金魚(yú)etv2基因的克隆及在雌核發(fā)育單倍體和自交二倍體胚胎中的差異表達(dá)

張瓊宇 胡海星 唐云云 羅湘玲 孫遠(yuǎn)東

(1. 永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院公共基礎(chǔ)學(xué)部, 永州 425100; 2. 長(zhǎng)沙環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境科學(xué)系, 長(zhǎng)沙 410004;3. 湖南科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 湘潭 411201)

在脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中, 循環(huán)系統(tǒng)是最早建立并行使功能的器官系統(tǒng)之一。有效的血液循環(huán)為各組織器官提供了必需的氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、激素和代謝產(chǎn)物, 是胚胎生長(zhǎng)發(fā)育和存活的前提[1]。

ETS轉(zhuǎn)錄因子家族成員都包含一個(gè)高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域, 即ETS結(jié)構(gòu)域。它由約85個(gè)氨基酸殘基組成, 能夠特異性識(shí)別并結(jié)合含有GGAA/T的DNA核心序列從而調(diào)控基因的表達(dá)[2]。在脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)生過(guò)程中, 至少有13個(gè)ETS轉(zhuǎn)錄因子在造血或內(nèi)皮細(xì)胞譜系中表達(dá), 它們通過(guò)激活或抑制下游基因的表達(dá)在造血和血管發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3,4]。其中, ETV2(Ets variant 2), 又稱(chēng)ER71/Etsrp, 是成血液血管干細(xì)胞(Hemangioblast)和內(nèi)皮祖細(xì)胞最早表達(dá)的標(biāo)志物之一[5,6]。etv2基因突變的小鼠(Mus musculus)由于造血和血管生成受阻而死于胚胎發(fā)育的第9.5天[5,7]。在斑馬魚(yú)(Danio rerio)胚胎中etv2突變或注射反義嗎啡林寡核苷酸(Morpholino)敲降etv2可抑制所有已知血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá), 在受精后24h(24hpf)之前幾乎沒(méi)有血管內(nèi)皮細(xì)胞和髓系細(xì)胞的分化[6,8,9]。在斑馬魚(yú)胚胎中, 過(guò)表達(dá)斑馬魚(yú)、人(Homo sapiens)源或鼠源etv2均可特異性上調(diào)成血液血管干細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和髓系細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá), 促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞和髓系細(xì)胞的生成[6,9,10]。此外, 在爪蟾(Xenopus tropicalis)胚胎中過(guò)表達(dá)etv2也出現(xiàn)類(lèi)似結(jié)果[11]。這些研究結(jié)果表明ETV2的功能在不同脊椎動(dòng)物胚胎中十分保守, 是造血和內(nèi)皮細(xì)胞分化發(fā)育最早階段所必需的轉(zhuǎn)錄因子。

在魚(yú)類(lèi)中, 采用人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育或者雄核發(fā)育可獲得只遺傳母本或者父本基因組的單倍體個(gè)體[12]。各種人工誘導(dǎo)的魚(yú)類(lèi)單倍體在胚胎發(fā)育過(guò)程中絕大部分都呈現(xiàn)出“單倍體綜合癥”, 水腫、心血管畸形和循環(huán)障礙是其中的主要表現(xiàn)[13—16]。因此, 人工誘導(dǎo)的魚(yú)類(lèi)單倍體為研究脊椎動(dòng)物循環(huán)系統(tǒng)發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制提供了獨(dú)特的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。目前, 有關(guān)魚(yú)類(lèi)單倍體循環(huán)系統(tǒng)發(fā)育異常的報(bào)道主要局限于形態(tài)描述, 尚未對(duì)其產(chǎn)生機(jī)制進(jìn)行深入研究。金魚(yú)(Carassius auratus)具有由隱性基因編碼的雙尾性狀, 可以通過(guò)具有單尾顯性性狀的近緣?mèng)~類(lèi)遺傳失活的精子刺激金魚(yú)卵子進(jìn)行雌核發(fā)育, 然后利用金魚(yú)雙尾的遺傳性狀在胚胎發(fā)育早期準(zhǔn)確鑒定雌核發(fā)育單倍體胚胎[17,18]。故此, 我們選擇金魚(yú)為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物, 探究單倍體胚胎循環(huán)系統(tǒng)發(fā)育異常的分子機(jī)制。本研究克隆了金魚(yú)etv2基因, 分析了其在胚胎和成體組織中的表達(dá)模式以及在雌核發(fā)育單倍體與自交二倍體早期胚胎發(fā)生中的表達(dá)差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料

金魚(yú)紅帽品系和雄性野生鯉(Cyprinus carpioL.)取自湖南省水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)踐教學(xué)示范中心。分離1齡金魚(yú)性腺(卵巢或精巢)、腦、腎臟、肝臟、心臟、脾臟和肌肉等多種組織樣品, 分別在液氮中快速冷凍后, 保存于–80℃冰箱備用。

1.2 金魚(yú)雌核發(fā)育單倍體和自交二倍體胚胎的獲得

金魚(yú)繁殖季節(jié), 用紫外線照射鯉精液, 完全破壞其遺傳物質(zhì), 利用處理后的精子人工誘導(dǎo)金魚(yú)成熟卵子的雌核發(fā)育, 得到雌核發(fā)育單倍體胚胎; 自交二倍體金魚(yú)胚胎通過(guò)人工授精獲得, 具體方法按先前的文獻(xiàn)進(jìn)行[18]。雌核發(fā)育單倍體和自交二倍體來(lái)自同一條雌魚(yú)。金魚(yú)受精卵于(20±0.5)℃孵育,受精后3—5min用0.25%的胰蛋白酶去膜。由于紅帽金魚(yú)具有編碼雙尾的隱性基因, 而鯉具有編碼單尾的顯性基因, 所以金魚(yú)和鯉的雜合二倍體胚胎是單尾的, 而金魚(yú)雌核發(fā)育單倍體是雙尾的。如果鯉精子遺傳物質(zhì)未被紫外線破壞, 那么利用其使金魚(yú)卵子受精所得胚胎為雜合二倍體, 在體節(jié)形成早期具有尾柄細(xì)長(zhǎng)的單尾表型, 而不是尾柄短鈍的雙尾表型。根據(jù)這一表型特征, 即可通過(guò)體視鏡觀察將少量雜合二倍體胚胎從單倍體胚胎中剔除。所有金魚(yú)雌核發(fā)育單倍體胚胎都在攝食期前死亡。

取不同發(fā)育時(shí)期的雌核發(fā)育單倍體和自交二倍體胚胎, 包括32細(xì)胞期、1K細(xì)胞期、尾芽期、6體節(jié)期、14體節(jié)期、20體節(jié)期、25% OVC (Otic vesicle closure, 耳囊閉合期)、35% OVC和96hpf,用于RNA提取或整胚原位雜交。

1.3 RNA提取和cDNA第一條鏈的獲得

利用TRIzol(Invitrogen)分別提取金魚(yú)各成體組織以及不同發(fā)育時(shí)期雌核發(fā)育單倍體和自交二倍體胚胎材料的總RNA。瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)測(cè)定RNA完整性和濃度。采用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)合成cDNA第一條鏈。

1.4 金魚(yú)etv2編碼區(qū)片段的克隆和全長(zhǎng)cDNA序列的獲得

利用鯉科魚(yú)類(lèi)的同源性, 根據(jù)GenBank中斑馬魚(yú)etv2/etsrp基因(DQ021472)編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)合成引物E-F和E-R(表 1), 以14體節(jié)期金魚(yú)自交二倍體胚胎RNA逆轉(zhuǎn)錄所獲得的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖 1)。目的片段回收純化后, 進(jìn)行亞克隆和序列測(cè)定。使用NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中Blast功能對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析, 確認(rèn)其是否為金魚(yú)etv2基因的cDNA序列。

表 1 本研究所使用的PCR引物Tab. 1 Primers used in this study

根據(jù)已獲得的部分etv2基因cDNA序列設(shè)計(jì)合成特異的3′-RACE和5′-RACE引物(表 1), 然后分別利用3′-Full RACE Core Set(TaKaRa)和SMART?RACE cDNA Amplification Kit(Clonetech)試劑盒擴(kuò)增etv2基因的3′和5′序列(圖 1), 具體操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、克隆和測(cè)序, 再與之前已獲得的部分cDNA序列進(jìn)行拼接即得到金魚(yú)etv2基因的全長(zhǎng)cDNA序列, 將所得序列提交至GenBank。

1.5 生物信息學(xué)分析

運(yùn)用DNASTAR 7軟件拼接金魚(yú)etv2基因cDNA序列、確定開(kāi)放閱讀框并預(yù)測(cè)其編碼氨基酸序列。Protparam tool(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)蛋白分子量、等電點(diǎn)和各種氨基酸含量。利用SMART在線工具(http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)域。使用CLUSTAL Omega在線服務(wù)(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo)和DNAMAN 5.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)。利用MEGA 7軟件以鄰近法 (Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.6 RT-PCR和熒光實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)分析etv2基因的表達(dá)

設(shè)計(jì)合成特異引物E-S和E-A(表 1), 利用半定量RT-PCR分析etv2在金魚(yú)不同發(fā)育階段以及不同器官組織中的表達(dá)情況。設(shè)計(jì)qRT-PCR引物ERS和E-RA(表 1)檢測(cè)etv2的相對(duì)表達(dá)量。PCR反應(yīng)及檢測(cè)在ABI公司的Prism7500 Sequence Detection System上進(jìn)行。為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性, 對(duì)每一種樣品的分析都重復(fù)4次。反應(yīng)條件為: 50℃ 2min;95℃ 10min; 95℃ 15s, 60℃ 45s, 40個(gè)循環(huán)。以金魚(yú)β-actin作為內(nèi)參基因,etv2基因的相對(duì)表達(dá)量采用Livak和Schmittgen[19]提出的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法2–??Ct,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示。采用SPSS 19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析, 多組間兩兩比較采用Tukey’s多重比較檢驗(yàn),P<0.05表示存在顯著性差異。

1.7 整胚原位雜交和冰凍切片

利用特異性引物E-F1和E-R1(表 1)通過(guò)RTPCR擴(kuò)增etv2基因部分cDNA序列。所得DNA片段克隆到pEGM-T載體(Promega)中, 構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)亞克隆測(cè)序后用限制性?xún)?nèi)切酶NotⅠ(TaKaRa)進(jìn)行線性化處理, 然后以此為模板利用T7 RNA多聚酶(Roche)合成地高辛標(biāo)記的反義RNA探針。整胚原位雜交方法按照先前的文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行[20]。已完成原位雜交檢測(cè)后的胚胎經(jīng)4%多聚甲醛固定后,再用OCT(SAKURA)包埋, 于–21℃下進(jìn)行冰凍切片。

2 結(jié)果

2.1 金魚(yú)etv2基因cDNA結(jié)構(gòu)及預(yù)測(cè)的氨基酸序列

利用RT-PCR在14體節(jié)期金魚(yú)自交二倍體胚胎的RNA中擴(kuò)增出一段長(zhǎng)約930 bp的DNA片段。測(cè)序后BLAST分析結(jié)果顯示該片段與斑馬魚(yú)etv2 cDNA序列高度相似, 故可以確定其為金魚(yú)etv2部分cDNA序列。隨后根據(jù)該序列設(shè)計(jì)特異性嵌套引物, 通過(guò)5′-RACE和3′-RACE獲得了金魚(yú)etv2基因的5′和3′端cDNA序列(圖 1), 拼接后即得全長(zhǎng)cDNA序列。金魚(yú)etv2基因cDNA全長(zhǎng)1531 bp, 包括5′非編碼區(qū)64 bp, 3′非編碼區(qū)351 bp, 其開(kāi)放閱讀框(ORF)為1116 bp, 編碼371個(gè)氨基酸, 其中第244到327位氨基酸為ETS轉(zhuǎn)錄因子家族所特有的ETS結(jié)構(gòu)域。預(yù)測(cè)的ETV2蛋白分子量約為41592.92 Da, 等電點(diǎn)為5.68, 氨基酸組成中絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)含量最多。所得的金魚(yú)etv2基因全長(zhǎng)cDNA序列Gen-Bank登錄號(hào)為MK766456。

2.2 同源性分析和分子進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

圖 1 金魚(yú)etv2全長(zhǎng)cDNA克隆所用引物擴(kuò)增范圍示意圖Fig. 1 Primer positions for cloning the full length etv2 cDNA of goldfish

對(duì)比金魚(yú)、斑馬魚(yú)、熱帶爪蟾、鼠、牛(Bos taurus)和人等6種脊椎動(dòng)物的ETV2氨基酸序列發(fā)現(xiàn), 金魚(yú)ETV2與斑馬魚(yú)ETV2的相似性最高, 達(dá)86.9%, ETS結(jié)構(gòu)域的相似性為100%; 金魚(yú)ETV2與熱帶爪蟾ETV2的相似性為31.6%, ETS結(jié)構(gòu)域的相似性為83.3%; 金魚(yú)ETV2與鼠、牛和人等哺乳類(lèi)ETV2的相似性分別為25.2%、25.5%和25.5%,ETS結(jié)構(gòu)域的相似性均為60.7%?？梢?jiàn), 除了C端的ETS結(jié)構(gòu)域之外, ETV2蛋白的其余部分在不同物種之間相似性較低, 具有較大差異。鄰近法構(gòu)建金魚(yú)ETV2與斑馬魚(yú)、熱帶爪蟾、鼠、牛和人中同系物的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) (圖 2)。進(jìn)化樹(shù)顯示ETV2進(jìn)化關(guān)系與ETS1和ETS2分開(kāi)。金魚(yú)和斑馬魚(yú)ETV2親緣關(guān)系最近, 首先聚類(lèi)為一支, 進(jìn)而與脊椎動(dòng)物其他物種的ETV2聚類(lèi)形成一個(gè)大的分支。

2.3 金魚(yú)胚胎中etv2基因的時(shí)空表達(dá)模式

為了了解金魚(yú)自交二倍體胚胎正常發(fā)育過(guò)程中etv2基因的時(shí)空表達(dá)模式, 利用半定量RT-PCR檢測(cè)了金魚(yú)未受精卵以及自交二倍體胚胎32細(xì)胞期、1K細(xì)胞期、尾芽期、6體節(jié)期、14體節(jié)期、20體節(jié)期和25% OVC等不同發(fā)育階段的etv2表達(dá)情況(圖 3a)。結(jié)果顯示, 在未受精卵、32細(xì)胞期和1K細(xì)胞期沒(méi)有檢測(cè)到etv2表達(dá); 從尾芽期開(kāi)始,etv2有微量表達(dá); 在6體節(jié)期、14體節(jié)期、20體節(jié)期和25% OVC,etv2表達(dá)水平較高。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,etv2基因在尾芽期表達(dá)水平最低, 在之后的發(fā)育時(shí)期表達(dá)水平逐漸升高, 20體節(jié)期達(dá)到最高水平, 25% OVC的表達(dá)水平低于20體節(jié)期(圖 3b)。

在體節(jié)產(chǎn)生之前, 整胚原位雜交沒(méi)有檢測(cè)到明顯的etv2表達(dá)信號(hào)(數(shù)據(jù)未顯示)。在體節(jié)形成后,可以看到etv2特異性表達(dá)于前側(cè)板中胚層(Anterior lateral plate mesoderm, ALPM)和后側(cè)板中胚層(Posterior lateral plate mesoderm, PLPM)中, 胚胎前端的etv2表達(dá)信號(hào)在索前板處匯合(圖 4a)。隨著胚胎的發(fā)育,胚胎后部的etv2表達(dá)信號(hào)進(jìn)一步向尾部延伸。14體節(jié)期,etv2在胚胎的前部、軀干和后部?jī)蓚?cè)的成血管細(xì)胞中表達(dá)十分明顯(圖 4b—d); 在PLPM區(qū)域可以看到一部分胚胎軀干和尾部表達(dá)etv2的成血管細(xì)胞由體節(jié)之間從胚胎兩側(cè)向中線遷移(圖 4c黑色箭頭所示), 而ALPM 區(qū)域的成血管細(xì)胞保持兩側(cè)定位不會(huì)向中線遷移(圖 4e); 胚胎頭部前端的表達(dá)信號(hào)逐漸消失(圖 4d), 但在胚胎尾部腹側(cè)出現(xiàn)表達(dá)信號(hào)(圖 4d白色箭頭所示)。20體節(jié)期, 在前側(cè)板中胚層、預(yù)定前主靜脈和總主靜脈以及尾芽旁的成血管細(xì)胞中有很強(qiáng)的etv2表達(dá)(圖 4f); 背主動(dòng)脈中也可見(jiàn)明顯的etv2表達(dá)信號(hào)(圖 4g)。在25% OVC, 軸向血管、頭部雙側(cè)原始靜脈(Primordial hindbrain channel, PHBC)以及尾部靜脈叢可見(jiàn)etv2的表達(dá)(圖 4h)。在35% OVC, 大部分軸向血管中的etv2表達(dá)信號(hào)消失, 僅部分頭部血管和后主靜脈有微弱表達(dá), 但尾部靜脈叢及部分尾部體節(jié)間血管仍清晰可見(jiàn)(圖 4i)。在96hpf, 未見(jiàn)明顯的etv2表達(dá)信號(hào)(數(shù)據(jù)未顯示)。

2.4 金魚(yú)etv2 mRNA在成體組織中的分布

以未受精卵為陰性對(duì)照、14體節(jié)期為陽(yáng)性對(duì)照, 利用半定量RT-PCR方法檢測(cè)etv2基因在腦、心臟、腎臟、肝臟、脾臟、肌肉、卵巢和精巢等8種組織中的表達(dá)(圖 3c)。結(jié)果表明, 在金魚(yú)的肝臟、心臟、肌肉和腎臟中可以檢測(cè)到etv2大量表達(dá), 在精巢、腦和脾臟中可以檢測(cè)到etv2少量表達(dá), 在卵巢中沒(méi)有檢測(cè)到etv2表達(dá)。

2.5 金魚(yú)etv2在雌核發(fā)育單倍體與自交二倍體胚胎中的表達(dá)存在明顯差異

圖 2 金魚(yú)ETV2及斑馬魚(yú)、熱帶爪蟾、鼠、牛和人中同源物的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of goldfish ETV2 and its closest zebrafish, frog, mouse, cattle and human homologs

已有研究表明,etv2是血管發(fā)生的主調(diào)控基因[21],對(duì)脊椎動(dòng)物脈管系統(tǒng)和血液循環(huán)的建成具有非冗余和不可替代的功能[22,23]。因此, 比較分析金魚(yú)etv2在雌核發(fā)育單倍體與自交二倍體胚胎發(fā)育早期的表達(dá)情況對(duì)探討雌核發(fā)育單倍體循環(huán)系統(tǒng)發(fā)育異常的分子機(jī)制具有重要意義。然而, 一旦循環(huán)系統(tǒng)建成后,etv2的表達(dá)就將下調(diào)[5,24], 于是我們主要比較了14體節(jié)和20體節(jié)期雌核發(fā)育單倍體與自交二倍體胚胎中etv2的表達(dá)差異。整胚原位雜交結(jié)果顯示, 在14體節(jié)期(圖 5a和圖 5b), 與自交二倍體胚胎相比,etv2的表達(dá)在單倍體胚體中線或/和軀干兩側(cè)部分區(qū)域缺失(85%,n=40); 在20體節(jié)期(圖 5c和圖 5d), 與自交二倍體胚胎相比, 單倍體胚胎中etv2的表達(dá)出現(xiàn)不同程度減弱或/和在軀干及尾部的部分區(qū)域表達(dá)缺失(72.5%,n=40)。qRT-PCR結(jié)果顯示, 14體節(jié)期和20體節(jié)期, 金魚(yú)單倍體胚胎中etv2的表達(dá)均顯著低于自交二倍體(圖 5e和圖 5f)。對(duì)14體節(jié)期已完成etv2反義RNA整胚原位雜交檢測(cè)的金魚(yú)胚胎進(jìn)行冰凍切片, 觀察胚胎橫截面發(fā)現(xiàn),在自交二倍體胚胎中etv2表達(dá)信號(hào)所標(biāo)示的部分成血管細(xì)胞已經(jīng)從胚體兩側(cè)遷移到了脊索下方(圖 5g,箭頭所示), 而單倍體胚胎中成血管細(xì)胞雖已分為內(nèi)側(cè)(圖 5h黑色箭頭)和外側(cè)(圖 5h白色箭頭)兩個(gè)亞群, 但仍保持胚體兩側(cè)定位, 不能遷移到胚體中線。這些結(jié)果表明金魚(yú)胚胎早期發(fā)育的血管發(fā)生階段, 雌核發(fā)育單倍體與自交二倍體中etv2的表達(dá)存在明顯差異。

3 討論

3.1 金魚(yú)etv2序列分析

圖 3 etv2在金魚(yú)中的表達(dá)分析Fig. 3 The expression of etv2 in goldfish

本研究利用RT-PCR結(jié)合RACE-PCR方法克隆了金魚(yú)etv2基因的cDNA全長(zhǎng)序列, 并根據(jù)其ORF序列預(yù)測(cè)了ETV2蛋白的氨基酸序列。利用生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)金魚(yú)ETV2蛋白僅在其C端含有一個(gè)ETS結(jié)構(gòu)域, 除此之外, 沒(méi)有其他明顯可識(shí)別的結(jié)構(gòu)域, 這與其他脊椎動(dòng)物ETV2蛋白類(lèi)似[9]。氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn), 金魚(yú)與斑馬魚(yú)的ETV2氨基酸序列存在較高的相似性, 尤其是兩者的ETS結(jié)構(gòu)域氨基酸序列完全相同。由于ETS結(jié)構(gòu)域的DNA結(jié)合核心序列GGAA/T廣泛存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞譜系特異性表達(dá)基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子中[25], 而不同物種ETV2蛋白的功能十分保守[9], 并且金魚(yú)etv2基因也特異性表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞及其前體中(圖 4),因此可以推測(cè)其在早期血管發(fā)生過(guò)程中也扮演重要角色。

3.2 金魚(yú)etv2表達(dá)模式分析

在斑馬魚(yú)中, 除了cloche/npas4l,etv2比任何已知造血和內(nèi)皮細(xì)胞分化調(diào)節(jié)因子都要更早表達(dá)[26,27]。RT-PCR結(jié)果顯示金魚(yú)etv2從尾芽期開(kāi)始表達(dá), 但是整胚原位雜交只能在體節(jié)形成后才能檢測(cè)到其表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果顯示在20體節(jié)期前etv2的表達(dá)逐漸升高, 而25% OVC時(shí)期明顯下降(圖 3b); 整胚原位雜交也顯示etv2在胚胎出現(xiàn)血液循環(huán)以后表達(dá)下調(diào)(圖 4i), 胚胎發(fā)育至96hpf幾乎無(wú)法檢測(cè)到。這與其他脊椎動(dòng)物胚胎中觀察到的etv2表達(dá)模式類(lèi)似[5,6,8,24,28], 說(shuō)明胚胎發(fā)育時(shí)期,etv2在內(nèi)皮細(xì)胞譜系中瞬時(shí)表達(dá), 提示etv2對(duì)脈管系統(tǒng)的發(fā)育形成具有重要作用, 但對(duì)維持其正常生理功能并不重要。

ETS轉(zhuǎn)錄因子家族成員往往可以在多種成體組織中檢測(cè)到表達(dá)[29], 但在小鼠和人成體中, Northern blot檢測(cè)到etv2/ER71僅在睪丸中特異性表達(dá)[30,31]。與之不同, 我們利用RT-PCR方法在除了卵巢以外的多個(gè)金魚(yú)成體器官組織中都檢測(cè)到了etv2的表達(dá)(圖 3c), 這可能與檢測(cè)方法不同有關(guān)?？紤]到etv2在胚胎發(fā)育過(guò)程中具有瞬時(shí)表達(dá)的特性, 可以推測(cè)etv2可能僅在某些成體組織的一小部分細(xì)胞中被瞬時(shí)激活表達(dá), 由于其mRNA豐度極低,所以Northern blot方法檢測(cè)不到。確實(shí)也有報(bào)道發(fā)現(xiàn), 小鼠成體骨髓組織中etv2表達(dá)水平很低, 但其中分離的Lin-Sca1+c-Kit+(LSK)細(xì)胞中etv2表達(dá)水平較高[32]。

3.3 etv2異常表達(dá)可能是導(dǎo)致金魚(yú)雌核發(fā)育單倍體胚胎血管發(fā)生異常的原因之一

脊椎動(dòng)物的血管發(fā)育包括血管發(fā)生(Vasculogenesis)以及血管重塑(Angiogenesis)兩個(gè)過(guò)程[33,34]。血管發(fā)生是指不依賴(lài)于已有的血管, 從無(wú)到有產(chǎn)生血管的過(guò)程。在斑馬魚(yú)中, 血管發(fā)生始于12hpf(4體節(jié)期), 此時(shí)側(cè)板中胚層中首先特化產(chǎn)生成血管細(xì)胞, 并形成內(nèi)側(cè)和外側(cè)兩個(gè)成血管細(xì)胞亞群。隨后它們大約在14hpf(約10體節(jié)期)和16hpf(約15體節(jié)期)分兩批向胚胎中線遷移, 在內(nèi)胚層上方和脊索下方聚集融合形成沿胚軸排列的血管索, 之后發(fā)育為主要軸向血管。其中, 內(nèi)側(cè)成血管細(xì)胞分化產(chǎn)生背主動(dòng)脈, 而外側(cè)成血管細(xì)胞則分化產(chǎn)生后主靜脈[35,36]。etv2的表達(dá)對(duì)成血管細(xì)胞的分化、遷移以及融合形成功能性血管都十分重要[6,8,35]。在金魚(yú)胚胎14—20體節(jié)期, 可以觀察到雌核發(fā)育單倍體中etv2的表達(dá)在某些軀干部位表達(dá)缺失, 尤其是中線表達(dá)缺失(圖5b、5d和5h), 這說(shuō)明雌核發(fā)育單倍體中成血管細(xì)胞數(shù)量減少, 向中線遷移存在障礙, 軸向血管形成異常。在斑馬魚(yú)中用morpholino敲降etv2, 可導(dǎo)致成血管細(xì)胞不能遷移,etv2在胚胎中線的表達(dá)缺失[6], 說(shuō)明ETV2蛋白的劑量本身可影響etv2基因的表達(dá)模式。我們發(fā)現(xiàn)金魚(yú)etv2在單倍體胚胎14—20體節(jié)時(shí)期的表達(dá)水平較低(圖 5e和圖 5f),這可能是金魚(yú)雌核發(fā)育單倍體中etv2表達(dá)部分缺失、成血管細(xì)胞減少和不能遷移的原因之一。先前研究發(fā)現(xiàn), 由于存在母源甲基化現(xiàn)象, 調(diào)控中胚層特化及向中線匯聚所必需的ntl基因在金魚(yú)雌核發(fā)育單倍體胚胎早期發(fā)育中的表達(dá)受到抑制[37]; 而成血管細(xì)胞起源于中胚層細(xì)胞, 所以可以推測(cè)ntl基因的異常表達(dá)可能間接影響了etv2的表達(dá)模式。此外, 單倍體胚盤(pán)中存在廣泛的非特異性細(xì)胞死亡和細(xì)胞排列紊亂[13], 這也可能是導(dǎo)致成血管細(xì)胞減少和向胚胎中線遷移受阻的重要原因。

圖 4 金魚(yú)etv2在早期胚胎發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)模式Fig. 4 Spatial and temporal expression pattern of goldfish etv2 during early embryogenesis

圖 5 14體節(jié)和20體節(jié)期金魚(yú)雌核發(fā)育單倍體與自交二倍體胚胎中etv2的差異表達(dá)Fig. 5 Differential expression of etv2 in gynogenetic haploid and inbred diploid goldfish embryos at 14-somite stage and 20-smoite stage

總之, 在本研究中, 我們克隆了金魚(yú)etv2/ER71/Etsrp基因的全長(zhǎng)cDNA, 并證明其表達(dá)模式在雌核發(fā)育單倍體和自交二倍體胚胎中存在差異, 為進(jìn)一步揭示單倍體循環(huán)系統(tǒng)發(fā)育缺陷的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。