響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取柴胡總皂苷的工藝

姬海剛，楊秀芳，2，惠昱昱，郭林新

(1.陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 西安 710021；2.陜西科技大學(xué) 陜西省輕化工助劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710021)

柴胡為傘科植物柴胡(BupleuremChinenseDC.)或狹葉柴胡(BupleuremscorzonerifoliumWilld)的干燥根，是常用的傳統(tǒng)中藥[1-3]，東北和陜西等地是柴胡的主要產(chǎn)區(qū)[4]。柴胡具有疏散退熱和疏肝解郁等功效[5]，臨床上用于感冒發(fā)熱癥狀[6]。皂苷是柴胡中的主要生物活性成分之一。但是目前對(duì)秦嶺太白山區(qū)柴胡皂苷的提取報(bào)道很少。本文采用乙醇加熱回流提取法通過(guò)Design-Expert軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面提取柴胡總皂苷[7],為合理開(kāi)發(fā)該地區(qū)柴胡的藥用價(jià)值提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

柴胡，采自陜西太白山區(qū)，經(jīng)西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院康永祥教授鑒定為柴胡 (BupleurumChinenseDC.)；香草醛，高純級(jí)；柴胡皂苷a，色譜純；乙醇、甲醇、冰乙酸、高氯酸等均為分析純。

723N可見(jiàn)分光光度計(jì)；Cary 5000 紫外-可見(jiàn)-近紅外分光光度計(jì)；DFY-200C高速萬(wàn)能粉碎機(jī)；DZKW-D-4 電熱恒溫水浴鍋；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

柴胡粉碎過(guò)40目篩。稱取適量的柴胡粉末，置于圓底燒瓶，加入濃度70%的乙醇溶液，料液比 1∶20 g/mL，加熱回流，提取3 h。趁熱過(guò)濾，收集濾液，減壓回收乙醇，得浸膏。測(cè)定柴胡皂苷含量，計(jì)算柴胡總皂苷的得率(%)。

柴胡總皂苷得率=(提取液中柴胡皂苷含量×供試品溶液體積)/柴胡質(zhì)量×100%

1.3 分析方法

1.3.1 供試品溶液的制備 定量稱取浸膏，用甲醇定容于50 mL的容量瓶，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取柴胡皂苷a標(biāo)準(zhǔn)品2.4 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中。

1.3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 精密移取對(duì)照品溶液200 μL，以甲醇為空白對(duì)照，水浴揮干溶劑，加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液200 μL，高氯酸800 μL，在60 ℃水浴中放置15 min。取出，用流動(dòng)水冷卻至室溫，加入冰醋酸5.0 mL，搖勻[8]。在400～800 nm處進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 柴胡總皂苷在不同波長(zhǎng)下的掃描光譜圖Fig.1 Scanning spectra of total saikosaponins of BupleurumChinense DC at different wavelengths

由圖1可知，最大吸收波長(zhǎng)在610 nm，與鐘巧妮等[9]報(bào)道的結(jié)果基本一致。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密移取柴胡皂苷對(duì)照品a溶液0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mL，揮干溶劑，按1.2.3節(jié)的顯色方法操作，在波長(zhǎng)610 nm處用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定溶液的吸光度，以溶液的濃度(C)作為橫坐標(biāo)，吸光度(A)作為縱坐標(biāo)，作圖，得線性回歸方程A=29.667C+0.086 8，R2=0.999 1，線性關(guān)系良好。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑對(duì)柴胡總皂苷得率的影響

不同的提取溶劑對(duì)植物不同成分的提取影響較大，提取溶劑與目標(biāo)成分極性相似時(shí)，則容易提取目標(biāo)成分[10]。本文從綠色環(huán)保的角度考慮，選擇常用的溶劑乙醇與水作為提取溶劑。乙醇濃度40%，料液比1∶20 mg/L，提取時(shí)間60 min，提取溫度 60 ℃，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 提取溶劑對(duì)總皂苷得率的影響Fig.2 Effect of extraction solvent on the yield of total saponins

由圖2可知，用乙醇提取的得率明顯高于水提得率。所以，選擇乙醇作為提取溶劑。

2.2 乙醇濃度對(duì)柴胡總皂苷得率的影響

料液比1∶20 mg/L，提取時(shí)間60 min，提取溫度60 ℃，乙醇濃度的影響見(jiàn)圖3。

圖3 乙醇濃度對(duì)總皂苷得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on yield of total saponins

由圖3可知，當(dāng)乙醇濃度升高時(shí)，柴胡總皂苷的得率增加，但當(dāng)乙醇濃度超過(guò)70%以后，總皂苷得率開(kāi)始下降。這是因?yàn)橛捎谝掖紳舛鹊脑黾?，醇溶性雜質(zhì)和色素等成分溶出以及溶液極性的變化導(dǎo)致總皂苷得率下降[11]。因此，選擇70%。

2.3 料液比對(duì)柴胡總皂苷得率的影響

乙醇濃度70%，提取時(shí)間60 min，提取溫度 60 ℃，料液比的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 料液比對(duì)柴胡總皂苷得率的影響Fig.4 Effect of material/liquid ratio on yield of total saponins

由圖4可知，隨著料液比的增加，柴胡總皂苷的得率上升，當(dāng)料液比<1∶20 g/mL時(shí)，上升的趨勢(shì)較快，說(shuō)明在此料液比的范圍內(nèi)，增大溶劑的量對(duì)總皂苷的得率提升較大。但當(dāng)料液比>1∶20 g/mL時(shí)，繼續(xù)增加溶劑的量對(duì)總皂苷得率的提升較小。因此，選擇料液比1∶20 g/mL。

2.4 提取時(shí)間對(duì)柴胡總皂苷得率的影響

乙醇濃度70%，料液比1∶20 g/mL，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間的影響見(jiàn)圖5。

由圖5可知，延長(zhǎng)提取時(shí)間，總皂苷得率先增加后降低?？傇碥盏寐试?50 min達(dá)到最大值。原因可能是在提取的初始階段，隨著提取時(shí)間的增加，有利于皂苷和其它極性化合物的溶解。然而，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，由于長(zhǎng)期處于溫度較高的環(huán)境，柴胡總皂苷部分分解[12]。因此，選擇150 min。

圖5 提取時(shí)間對(duì)柴胡總皂苷得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on yield of total saponins

2.5 提取溫度對(duì)柴胡總皂苷得率的影響

乙醇濃度70%，料液比1∶20 g/mL，提取時(shí)間150 min，考察提取溫度對(duì)柴胡總皂苷得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 提取溫度對(duì)柴胡總皂苷得率的影響Fig.6 Effect of extraction temperature on yield of total saponins

由圖6可知，提取溫度增加，總皂苷得率先增大后減小，提取溫度60 ℃時(shí),總皂苷得率最高。因?yàn)殡S著溫度的升高，溶劑分子運(yùn)動(dòng)加快，促進(jìn)溶劑分子更快進(jìn)入柴胡細(xì)胞內(nèi)。所以在60 ℃之前，隨著溫度的升高，溶劑分子運(yùn)動(dòng)加快，柴胡總皂苷的得率增加。但當(dāng)溫度超過(guò)60 ℃時(shí)，部分柴胡皂苷在較高溫度下分解，總皂苷得率下降[13]。因此，選擇60 ℃。

2.6 響應(yīng)曲面法優(yōu)化柴胡總皂苷的提取條件

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)Box-Behnken進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用Design-Expert軟件對(duì)乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度進(jìn)行優(yōu)化，因素與水平見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)曲面的因素水平表Table 1 Factor level table of design response surface

表2 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of response surface experiment

2.6.1 建立回歸方程 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)Design-Expert軟件進(jìn)行分析，得回歸方程Y=3.01-0.11A-0.071B-0.027C+0.1D-0.11AB-0.18AC+0.28AD+2.500E-003BC-0.063BD-0.047CD-0.31A2-0.38B2-0.32C2-0.56D2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析[14]Table 3 Analysis of experimental results

由表3可知，回歸方程的F值為 33.59，平方和為 3.74，自由度為14，均方為0.27，其顯著水平P<0.01，說(shuō)明該模型非常顯著。

由表3還可知，A、AD、A2、B2、C2、D2對(duì)柴胡總皂苷得率的影響較大，達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，B、D、AB、AC達(dá)到顯著水平(P<0.05)，因素C(P=0.313 3>0.05)不顯著。

2.6.2 響應(yīng)曲面分析 將提取時(shí)間、提取溫度、乙醇濃度、料液比中任意兩個(gè)因素設(shè)為定值時(shí)，分析另外兩個(gè)因素間的交互作用及對(duì)總皂苷得率的影響[15]，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 各因素交互作用的響應(yīng)曲面圖Fig.7 Response surface of interaction of various factors

2.6.3 工藝條件優(yōu)化 通過(guò)優(yōu)化得到的工藝參數(shù)：乙醇濃度68.6%，溫度60.58 ℃，提取時(shí)間 149.78 min，料液比1∶19.61 g/mL，總皂苷得率3.02%。為簡(jiǎn)化工業(yè)化的操作，將工藝參數(shù)調(diào)整為：乙醇濃度69%，溫度61 ℃，提取時(shí)間150 min，料液比1∶20 g/mL，并在該條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，總皂苷平均得率3.12%，理論值與預(yù)測(cè)值相差0.1%。說(shuō)明該工藝參數(shù)可靠。

3 結(jié)論

用乙醇提取柴胡總皂苷的最佳工藝參數(shù)為：乙醇濃度69%，提取溫度61 ℃，提取時(shí)間150 min，提取料液比1∶20 g/mL。在該條件下，柴胡總皂苷的提取率3.12%。