黔產(chǎn)商陸醇提物對HeLa 細胞增殖的影響

岳重群 楊 錦 李 哲 吳靜瀾 韓 偉*

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽550025）

商陸（Phytolaccae Radix）為商陸科植物，藥用部位為商陸Phytolacca acinosa Roxb. 或垂序商陸Phytolacca americana L.的干燥根，秋季至次春對藥材進行采收[1]。商陸是貴州省常見的中藥材，合理的開發(fā)利用商陸資源是十分必要的。研究發(fā)現(xiàn)，商陸中含有多種化學(xué)成分，包括：三萜皂苷類、黃酮類、酚酸類、甾醇類、多糖類等[2]。中醫(yī)認為商陸具有逐水消腫，通利二便，外用解毒散結(jié)的功能[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，商陸具有抗腫瘤、抗炎、提高免疫力、利尿等作用[3]。本文前期查閱文獻發(fā)現(xiàn)，商陸中主要抗腫瘤活性成分以商陸多糖、商陸皂苷、商陸抗病毒蛋白等研究較多[4-7]，而對商陸脂溶性成分的抗腫瘤作用研究較少。因此，本文研究商陸脂溶性成分對人宮頸癌HeLa 細胞活性作用，通過研究豐富商陸抗腫瘤活性成分，為進一步研究商陸提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

AG135 型分析天平（美國 Mettler Toledo 公司）、BHC-1300IIA/B2 型生物安全柜（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、H150i 型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）、BE2000 型倒置熒光顯微鏡（重慶澳浦光電技術(shù)有限公司）、TGL16M型高速冷凍離心機（湖南湘儀離心機有限公司）、SB-4200D 型超聲清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）、DNM-9606 型酶標儀（上海珂淮儀器有限公司）、F3 型單道移液器（美國Thermo 公司）、F3型30～300 μL 八道移液器（美國Thermo 公司）。

1.2 試劑

MTT 試劑（Biosharp 公司）、PBS（Biosharp 公司）、DMEM培養(yǎng)基（美國Gbico 公司）、胎牛血清（美國Gbico 公司）、青霉素- 鏈霉素（Beyotime Biotechnology 公司）、胰蛋白酶（Beyotime Biotechnology 公司）。

1.3 細胞株

人宮頸癌HeL a 細胞，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供。

1.4 藥材

商陸采自于貴州中醫(yī)藥大學(xué)校園內(nèi)，經(jīng)中藥鑒定教研室張爽老師鑒定為垂序商陸Phytolacca americana L.。

2 方法

2.1 商陸脂溶性成分的提取和純化

取商陸藥材100 g，搗碎，置于2000 mL 提取瓶中，加800 mL 95 %乙醇后用電熱套加熱提取，2 h 后倒出濾液，商陸濾渣繼續(xù)加600 mL 95 %乙醇提取2 h，提取完后加合并濾液，再將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀后收集樣品。采用AB-8 大孔樹脂（使用前先用95 %乙醇浸泡24 h，使用時用蒸餾水沖洗至無醇味）對商陸提取物進行梯度洗脫（從低濃度到高濃度，洗脫至無顏色再換到另一梯度），分別收集30 %、50 %、70 %、95 %組分樣品，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將收集的各組分溶劑揮干備用。

2.2 HeLa 細胞培養(yǎng)

人宮頸癌HeLa 細胞復(fù)蘇后，培養(yǎng)瓶中加入完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清+1 %青霉素- 鏈霉素+89 %DMEM培養(yǎng)基）進行培養(yǎng)，置于37 C、5 % CO2細胞培養(yǎng)箱中，隔天換液。當細胞在顯微鏡下總數(shù)到80 %左右，PBS 潤洗，加入0.25 %的胰蛋白酶消化細胞2 min，加入等量的完全培養(yǎng)基，1000 rpm 離心5 min，倒掉上清液，細胞沉淀加入完全培養(yǎng)基，移液器輕輕吹散，傳代或進行后續(xù)實驗。

2.3 MTT 法測定脂溶性成分對HeLa 細胞增殖的影響

待HeLa 細胞達到對數(shù)期，將細胞進行上述操作，細胞濃度稀釋到6×104/mL，采用八道移液器將細胞加入96 孔板中；待細胞貼壁后，除空白對照組外，30 %、50 %、70 %、95 %組分四種樣品，每種分別配制終濃度為1、5、10、25、50、100 μg·mL-1的樣品加入細胞中，每個濃度設(shè)置6 個復(fù)孔；待48 h 后避光加入10 μL 5mg·mL-1的MTT 溶液，放置培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h，然后吸取每孔細胞上清液，加入DMSO 100 μL，搖床震搖10 min，在490 nm 處測定吸光度OD 值，計算細胞存活率。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理，各組差異采用ANOVA檢驗分析，所得數(shù)據(jù)以x ±SD 表示，P < 0.05 表示顯著性差異，P < 0.01 表示極顯著性差異。

3 結(jié)果與討論

3.1 30 %組分對HeLa 細胞增殖的影響

在0～100 μg·mL-1范圍內(nèi)，48 h 后隨著商陸各組分濃度的增加，藥物對HeLa 細胞存活率有抑制作用，濃度在25 μg·mL-1其對細胞產(chǎn)生抑制作用，當濃度＞50 μg·mL-1時，細胞存活率明顯降低，30 %商陸各組分對HeLa 細胞的抑制程度與劑量相關(guān)，結(jié)果見表1。

表1 30%商陸組分對HeLa 細胞存活率的作用

3.2 50 %組分對HeLa 細胞增殖的影響

當50 %商陸組分濃度為25 μg·mL-1其對細胞產(chǎn)生抑制作用，當濃度＞50 μg·mL-1時，此濃度跟30 %對細胞存活率相同，并呈現(xiàn)濃度依賴型抑制細胞，結(jié)果見表2。

表2 50%商陸組分對HeLa 細胞存活率的作用

3.3 70 %組分對HeLa 細胞增殖的影響

70 %商陸組分對細胞損傷程度較強，在低濃度為5 μg·mL-1時，就對腫瘤細胞具有較好的抑制作用，同時隨著濃度增加，細胞存活率下降，結(jié)果見表3。

表3 70%商陸組分對HeLa 細胞存活率的作用

3.4 95 %組分對HeLa 細胞增殖的影響

95 %商陸組分同樣對細胞損傷程度較強，濃度為5 μg·mL-1時，就對腫瘤細胞具有抑制作用，同時隨著濃度增加，細胞抑制率上升，結(jié)果見表4。

表4 30%商陸組分對HeLa 細胞存活率的作用

4 結(jié)論

本文對商陸藥材進行95 %乙醇提取，提取物中脂溶性成分含量較多；通過AB-8 大孔樹脂梯度洗脫，得到30 %、50 %、70%、95 %四種不同組分。商陸各組分對HeLa 細胞的增殖均有一定的抑制作用且抑制程度與劑量呈正相關(guān)。其中70 %和95 %組分具有的抗腫瘤活性且較30%和50 %組分抗腫瘤活性強，在濃度為5 μg·mL-1時，即對腫瘤細胞增殖有抑制作用，且隨著濃度增加抑制作用加強。因此，本文推測商陸藥材中脂溶性成分也發(fā)揮著抑制腫瘤生長作用，其中生物堿類、有機酸類等脂溶性成分也是從商陸中分離出來[7]，如：阿魏酸有文獻報到其具有抑制人胃癌SGC-7901 細胞增殖及調(diào)節(jié)相關(guān)凋亡基因的作用[8]；β- 谷甾醇可以抑制SGC-7901 細胞生長，促進凋亡，其機制可能跟PI3K/AKT/m TOR 通路誘導(dǎo)細胞自噬作用相關(guān)[9]。因此，研究相關(guān)脂溶性成分對于抗腫瘤作用也是十分有意義的。通過對商陸醇提物各純化組分的抗腫瘤活性研究，可以深化對商陸的科學(xué)認識，為商陸的綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。