證功能血管恢復血流灌注，促發(fā)以BBB重塑及血管再生為基礎的神經(jīng)及軸突再生，最終改善缺血性腦卒中預后[2-3]。米諾環(huán)素(minocycline，MC)是一種能通過BBB的四環(huán)素類抗生素，在急性腦缺血的動物模型中具有廣譜的抗炎、抗凋亡、抗氧化及血管保護作用[4-5]。MC通過MMP及小膠質細胞/巨噬細胞促發(fā)腦缺血再灌注后的BBB重塑。然而最新研究顯示MMP作用機制較為復雜，MMP在缺血性腦卒中中具有雙重功效，即早期破壞了緊密連接，引起B(yǎng)BB破壞，而恢復期卻促發(fā)了BBB重塑及新生血管再生[6]，具體的機制還未完全闡明，并且既往研究MC神經(jīng)保護機制的方法均為病理學方法，運用影像學方法無創(chuàng)性動態(tài)監(jiān)測腦卒中后內源性重塑過程及療效的研究還未見報道。為了深入探討MC對缺血性腦卒中BBB重塑作用機制及影像可視化。2018年5月至2019年3月，本研究擬建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，并聯(lián)合運用磁共振(magnetic resonance imaging，MRI)成像技術，觀察不同給藥時相MC在大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷中的神經(jīng)保護作用并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗選取SPF級雄性SD大鼠48只，體重(265±15)g，購于上海西普普克實驗動物有限公司。

1.2 動物短暫性大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型 實驗動物隨機分為4組(早期給藥組、晚期給藥組、生理鹽水組及假手術組)，每組12只。其中早期給藥組于手術后即刻尾靜脈注入MC(3 mg/kg)；晚期給藥組于拔線后恢復再灌注后6 h后大鼠尾靜脈注入MC(3 mg/kg)；生理鹽水組于再灌注即刻注入相同體積的生理鹽水；假手術組除了不插入線栓外，其余處理同生理鹽水組。大鼠在手術前禁食8 h，自由飲水。350 mg/kg的水合氯醛腹腔注射麻醉，頸部正中切口，鈍性分離皮膚和皮下組織等結構，暴露出右側頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸外動脈(external carotid artery， ECA)以及頸內動脈(internal carotid artery，ICA)。ICA暫時血管夾夾閉，于CCA的近端打一個活結，在ECA的遠端插入0.22 mm線栓，打開ICA的血管夾，線栓進深距CCA分叉處約18～20 mm稍有阻力感時則停止。結扎線栓及血管，松開CCA活結，此時開始記錄缺血的時間。阻斷血流2 h后，拔出線栓使大腦中動脈恢復血流再灌注，隨后縫合手術切口。大鼠麻醉清醒后出現(xiàn)對側肢體偏癱及MRI-DWI序列顯示右側大腦半球高信號梗死灶，即表示模型制備成功。假手術組僅僅分離CCA、ICA、ECA，不插入線栓。

1.3 神經(jīng)功能缺損評分 缺血再灌流24 h后，依據(jù)Longa等[7]的方法對假手術組、生理鹽水組和藥物干預組分別進行神經(jīng)功能缺損評分。評分標準為：0分，沒有任何神經(jīng)功能缺損征象；1分，左側前肢出現(xiàn)向內收；2分，行走時向癱瘓一側轉圈；3分，行走時向癱瘓一側傾倒；4分，不可自行走動、意識障礙或死亡。1～3分者視為模型制造成功，0分者、4分者、表現(xiàn)有癲癇發(fā)作者以及取腦組織的時候發(fā)現(xiàn)有腦出血者都給予排除并且隨機補充。

1.4 大鼠腦組織蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin，HE)染色 每組選取3只行染色。實驗結束后水合氯醛麻醉動物，斷頭處死，迅速選取缺血側視交叉附近約1 mm厚度冠狀切片腦組織，10%甲醛溶液固定，按照常規(guī)HE實驗步驟進行染色。

1.5 免疫組化染色 每組選取3只行免疫組化。免疫組化指標包括：IL-1β、TNF-α、IL-10、YM1、RECA-1、PDGFR-β、CD11b，染色步驟按照說明書進行。將組織在4%多聚甲醛中4℃保存24 h以上，切片(5 μm厚)脫蠟后進行免疫組織化學染色。然后用二甲苯洗滌玻片，在不同濃度的乙醇中水合。收集切片，置于3% H2O2中，室溫甲醇中放置15 min，然后浸泡在檸檬酸緩沖液(0.01 mol/L，pH=6.0)中95℃下20 min，用PBS洗滌玻片多次，在1%牛血清中預孵育。初級抗體在室溫下孵育45 min，然后在4℃下孵育過夜。切片用聚合物增強劑孵育20 min，用酶標記的抗兔/小鼠聚合物再活化30 min。用3，4-二氨基聯(lián)苯胺(Vector Laboratories Ltd， UK)處理玻片，在光學顯微鏡下進行觀察。

1.6 血清中細胞因子的檢測 采用商品化測定ELISA試劑盒測定血清中白細胞介素(IL)-6、IL-1β和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量，按照試劑盒說明書操作。

1.7 Western blot法檢測腦組織中相關蛋白的表達

1.7.1 腦組織中總蛋白的提取 每組選取3只行Western blot。取凍存的腦組織樣本，稱重，加入RIPA裂解液及PMSF，置碎冰上裂解組織30 min。收集裂解液，4℃ 12 000 r/min離心10 min。用移液器吸取上清液，按4∶1(上清液：5×SDS-PAGE Loading Buffer)的比例加入loading緩沖液。留取5 μL上清液與EP管中測OD值。裝標記好的EP管裝入密封袋，置于-80℃冰箱保存。

1.7.2 樣品蛋白濃度測定(BCA法) 用BCA蛋白定量試劑盒對提取的蛋白進行定量，操作步驟按照試劑盒說明進行，酶標儀測定標準品以及樣品吸光度，根據(jù)標準曲線計算樣品的蛋白濃度。

1.7.3 SDS-PAGE電泳 根據(jù)待測蛋白的分子量選擇制備10%濃度的分離膠，膠凝固后，制備5%濃縮膠，灌入分離膠上端，插入上樣梳。當濃縮膠完全聚合后(約30 min)，放入電泳槽中固定，加入適量的電泳緩沖液。按相同體積加入各蛋白樣品及預染蛋白marker，使蛋白含量不低于20 μg/孔。樣品在濃縮膠中泳動時電壓為80 V，30～40 min后當溴酚藍進入分離膠后，將電壓增至120 V，繼續(xù)電泳直到溴酚藍接近分離膠底部。根據(jù)跑膠指標的kD值切相應位置的膠。PVDF膜以甲醇活化10 s，然后與濾紙一起浸入轉移緩沖液中。按海綿-雙層濾紙-膠-PVDF膜-雙層濾紙-海綿的順序組裝凝膠轉移夾層，放入轉移槽中。加入轉移緩沖液，接通電源，300 mA恒流電轉移不同時間(根據(jù)轉移蛋白分子量的大小來確定具體的轉移時間)。

1.7.4 免疫印跡 雜交電轉移完畢，取出PVDF膜，放入5%脫脂奶粉封閉液中，置搖床上室溫封閉2 h。封閉過的膜放入雜交袋中，加入一抗4℃孵育過夜，使抗原抗體充分結合。隔天，將膜從雜交袋中取出，用TBST洗滌3次，10 min/次；再放入新雜交袋中，加入HRP標記的二抗以結合一抗，置搖床上室溫孵育2 h后取出PVDF膜，用TBST洗滌3次，10 min/次。

1.7.5 Western blot結果檢測 ECL化學發(fā)光法檢測，將混合好的發(fā)光液滴加到膜上，用凝膠成像系統(tǒng)拍照成像。

1.8 免疫熒光法檢測 Iba-1+小膠質瘤細胞數(shù)量每組選取3只行免疫熒光。免疫熒光標記法檢測小膠質細胞活化。腦組織的石蠟切片置于58℃烤箱中，烤切片15～20 min左右，室溫冷卻。石蠟切片用二甲苯脫蠟(二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各浸泡15 min)，然后再分別置于梯度濃度乙醇中進行水化，濃度依次為100%、90%、75%、50%，各10 min，隨后在雙蒸水中浸泡5 min，再在中性磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡，并置于搖床上緩慢清洗3次，5 min/次。采用3%H2O2封閉內源性過氧化物酶10 min，此過程注意避光。切片浸泡在1×EDTA-檸檬酸鈉抗原修復液中，用微波中火加熱6 min，在室溫條件下冷卻。使用10%山羊血清37℃下封閉30～60 min。濾紙吸去多余液體，加入Iba-1一抗混合稀釋液，4℃過夜。PBS緩慢清洗3次，加入稀釋好的二抗，室溫避光孵育1 h，再用PBS洗3次?？篃晒馑p淬滅劑封片。

1.9 MRI掃描 每只模型于處死前行MRI掃描。采用德國Siemens 3.0 T 掃描儀(Verio，Siemens Medical Solutions，Erlangen，Germany)和專用動物線圈，大鼠頭置線圈中央，掃描序列包括DWI及SWI。DWI 采用EPI 序列，TE/TR：83 ms/4 000 ms；FOV：94 mm×94 mm，b值分別為0、1 000 s/mm2。SWI，TE/TR：20 ms/28 ms；FOV：128 mm×128 mm；矩陣：256×256；翻轉角：15°。各序列掃描層厚2 mm，間距0，層數(shù)均為9層。

DWI產生的ADC圖用以顯示梗死灶并測量梗死體積。SWI圖像用以顯示新生血管，SWI結果判讀由兩名有經(jīng)驗的影像診斷醫(yī)生完成，梗死灶區(qū)域出現(xiàn)連續(xù)層面條狀低信號影，判定為新生血管；不連續(xù)斑點狀、片狀低信號影判定為出血灶。

1.10 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，各組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組的神經(jīng)功能恢復情況及梗死體積 行為學實驗結果顯示，與假手術組比較，生理鹽水組、早期給藥組和晚期給藥組出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能障礙，提示造模成功。與生理鹽水組相比，早期給藥組(P=0.008)顯著改善手術引起的神經(jīng)功能障礙，晚期給藥組沒有明顯的改善現(xiàn)象(P=0.360)。DWI的ADC圖顯示除了假手術組，其余各組均顯示明顯低信號的梗死灶，證明手術成功誘導了大鼠腦梗死。與假手術組比較，生理鹽水組、早期給藥組和晚期給藥組大鼠出現(xiàn)大面積梗死區(qū)域。與生理鹽水組相比，早期給藥組和晚期給藥組的腦梗死面積明顯低于生理鹽水組(P<0.001)。見表1、圖1。

表1 各組的神經(jīng)功能恢復情況及梗死體積

注：A:假手術組；B:生理鹽水組；C:早期給藥組；D:晚期給藥組

2.2 各組腦組織病理學的改變 HE染色結果顯示：假手術組大鼠神經(jīng)元，膠質細胞及毛細血管形態(tài)正常，核仁清晰可見，神經(jīng)纖維密集，排列整齊；生理鹽水組神經(jīng)元結構變得疏松，排列紊亂，細胞外間隙呈網(wǎng)狀增大，神經(jīng)元腫脹，有程度不同的神經(jīng)元變形，核固縮，細胞壞死等現(xiàn)象；MC組別明顯減少缺血再灌注對大鼠腦組織損傷，細胞腫脹和間質水腫明顯緩解。見圖2。

注：A:假手術組；B:生理鹽水組；C:早期給藥組；D:晚期給藥組

2.3 各組腦卒中后的血清炎癥因子水平 與假手術組比較，生理鹽水組大鼠血清 IL-6、IL-1β、TNF-α含量顯著性升高；與生理鹽水組比較，給藥組大鼠血清促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量顯著性降低(P<0.05)。早期給藥組較晚期給藥組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組腦卒中后血清炎癥因子水平

2.4 各組腦卒中后免疫組織化學分析

2.4.1 促炎因子及抗炎因子 與假手術組比較，生理鹽水組大鼠組織促炎因子IL-1β、TNF-α升高，抗炎因子IL-10、TGF-β、YM1降低；與生理鹽水組比較，MC治療組大鼠組織促炎因子IL-1β、TNF-α降低，抗炎因子IL-10、TGF-β、YM1升高，其中，早期給藥組較晚期給藥組改善炎癥的作用更為明顯。見圖3。

圖3 各組大鼠腦組織中促炎因子和抗炎因子的表達(免疫組化，×100)

2.4.2 新生血管及小膠質細胞標記物 與假手術組比較，生理鹽水組大鼠組織標記血管新生的RECA-1和PDGFR-β強度變弱，表達明顯減少，與生理鹽水組比較，MC治療組大鼠組織RECA-1和PDGFR-β表達明顯上調，其中，早期給藥組較晚期給藥組促進血管新生的作用更為明顯(圖4)。SWI同樣證實治療組梗死灶內新生血管數(shù)量高于生理鹽水組，早期給藥組梗死灶內新生血管數(shù)量高于晚期給藥組(圖5)。

CD11b陽性細胞為棕黃色，腦缺血可誘導小膠質細胞從靜息狀態(tài)快速向活化狀態(tài)轉變。免疫組化結果顯示生理鹽水組CD11b標記的陽性細胞明顯增多且形態(tài)大小不均一；MC治療組CD11b染色強度變弱，數(shù)量減少；早期給藥組較晚期給藥組對CD11b的抑制作用更為明顯(圖4)。

2.5 各組腦卒中后相關蛋白表達

2.5.1 緊密連接蛋白 生理鹽水組緊密連接蛋白ZO-1、occludin、claudin-5表達顯著降低；與生理鹽水組比較，MC治療組緊密連接蛋白表達明顯升高，其中早期給藥組較晚期給藥組ZO-1、occludin蛋白升高作用更為明顯(圖6)。

2.5.2 促炎因子 生理鹽水組促炎因子IL-1β、TNF-α、MMP-3表達明顯升高；與生理鹽水組比較，MC治療組促炎因子表達明顯降低，其中早期給藥組較晚期給藥組炎癥因子IL-1β、TNF-α降低更為明顯(圖6)。

2.5.3 抗炎因子 生理鹽水組抗炎因子IL-10、TGF-β、YM1表達明顯降低；與生理鹽水組比較，MC治療組抗炎因子表達明顯升高，其中晚期給藥組較早期給藥組抗炎因子水平無明顯差別(圖6)。

圖4 各組大鼠腦組織新生血管及小膠質細胞標記物的表達(免疫組化，×100)

注：A:假手術組；B:生理鹽水組；C:早期給藥組；D:晚期給藥組

圖6 各組腦卒中后緊密連接蛋白、炎癥因子及抗炎因子的蛋白表達水平

2.6 腦卒中后Iba-1的表達 Iba-1特異性表達于小膠質細胞/巨噬細胞，并在缺血性腦卒中的腦組織中高表達，結果顯示各組Iba-1熒光標記定量值差異有統(tǒng)計學意義(F=150.516，P<0.001)。生理鹽水組Iba-1表達的強度(17.01±1.43)明顯高于其余三組，假手術組(3.74±0.30)表達強度最低；MC給藥組與生理鹽水組相比，MC降低了Iba-1的表達，且早期給藥組(8.58±0.30)較晚期給藥組(9.81±0.41)對Iba-1表達的降低作用更明顯，但兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.07)，其余各組兩兩比較Iba-1的表達水平均差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見圖7。

注：A:假手術組；B:生理鹽水組；C:早期給藥組；D:晚期給藥組

3 討論

MC是第2代半合成四環(huán)素類抗生素，除了具有傳統(tǒng)抗菌作用外，還具有抗炎、免疫調節(jié)等能力。動物及臨床實驗都證實MC對缺血性腦卒中后神經(jīng)細胞損害具保護作用[8-9]，其神經(jīng)保護作用機制及療效成為國內外研究的熱點。MC治療后一方面顯著降低了MMP-9的活性，減輕缺血再灌注損傷，促進缺血區(qū)神經(jīng)元的存活及BBB重塑[10-11]。另一方面通過抑制小膠質細胞的聚集和激活發(fā)揮抗炎作用、直接清除氧自由基發(fā)揮抗氧化應激作用、調節(jié)半胱氨酸蛋白酶依賴或非依賴途徑發(fā)揮抗凋亡作用[12]。但是不同給藥時相的保護作用及機制還未完全闡明。我們于不同時相給藥，聯(lián)合病理及影像學方法觀察MC對腦缺血再灌注后BBB重塑的作用。

DWI結果顯示早期給藥和晚期給藥組的腦梗死體積明顯低于生理鹽水組。行為學實驗結果顯示早期給藥顯著改善手術引起的神經(jīng)功能障礙，晚期給藥組沒有明顯的改善現(xiàn)象。提示MC可以緩解大鼠的腦缺血并對腦卒中后神經(jīng)功能恢復具有保護作用，早期給藥優(yōu)于晚期給藥，HE染色從細胞學水平證實MC組別缺血腦組織的細胞腫脹和間質水腫明顯緩解，提示MC可以減少缺血再灌注對大鼠腦組織的損傷。MC對MCAO引起的腦中卒有治療作用，手術后給予大鼠MC能夠有效減小梗死面積改善神經(jīng)功能障礙；并且手術后立即給藥對神經(jīng)功能障礙的改善作用更明顯。這與其他學者的研究結果相同[8，13]。

缺血再灌注誘導腦組織炎癥發(fā)生，促進炎癥因子的表達，激活小膠質細胞/巨噬細胞，釋放蛋白水解酶。MC在短暫性腦卒中后對于炎癥因子和抗炎因子的調節(jié)規(guī)律與前期研究相仿[14]。本研究組織學及血清學結果都顯示，MC能夠上調抗炎因子水平，下調炎癥因子水平，抑制小膠質細胞/巨噬細胞的活化，降低蛋白水解酶水平，有效改善血清和腦組織中的炎癥，其中，在手術后立即給藥較晚期給藥對炎癥水平的調控作用更明顯。但是血清中炎癥因子早期給藥組較晚期給藥組的作用無明顯差異。這可能是因為組織學中炎癥因子變化更敏感。

本研究中炎癥因子蛋白表達的結果從另一個角度證實了MC能夠通過抗炎發(fā)揮神經(jīng)保護作用。其中MC治療組炎癥因子表達明顯降低，但是早期給藥組較晚期給藥組炎癥因子IL-1β、TNF-α降低更為明顯，與血清中炎癥因子變化規(guī)律相同。MC治療組抗炎因子表達明顯升高，其中晚期給藥組較早期給藥組抗炎因子水平無明顯差別，這與血清中炎癥因子水平無明顯差別相匹配。Wixey等[15]的研究表明MC在缺血再灌注后降低腦組織炎癥因子的作用不僅在再灌注后短期存在，并可持續(xù)致缺血再灌注后6周。但本研究進一步證實了早期給藥抑制炎癥因子的作用更明顯，有助于指導臨床給藥時相的選擇。

生理鹽水組緊密連接蛋白ZO-1、occludin、claudin-5表達顯著降低；與生理鹽水組比較，MC治療組緊密連接蛋白表達明顯升高，其中早期給藥組較晚期給藥組作用更為明顯，說明了MC通過促進緊密連接蛋白的表達修復BBB。激活的緊密連接蛋白的表達能夠修復BBB，保護血管生成[16]。實驗結果顯示，MC對緊密連接蛋白和血管生成蛋白的表達具有上調作用，說明MC能夠通過促進緊密連接蛋白和血管生成蛋白發(fā)揮神經(jīng)保護作用，且在手術后立即給藥較晚期給藥對血管和腦功能的保護作用更明顯。與假手術組比較，生理鹽水組大鼠組織標記血管新生的RECA-1和PDGFR-β強度變弱，表達明顯減少，與生理鹽水組比較，MC治療組大鼠組織RECA-1和PDGFR-β表達明顯上調，其中，早期給藥組較晚期給藥組促進血管新生的作用更為明顯。SWI可以半定量顯示梗死灶內新生血管，結果與RECA-1和PDGFR-β相符合，為內源性BBB重塑可視化提供無創(chuàng)性工具。

Iba-1 特異性表達于小膠質細胞/巨噬細胞，并在缺血性腦卒中的腦組織中高表達[17]，結果顯示Iba-1熒光標記顯示在生理鹽水組中Iba-1表達的強度明顯增強，MC治療降低了Iba-1的表達，且早期給藥組較晚期給藥組對Iba-1表達的降低作用更明顯，MC抑制了腦缺血后小膠質細胞的聚集和激活發(fā)揮抗炎作用；免疫組化結果顯示生理鹽水組CD11b標記的陽性細胞明顯增多且形態(tài)大小不均一；MC治療組CD11b染色強度變弱，數(shù)量減少；早期給藥組較晚期給藥組對CD11b的抑制作用更為明顯，說明MC能夠抑制小膠質細胞/巨噬細胞的活化，發(fā)揮抗炎作用，早期給藥組較晚期給藥組抑制效果更好。

綜上所述，本研究證實了MC通過抑制腦卒中后炎癥反應及小膠質細胞/巨噬細胞活化，促發(fā)局部血管再生，從而有效降低MCAO誘導的缺血再灌注損傷、降低梗死體積及減輕神經(jīng)功能損傷，且早期給藥較晚期給藥效果更好；MRI-SWI有助于無創(chuàng)性可視化判斷缺血性腦卒中BBB重塑。為MC給藥時相的選擇提供理論基礎，并為監(jiān)測缺血再灌注損傷及BBB重塑提供可視化依據(jù)。