寬鰭鱲胰島素樣生長因子-Ⅰ的克隆及繁殖期前后表達分析

沈銘浩 朱迦玥 吳 濤 任天惠 張哲盼 熊 黎 劉芳玲 鄭善堅

(1. 浙江師范大學生化學院, 金華 321004; 2. 浙江師范大學野生動物生物技術與保護利用浙江省重點實驗室, 金華 321004)

胰島素樣生長因子-Ⅰ(Insulin like growth factor-Ⅰ, IGF-Ⅰ)是一種功能近似胰島素類似物的單鏈多肽, 其mRNA檢測結果表明其在魚類各組織中均有表達, 其中肝臟內(nèi)的表達尤為顯著。自虹鱒(Oncorhynchus mykiss)鰓軟骨組織的體外研究發(fā)現(xiàn)IGF-Ⅰ基因[1], 現(xiàn)階段研究發(fā)現(xiàn)IGF-Ⅰ基因具有調(diào)控細胞代謝、促進細胞增殖、保護腸道黏膜屏障、促進動物生長發(fā)育等多種生物學功能[2]。魚類營養(yǎng)狀況可影響IGF-Ⅰ基因表達水平, 從而影響其氮代謝[3], 尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)的IGF-Ⅰ基因表達與其生長速率呈現(xiàn)明顯正相關性[4], 外源IGF-Ⅰ蛋白對半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)幼魚的生長有積極的促進作用[5]。近年來, 魚類IGF-Ⅰ基因的生理功能, 表達調(diào)控越來越受關注。

寬鰭鱲(Zacco platypus)為南方山區(qū)一種溪流性小型魚類, 其肉質(zhì)鮮美, 營養(yǎng)豐富, 深受大家喜愛,形成了一定養(yǎng)殖規(guī)模[6]。在養(yǎng)殖過程中發(fā)現(xiàn)其在生長速度上存在明顯的雌雄差異, 雄性成體普遍大于同批孵化的雌性個體。但目前僅局限于養(yǎng)殖技術和遺傳多樣性研究[7,8]。本研究首次克隆了寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因, 利用熒光原位雜交技術(Fluorescencein situhybridization, FISH)對寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因的表達模式進行了分析, 利用實時熒光定量PCR技術(Quantitative Real-time PCR, RT-qPCR)探究不同性別寬鰭鱲各時期不同組織中IGF-Ⅰ基因表達水平相對差異, 探究寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因在其生長發(fā)育過程中對其性二態(tài)的現(xiàn)象所產(chǎn)生的影響。提高寬鰭鱲繁育效率有著巨大的經(jīng)濟效益, 分子標記技術是提高遺傳育種效率的有效輔助手段, 本研究旨在為寬鰭鱲的育種和人工繁育提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來自浙江省麗水市鋒魚養(yǎng)殖場分別取幼魚期5月齡、7月齡和成魚期12月齡、18月齡的雌雄魚各5尾, 規(guī)格在2—30 g。記錄體質(zhì)量、體長等指標后, 取腦、脾、腎、性腺、肝和心臟組織置于1.5 mL凍存管中經(jīng)液氮速凍后–80℃保存。剪取少量寬鰭鱲尾鰭組織, –20℃無水乙醇保存。

主要試劑: RNA提取試劑(TaKaRa)、TA克隆載體pMD19-T、SMARTTMRACE試劑盒購于寶日醫(yī)生物技術有限公司, DNA提取試劑購自上海生工生物技術有限公司; PCR反應試劑、UltraSYBR Mixture、去基因組cDNA合成試劑盒均購于北京康為世紀生物科技有限公司, PCR引物的合成及測序委托上海生工生物技術有限公司完成。

1.2 寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因的克隆

采用傳統(tǒng)酚氯仿抽提法提取寬鰭鱲肝臟總RNA, 參照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄, 獲得cDNA一鏈。Blast比對GenBank中與寬鰭鱲同屬鯉科的草魚(Ctenopharyngodon idella)和鯉(Cyprinus carpio)等近緣物種IGF-Ⅰ基因cDNA序列, 根據(jù)其保守區(qū)域設計引物IGF-Ⅰ-C, 以寬鰭鱲cDNA為模板進行同源片段的擴增。25 μL反應體系; 94℃5min; 94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 2min, 30個循環(huán);72℃延伸5min。得到單一條帶后回收PCR產(chǎn)物直接進行正反向測序。根據(jù)測序結果Primer Premier 5設計RACE引物, 以寬鰭鱲cDNA為模板, 利用引物IGF-Ⅰ-A-F1/R1, 進行高保真PCR擴增, 電泳后將得到的單一條帶進行切膠回收, 以pMD19-T為載體進行TA克隆, 選取陽性轉化子送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。DNAMAN 6.0軟件拼接得到寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因的cDNA全長, 利用ORFfinder查找完整的開放閱讀框(ORF), 根據(jù)拼接的序列設計包含起始密碼子的上游引物IGF-Ⅰ-ORF-F和包含終止密碼子的下游引物IGF-Ⅰ-ORFR, 以寬鰭鱲cDNA為模板擴增基因的完整開放閱讀框進行驗證。

根據(jù)測序所得寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因的cDNA序列設計8對特異性引物(表 1), 克隆寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因全序列, PCR反應體系為25 μL體系, 最佳退火溫度通過溫度梯度PCR得出, 延伸時間根據(jù)產(chǎn)物長度變化, 每1000 pb延伸1min。PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.3 寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因的生物學分析

DNASTAR 7.0進行序列拼接獲得全長; DNA-MAN 6.0軟件翻譯堿基序列得到氨基酸序列; E×PASy在線protparam程序分析氨基酸的有關物理參數(shù);bioinf程序結合predictprotein程序分析蛋白質(zhì)二級結構; MEGA 6.0進行系統(tǒng)進化分析, 分別用ClustalX和MEGA 6.0進行多重序列比對和系統(tǒng)進化分析,采取鄰位相接法, Boot-strap重復1000次計算各分枝的置信度, 構建寬鰭鱲與鳙(Aristichthys nobilis)、鳡(Elopichthys bambusa)等17種魚類的NJ系統(tǒng)進化樹。

表 1 IGF-Ⅰ基因引物序列Tab. 1 IGF-Ⅰ gene primer sequence

1.4 RT-qPCR分析

用RNAiso Plus(TaKaRa)分別提取寬鰭鱲肝、脾、腎、腦、心臟和性腺組織RNA, 用核酸定量儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量和完整性。HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit試劑反轉錄合成cDNA。根據(jù)寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因的開放閱讀框cDNA序列, Primer Premier 5設計合成正反向特異熒光定量引物IGF-Ⅰ-Q, 并且以內(nèi)參基因EF1α作為對照。

RT-qPCR分析用2×UltraSYBR Mixture(High ROX)進行。每樣做3個重復, 采用2–ΔΔCt方法分析所得數(shù)據(jù), 計算IGF-Ⅰ基因在各個組織中的相對表達水平。用SPSS 21軟件進行SNK法進行多重比較檢驗, 以及基因相對表達水平與雌雄寬鰭鱲成魚體長的偏相關關系。

1.5 組織切片HE染色

根據(jù)RT-qPCR結果, 取雌雄寬鰭鱲性腺與肝臟組織, 4%甲醛固定組織, 常規(guī)梯度乙醇脫水, 環(huán)保型生物透明劑透明, 石蠟包埋, 制作連續(xù)切片, 切片厚6—8 μm, HE染色。切片標本置OLYMPUS BX51顯微鏡(配冷光源數(shù)碼相機OLYMPUS DPT0)下觀察、拍照。

1.6 熒光原位雜交

取HE染色相同部位的連續(xù)切片, 二甲苯溶液脫蠟3次, 乙醇按梯度浸洗10次; 加入PBS, 切片置于空氣中。試管中加入40 mL 2×SSC預熱, 加K酶消化溶液后37℃水浴20min, 2×SSC漂洗3次;乙醇按梯度浸洗10次。載玻片上滴加70 μL雜交液,探針濃度10 μm, 序列為: 5′-CTCTCCCGTTCGCTA AATCTCACTTGGATTGATAGAACATGACCTA CATCCTGC-DIG-3′; 封片, 雜交儀上95℃反應5min, 37℃反應14h。撕封片膠, 按5×SSC溶液梯度洗片, 加1×PBS后甩干, 滴加封閉液后吸干, 用羅丹明抗—地高辛抗體孵育1h; 1×PBS洗3次; 滴加FITC-TSA試劑, 避光室溫反應5min。后TBST洗3次×10min, PBS洗1次5min; 利用DAPI染液進行細胞核復染色, 避光孵育8min, 沖洗后滴加抗熒光淬滅封片劑封片。切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

2 結果

2.1 IGF-Ⅰ基因的克隆、測序及鑒定

測序拼接獲得全序列13707 bp, 其堿基組成為:A+T占61.13%, C+G占38.87%。與GenBank中鯉和草魚IGF-Ⅰ基因的DNA序列進行比對分析, 相似度分別為83%和92%, 因此可認為所獲得的序列為寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因序列。將該序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫, 獲得登錄號MT364420。寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因包含4個內(nèi)含子、5個外顯子。5個外顯子長度分別為222、160、182、36和829 bp; mRNA序列長度為2036 bp, 其中ORF區(qū)長度486 bp, 5′-非翻譯區(qū)250 bp,3′-非翻譯區(qū)1300 bp。寬鰭鱲IGF-Ⅰ蛋白由161個氨基酸組成。

E×PASy在線protparam程序分析寬鰭鱲IGF-Ⅰ蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為17.93 kD, 理論等電點(Isoelectric point, pI)為9.20, 分子式: C766H1217N237O229S16。其中, 絲氨酸(Ser)含量最高, 為9.9%。帶負電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)12個, 帶正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys) 22個。脂肪族氨基酸指數(shù)為57.52。經(jīng)過蛋白質(zhì)序列分析, 寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因氨基酸預測無跨膜結構。

寬鰭鱲IGF-Ⅰ前體肽由信號肽、成熟肽、E肽三部分組成。其中信號肽44個氨基酸, 成熟肽70個氨基酸, E肽47個氨基酸; 成熟肽由B、C、A和D四個區(qū)域組成, 氨基酸個數(shù)分別為29、12、21和8。IGF-Ⅰ蛋白的各個結構域之間的相似性有較大的差異, 成熟肽中B結構域和A結構域的保守性最高,A結構域完全一致。寬鰭鱲成熟肽存在CysB6、CysB18、CysA6、CysA7、CysA11和CysA20六個半胱氨酸殘基。其中B結構域與A結構域之間形成2個二硫鍵, 而A結構域的內(nèi)部形成1個二硫鍵。在寬鰭鱲B區(qū)域也含有保守的IGF-Ⅰ受體識別序列(PheB23-TyrB24-PheB25殘基)。C結構域和D結構域的保守性相對較差, 但C結構域在列舉的5種鯉科魚類(表 2)中完全一致。E肽的長度表明寬鰭鱲IGF-Ⅰ屬Ea-2型。

2.2 IGF-Ⅰ基因外顯子及其編碼氨基酸序列的結構比較

Clustal X與Blast結果顯示, 寬鰭鱲IGF-Ⅰ氨基酸序列與草魚相似度為98%, 與牙鲆(Paralichthys olivaceus)同源性為67.5%, 與彈涂魚(Boleophthalmus pectinirostris)同源性為64.17%, 與尖吻鱸(Lates calcarifer)同源性為66.49%, 與鯉科其他魚類同源性在90%—98%。

將寬鰭鱲和草魚兩種鯉科魚類的IGF-Ⅰ基因和另外3科的3種魚類進行比較, 寬鰭鱲和草魚IGF-Ⅰ基因編碼區(qū)序列長度均為486 bp, 且4個外顯子中編碼氨基酸的堿基長度完全相同, 編碼蛋白由161個氨基酸組成。鯉科和另外3科的IGF-Ⅰ基因差別主要集中在第三外顯子, 其中彈涂魚科、牙鲆科和尖吻鱸科魚類的第三外顯子比鯉科魚類多69—75個堿基序列, 導致編碼的氨基酸也有所增加。NJ樹顯示寬鰭鱲與鯉科其他魚類聚為一支, 與鯰形目鮰科親緣關系較近, 與鱸形目尖吻鱸科親緣關系最遠(圖 1)。

2.3 寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因表達分析

RT-qPCR檢測表明,IGF-Ⅰ基因在寬鰭鱲肝、性腺、心、脾、腦和腎組織中均有表達, 肝中的表達水平顯著高于其他組織(P＜0.05), 其次為脾、精巢、卵巢、腎、心, 腦的表達水平最低。肝和脾組織IGF-Ⅰ mRNA在寬鰭鱲整個發(fā)育時期始終維持較高表達水平(圖 2)。處于繁殖期的12月齡成魚性腺中IGF-Ⅰ mRNA表達量顯著高于5月齡和7月齡幼魚和18月齡的成魚, 且精巢中IGF-Ⅰ mRNA的表達水平顯著高于卵巢(P＜0.05, 圖 3A)。繁殖期后雌雄性腺中IGF-Ⅰ mRNA表達水平快速回落至低水平。而肝組織IGF-Ⅰ mRNA表達水平基本不受繁殖期影響(圖 3B)。

寬鰭鱲的個體生長存在雌雄差異, 從幼魚期[5月齡, 雌魚(52.144±0.58) mm, (2.51±0.34) g, 雄魚(68.281±0.82) mm, (5.55±0.45) g]到成魚期[12—18月齡, 雌魚(131.352±0.54) mm, (13.76±0.42) g,雄魚(150.235±0.61) mm, (17.41±0.51) g]時, 雄魚個體均顯著大于雌魚(P<0.05)。這一現(xiàn)象與寬鰭鱲IGF-Ⅰ mRNA在雄魚中表達水平顯著高于雌魚呈現(xiàn)關聯(lián)性。IGF-Ⅰ mRNA表達水平與雌雄寬鰭鱲體長的偏相關系數(shù)為0.946(P<0.001)。

2.4 寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因組織定位

熒光原位雜交顯示, 寬鰭鱲肝臟IGF-Ⅰ基因融合的綠色熒光主要分布于細胞質(zhì)中, 與細胞核的藍色熒光位置分離, 這表明寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因表達為胞漿陽性, 呈全胞質(zhì)性分布, 少數(shù)為核陽性, 即藍色熒光處基本無綠色熒光信號重疊(圖 4)。

HE染色顯示處于繁殖期的性成熟寬鰭鱲精巢,各小葉腔中充滿精子(SP), 精核呈藍紫色, 直徑約1—2 μm。繁殖期后的性成熟寬鰭鱲精巢處于Ⅵ期性腺, 精巢萎縮, 小葉腔內(nèi)精子已基本排空(圖 5A、5C)。繁殖期的卵巢中主要由第Ⅴ時相卵母細胞組成, 但仍具有一定數(shù)量的第Ⅳ時相卵母細胞(圖 5E),第Ⅴ時相卵母細胞游離于卵巢腔中, 卵膜外的二層卵泡膜(FT)脫落。繁殖期后的卵巢呈萎癟的囊狀,表面血管充血并能看見未產(chǎn)出的卵粒, 其中有的卵粒的卵黃已經(jīng)被吸收。切片顯示, 卵巢中主要由第Ⅱ、Ⅲ時相卵母細胞和空濾泡(EF)組成, 少量未排出卵正被吸收、退化(圖 5G)。

表 2 寬鰭鱲與其他魚類IGF-Ⅰ基因外顯子和內(nèi)含子的比較Tab. 2 The comparison of the exon and intron of IGF-Ⅰ gene among Zacco platypus and other fish species

圖 1 基于IGF-Ⅰ氨基酸序列構建的寬鰭鱲及其他魚類系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of Zacco platypus and other fish based on IGF-Ⅰ amino acid sequence

圖 2 雌雄寬鰭鱲全時期IGF-Ⅰ基因相對表達水平比較Fig. 2 Relative expression of IGF-Ⅰ gene in male and female Zacco platypus

寬鰭鱲精巢組織中IGF-Ⅰ基因表達主要集中在精母細胞(SC), 間質(zhì)細胞和精子中沒有檢測到陽性信號, 卵巢組織中IGF-Ⅰ基因表達主要集中在卵泡膜和卵泡液(FF)中(圖 5E、5F), 繁殖期后精巢和卵巢IGF-Ⅰ基因陽性信號減弱(圖 5B、5D), 肝臟胞漿中IGF-Ⅰ基因表達陽性信號比性腺更為強烈(圖 4和圖 5), 與RT-qPCR的結果相符。

3 討論

3.1 寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因序列分析

本研究克隆得到的寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因全序列為13707 bp, 包含4個外顯子, 5個內(nèi)含子, 其編碼蛋白由161個氨基酸組成, 與鯉科魚類草魚[9]、翹嘴鲌(Culter alburnus)[10]等同源性在90%—98%。

3.2 寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因在繁殖期前后的表達

已有不少學者發(fā)現(xiàn)IGF-Ⅰ在肝臟組織的表達水平最高, 本研究的結果也佐證了肝臟是魚類IGF-Ⅰ蛋白的主要分泌部位[11—16]。在其他魚類的IGF-Ⅰ基因研究中,IGF-Ⅰ在性腺中表達水平較其他組織均比較低[10,11]。本研究發(fā)現(xiàn)12月齡恰好經(jīng)歷性成熟[17]的寬鰭鱲性腺中IGF-Ⅰ表達水平遠遠高于其他月齡。為了探究影響IGF-Ⅰ表達變化的因素,本研究分別在繁殖前期(5月齡和7月齡)、繁殖期(12月齡)、繁殖后(18月齡)不同組織中IGF-Ⅰ表達水平動態(tài)監(jiān)測。結果顯示處于繁殖期的性成熟寬鰭鱲性腺中IGF-Ⅰ表達水平顯著上升, 繁殖期過后回落至最低值。肝組織IGF-Ⅰ的表達水平隨著月齡增長的波動變化不大, 總體處于較高的水平。

熒光原位雜交和HE切片顯示, 寬鰭鱲肝組織中IGF-Ⅰ基因雜交信號顯示多為胞漿陽性, 呈全胞質(zhì)性分布, 少數(shù)為核陽性。在精巢組織中, 精母細胞存在IGF-Ⅰ基因信號, 卵巢組織中IGF-Ⅰ基因表達主要集中在卵泡膜和卵泡液中。處于繁殖期的寬鰭鱲性腺處于Ⅴ期, 繁殖期后的性腺有明顯的萎縮現(xiàn)象, 為Ⅵ期。有學者發(fā)現(xiàn)魚類IGF-Ⅰ基因能調(diào)節(jié)卵母細胞的增殖活性及其分化[13]并促進精子發(fā)生[18—20], 調(diào)節(jié)類固醇的新陳代謝, 產(chǎn)生或活化生殖相關激素[21,22]。

3.3 魚類生長激素(GH)與性激素的協(xié)同作用

圖 3 IGF-Ⅰ基因相對表達量Fig. 3 Relative expression level of IGF-Ⅰ gene

IGF-Ⅰ主要來源于肝臟, 其合成依賴于垂體GH的分泌和營養(yǎng)狀況。GH是腦垂體前葉分泌的單一肽鏈蛋白質(zhì)激素, 具有廣泛的生理功能, 能影響幾乎所有類型的組織和細胞。GH的大部分生物效應都是由肝臟、腎臟等組織依賴GH產(chǎn)生的IGF-Ⅰ所介導的。此外, 許多肝外組織IGF-Ⅰ的合成也受GH和其他組織特異性激素及營養(yǎng)因子的影響。GH、IGF-Ⅰ等基因組成的GH/IGF軸在魚類個體生長中起著關鍵的作用[23]。

有研究表明IGF-Ⅰ基因表達水平與GH和性激素濃度之間存在高度相關性[24]。馬蘇大馬哈魚(Chum salmon)[25]在洄游時血液中的IGF-Ⅰ的含量呈上升趨勢, 此時它同腦垂體性腺機制協(xié)同作用,促進了性腺的成熟, 從而促使其洄游到淡水中產(chǎn)卵,隨后, 血液中的IGF-Ⅰ含量呈現(xiàn)下降趨勢直到下一次洄游周期的開始。條紋鱸(Morone chrysops×Morone saxatile)[26]的性腺在每年的3月成熟, 同時血液中雌性激素和雄性激素達到一年中最高水平,GH和IGF-Ⅰ具有同樣的變化。

3.4 寬鰭鱲性二態(tài)現(xiàn)象

雄性寬鰭鱲由于在繁殖期具有鮮艷的體色而被作為一種觀賞魚。性成熟的雄性個體臀鰭鰭條尤為發(fā)達; 尾鰭叉形, 下葉稍長; 體色鮮艷, 背部灰黑, 腹部銀白, 體側有10—13條藍色的垂直條紋。處于繁殖期的雄性個體吻部、鰓蓋骨、臀鰭鰭條上會出現(xiàn)錐狀珠星[27]。因此, 寬鰭鱲繁殖期性腺組織中IGF-Ⅰ基因增量表達, 可能有調(diào)節(jié)生殖相關激素分泌和促進雄性體色和珠星等第二性征顯現(xiàn)的作用, 以達到完成生殖行為, 適應種群繁衍的需要。

結合所測量形態(tài)學數(shù)據(jù), 我們推測雄性寬鰭鱲性腺中IGF-Ⅰ在其發(fā)育過程中的高表達是雄性成體大于雌性成體的原因之一。同屬溪流性魚類的馬口魚也存在雄性成體大于雌性成體的性二態(tài)現(xiàn)象[28], 造成這種現(xiàn)象的原因可能是溪流性魚類所屬棲息環(huán)境的特殊性。雄大于雌有利于雄性在湍急的水流中追逐配偶, 提高受精和繁殖的成功率關,較大的雄性魚存在明顯的爭斗優(yōu)勢, 因而獲得較多的繁殖后代的機會及提供給后代較好的保護[29—31]。

圖 4 寬鰭鱲肝臟IGF-Ⅰ基因熒光原位雜交及DAPI核染色Fig. 4 Distribution of Zacco platypus IGF-Ⅰ gene in liver tissue and nuclear DAPI stain

圖 5 寬鰭鱲性腺繁殖期前后對比Fig. 5 Comparison of Zacco platypus gonad before and after breeding

4 結論

綜上所述, 本研究克隆了寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因全序列, 發(fā)現(xiàn)其在肝臟中高表達, 同時發(fā)現(xiàn)繁殖期性腺中IGF-Ⅰ基因的高表達現(xiàn)象。熒光原位雜交技術定位顯示IGF-Ⅰ基因在肝組織中呈全胞質(zhì)性分布, 在性腺組織的精母細胞、卵泡膜及卵泡液中陽性表達。寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因表達模式具有性別差異性, 推測精巢中IGF-Ⅰ在繁殖期的高表達是寬鰭鱲雄性成體大于雌性成體的原因之一, 為寬鰭鱲的性二態(tài)和人工繁育的研究提供參考資料。