黑苦蕎麥黃酮的提取及體外抗氧化活性研究

王菲，李穎，簡天琪，張琪，王戰(zhàn)勇

(遼寧石油化工大學 化學化工與環(huán)境學部，遼寧 撫順 113001)

黑苦蕎俗稱苦蕎，學名鞭撻蕎麥，屬雙子葉蓼科蕎麥屬植物，是蕎麥屬中的一種[1-2]。黃酮具有抗氧化、美容、保肝護肝、防癌、抑菌、增免等活性，可作為藥物用于臨床治療[3-7]。故提取黑苦蕎麥黃酮并研究其生物活性，有利于黑苦蕎麥黃酮綜合利用，提高其經(jīng)濟價值。

本文采用超聲輔助溶劑浸提法對黑苦蕎麥黃酮進行提取，利用響應面法優(yōu)化黃酮提取條件。研究黑苦蕎麥黃酮的體外抗氧化活性，為其綜合利用提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

黑苦蕎麥，購自滇之味養(yǎng)生堂；蘆丁標準品、DPPH均為色譜純；硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、抗壞血酸、三羥基氨基甲烷、鄰苯三酚、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯化鐵、硫酸亞鐵、三羥基氨基甲烷、硫代巴比妥酸、鐵氰化鉀、無水乙醇、鹽酸、水楊酸、過氧化氫、三氯乙酸均為分析純；去離子水，實驗室自制。

ALC-1100.2電子天平；Q-250B型多功能高速粉碎機；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋；TDL-80-2B臺式離心機；UV-2800可見分光光度計；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；LGJ-10型冷凍干燥機。

1.2 黑苦蕎黃酮提取

黑苦蕎麥烘干，粉碎，過40目篩，黑苦蕎麥粉末0.50 g，按一定液料比加入一定體積分數(shù)的乙醇溶液，在一定超聲功率下處理一定時間，接下來在一定水浴溫度下浸提一定時間，取出后離心，取上清液。

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法測定黃酮含量[8-9]，吸光度與黃酮含量標準曲線方程為：y=0.393 0x-0.007 4，R2=0.999 3。得率公式如下：

式中X——從方程中算得的提取液中黃酮質(zhì)量，mg；

M——樣品質(zhì)量，g。

1.3 黑苦蕎黃酮體外抗氧化實驗

1.3.1 對DPPH的清除效果[10-11]量取9份 0.2 mmol/L DPPH 2 mL，倒入不同濃度樣液1 mL，補充95%乙醇到4 mL，混合均勻，靜置30 min。以水為參比，在517 nm處測樣品AS，用VC作陽性對照。用95%乙醇作空白，測AC，按下面公式計算清除率。

清除率=(AC-AS)/AC×100%

式中AC——空白吸光度測定值；

AS——樣品吸光度測定值。

1.3.2 對·O2-的清除效果 根據(jù)文獻[11-13]進行實驗。用水為參比，在320 nm處測樣品AS，做3個平行。以1 mL重蒸水替代樣品做空白，測AC，用VC為陽性對照。計算清除率。

1.3.3 對·OH的清除效果 ·OH利用Fe2+和H2O2的反應來制備，產(chǎn)生的·OH與水楊酸反應，生成有顏色的物質(zhì)，根據(jù)文獻[11，14]進行實驗。以水作參比，在510 nm測樣品AS。用1 mL重蒸水替代樣品做空白，測AC，用VC作陽性對照。計算清除率。

1.3.4 還原力的效果 根據(jù)文獻[11，15]考察還原力。取1 mL黃酮樣液進行實驗，用水作參比，在700 nm處測樣品AS?？瞻讓嶒炗? mL蒸餾水取代樣品，測AC，用VC作陽性對照。還原力按下式計算。

還原力=AS-AC

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇濃度的影響 準確稱取樣品粉末0.5 g，按液料比30∶1 mL/g加入濃度分別為40%，50%，60%，70%，80%，90%(V/V)的乙醇溶液，在100 W下超聲5 min，于40 ℃水浴下浸提30 min，測定各個吸光度，計算得率，結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇濃度的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration

由圖1可知，隨乙醇濃度的增加，黃酮得率先增大，后減小，在70%時達到最大。乙醇濃度在某一范圍內(nèi)可以提高黃酮的提取效率，但是超過這個范圍就不能增加得率，這與相似相溶原理有很大關系。

2.1.2 料液比的影響 準確稱取樣品粉末0.5 g，分別按液料比20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1 mL/g，加入50%乙醇，混勻后，在100 W下超聲5 min，于40 ℃水浴下浸提30 min，結(jié)果見圖2。

圖2 液料比的影響Fig.2 Effects of ratio of material to liquid

由圖2可知，隨液料比增大，黃酮得率先增大后減小。說明合適的液料比有助于有效成分快速溶出，料液比50∶1 mL/g時得率最大。

2.1.3 超聲功率的影響 準確稱取樣品粉末0.5 g，按液料比30∶1 mL/g加入50%乙醇溶液，分別在不同超聲功率下處理5 min，于40 ℃水浴下浸提30 min，結(jié)果見圖3。

圖3 超聲功率的影響Fig.3 The effect of ultrasonic power

由圖3可知，隨超聲功率增加，得率先增加后減小，200 W時達到最大?？赡苁怯捎邳S酮結(jié)構會受到較大功率的破壞；也可能是功率過大，產(chǎn)生的熱量過多，溫度升高，導致乙醇溶液濃度減小。

2.1.4 超聲時間的影響 準確稱取樣品粉末0.5 g，按液料比30∶1 mL/g加入50%乙醇溶液，在100 W下分別超聲1，3，5，7，9，11 min，于40 ℃水浴下浸提30 min，結(jié)果見圖4。

圖4 超聲時間的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time

由圖4可知，超聲時間對黃酮得率影響不太顯著，但當超聲10 min時得率最大。故為了節(jié)約能源，增大得率，采用10 min為宜。

2.1.5 水浴溫度的影響 準確稱取樣品粉末0.5 g，按液料比30∶1 mL/g加入50%乙醇溶液，在100 W下超聲5 min，于不同水浴溫度下浸提30 min，結(jié)果見圖5。

圖5 水浴溫度的影響Fig.5 Effect of extraction temperature

由圖5可知，在50 ℃時達到得率最高，但隨后顯著下降。溫度升高，熱運動加快，得率增大；溫度過高，破壞黃酮結(jié)構，導致待測物損失，且能量消耗亦增大。故以水浴溫度50 ℃提取為宜。

2.1.6 水浴時間的影響 準確稱取樣品粉末0.5 g，按液料比30∶1 mL/g加入50%乙醇溶液，在100 W下超聲5 min，于40 ℃水浴下浸提，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，延長提取時間，黃酮得率增大，40 min 時得率最高。提取時間過長，會造成溶劑揮發(fā)，影響提取效果，同時也造成能量浪費。故選擇40 min為宜。

圖6 水浴時間的影響Fig.6 Effect of extraction time

2.2 響應面優(yōu)化實驗

2.2.1 實驗結(jié)果 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇超聲功率、液料比、乙醇濃度進行響應面優(yōu)化實驗，因素與水平見表1，實驗結(jié)果見表2?；貧w模型方程為：Y=19.23-0.32A-3.200E-003B-0.012C+0.069AB+0.37AC+0.27BC-1.78A2-1.23B2-1.50C2，模型方差分析見表3。

表1 Box-Behnken實驗因素與水平Table 1 The factors and levels ofBox-Behnken experimental

表2 實驗結(jié)果Table 2 Experimental results

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表3可知，本實驗模型極顯著(P<0.000 1，<0.01)，失擬項P值為0.245 7，不顯著，表明此模型與實驗擬合較好，無其他因素的顯著影響。決定系數(shù)R2=0.985 4，表明經(jīng)過二次回歸模型方差分析，有98.54%的理論值能由模型來解釋。模型CV值1.57%很低，即表明該模型精密度高，且所得數(shù)據(jù)準確、可靠，即黑苦蕎麥黃酮的提取實驗可用該模型進行預測。從P值大小可知，各因素的影響強弱為：超聲功率>乙醇濃度>液料比。一次項中A，即超聲功率對得率影響極顯著(P=0.011 6，<0.01)，交互項中AC的影響顯著(P=0.029 8，<0.05)。

2.2.2 響應面圖解析 圖7表示乙醇濃度、液料比、超聲功率在一個因素固定不變的情況下，三個因素中的兩兩相互作用對黃酮提取效果的影響。

圖7 乙醇濃度、液料比、超聲功率及其兩兩相互作用對黃酮得率影響的響應面圖Fig.7 The response surface graph showingthe effects of single factors and their interactionon the yield of flavonoids

由圖7可知，超聲功率與乙醇濃度的交互作用明顯，曲線較陡，這也與表3的方差分析一致。

2.2.3 驗證實驗 響應面軟件給出的提取最適條件為：超聲功率195.40 W，液料比49.95∶1 mL/g，乙醇濃度69.92%時，黃酮得率預測值為19.23 mg/g干重?？紤]到生產(chǎn)實際，條件修整為：超聲功率 200 W，液料比50∶1 mL/g，乙醇濃度70%，重復3次實驗，得率平均值為19.31 mg/g干重，與模型給出的預測值十分接近，表明可以用此模型來模擬實驗，并對黃酮得率進行預測。

2.3 體外抗氧化實驗研究

2.3.1 清除DPPH的效果 由圖8可知，隨黃酮和VC濃度增大，二者對DPPH的清除逐漸增大，而后均趨于平衡，且黑苦蕎麥黃酮對DPPH的清除效果比VC略差，但同樣具有較好的對DPPH清除效果。

圖8 黑苦蕎麥總黃酮和VC對DPPH自由基的清除作用Fig.8 The scavenging effect of flavonoidsand VC on DPPH radical

2.3.2 清除·O2-的效果 由圖9可知，本實驗濃度范圍內(nèi)，清除率與黃酮濃度呈正比，VC亦是。黑苦蕎麥黃酮對·O2-有一定的清除效果，但稍差于VC。

圖9 黑苦蕎麥總黃酮對超氧陰離子自由基清除能力Fig.9 The scavenging effect of flavonoids and VCon superoxide anion radical

2.3.3 清除·OH的效果 由圖10可知，黑苦蕎麥黃酮對·OH有很好的清除作用，且清除率與物質(zhì)濃度成正比，且效果優(yōu)于VC。

圖10 黑苦蕎麥總黃酮對羥基自由基清除能力Fig.10 The scavenging effect of flavonoids and VC onscavenging hydroxyl radicals

2.3.4 還原力的效果 在一定濃度區(qū)間，吸光度值越大，目標物的還原力也就越大。由圖11可知，在濃度100～800 μg/mL之間時，黑苦蕎麥黃酮已與VC的還原力非常接近，表明其對Fe3+具有較好的還原作用。

圖11 黑苦蕎麥總黃酮和VC的還原力Fig.11 The reducing ability of flavonoids and ascorbic acid

由上可知，黑苦蕎麥黃酮表現(xiàn)出較強的體外抗氧化作用，尤其能很好地清除·OH，且優(yōu)于VC。

3 結(jié)論

(1)黑苦蕎麥總黃酮最適提取條件為：乙醇濃度70%(V/V)，液料比50∶1 mL/g，超聲功率200 W，超聲時間10 min，水浴溫度50 ℃，水浴時間40 min。在此條件下，黃酮得率19.31 mg/g干重。

(2)黑苦蕎麥黃酮表現(xiàn)出很好的·OH清除效果，且好于VC；對DPPH、·O2-具有一定清除效果，對Fe3+具有一定還原能力，但效果都比VC略差。