芥甘雜種后代F1和F2形態(tài)學和細胞遺傳學研究

趙 彤，謝 晉，殷 婷，余青蘭，才吉巴毛，趙志剛

(青海大學農林科學院，青海 西寧 810016)

【研究意義】甘藍型油菜(Brassicanapus.，AACC，2n=38)是白菜型油菜(B.rapa，AA，2n=20)和甘藍(B.oleraces，CC，2n=18)進行天然種間雜交，最后通過染色體天然加倍形成的異源四倍體[1-4]，其產量高，適應性廣，抗逆性強，是新中國成立之后的主栽品種[5-6]。但由于甘藍型油菜無天然的野生種和后期人工定向選擇，造成遺傳多樣性日益匱乏，遺傳基礎越發(fā)狹窄[7-8]。利用不同類型的油菜進行種間雜交，選育優(yōu)良后代，是發(fā)展油菜產業(yè)，培育優(yōu)質甘藍型油菜行之有效的方式。【前人研究進展】目前國內外關于油菜與不同種或屬之間的材料進行遠緣雜交已有許多成功的范例。Wen等[9]以白菜和黃籽甘藍為親本進行雜交，成功得到新材料黃籽甘藍型油菜。王學芳等[10]成功通過白菜類蔬菜(B.campestris, 2n=2x=AA=18)的紫菜苔、小白菜和大白菜與甘藍型油菜 (B.napus, 2n=4x=AACC=38)進行雜交，得到了新型早熟甘藍型油菜新種質。Li等[11]用埃塞俄比亞芥與白菜型油菜雜交獲得三倍體(ABC)，該三倍體可作為蕓薹屬植物優(yōu)良性狀轉移的橋梁。McNaughton[12]首次通過四倍體飼料甘藍與四倍體飼料蘿卜遠緣雜交，得到了成功導入蘿卜抗根腫病基因的異源四倍體。但是遠緣雜交大多存在受精前雜交不親和，受精后雜種夭亡或不育以及后代瘋狂分離等障礙[13]，為了提高蕓薹屬遠緣雜交成功率，Zhang等[14]利用胚搶救培養(yǎng)3種白菜型油菜分別和甘藍雜交后的雜種后代，培養(yǎng)基(MS+1.0 mg·L-1BA + 0.1 mg·L-1NAA)在3種組合的胚搶救中均表現(xiàn)很好的促進作用，之后通過秋水仙素加倍，從而獲得甘藍型油菜。Pelletier[15]，Yamanaka[16]等通過原生質體融合的方法獲得了蘿卜與蕓薹屬雜種。Leino等[17]利用體細胞融合技術對細胞質誘導的雄性不育擬南芥與甘藍型油菜雜交，最終篩選出恢復系植株。富貴等[19]通過甘藍品種與“大黃油菜”為雙親遠緣雜交，利用胚搶救技術，獲得了甘藍型油菜的新種質?！颈狙芯壳腥朦c】遠緣雜交已成為獲得新品種，改良現(xiàn)有品種的重要方法。通過種間雜交將芥菜型油菜(B.juncea，AABB，2n=36)的抗病、抗蟲、分枝性強、黃種皮等優(yōu)良遺傳特性導入甘藍型油菜，可改良現(xiàn)有甘藍型油菜的品質，豐富油菜種質資源。Roy[18]等為將芥菜型油菜B基因組上抗黑脛病的基因導入甘藍型油菜，利用均抗根腫病的兩親本甘藍型油菜與芥菜型油菜雜交，培育出的雜種一代成株期抗黑脛病。Wan等[19]也通過遠緣雜交得到了廣泛變異的甘芥雜種，豐富了甘藍型油菜的種質資源。為提供芥菜型油菜和甘藍型油菜雜交后代細胞學證據(jù)以及為育種提供更加豐富的變異材料，本研究以芥菜型油菜嚴小村芥與甘藍型油菜青油14號為親本，以正反雜交試驗得到的F1和正交F1自交得到的F2代為供試材料，對其進行了形態(tài)學和細胞學分析，并且進行了雜種后代花粉育性以及雜交親和性分析，為拓寬甘藍型油菜的遺傳基礎提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

芥菜型油菜品種為嚴小村芥，甘藍型油菜品種為青油14 號。材料均由青海省農林科學院春油菜研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 性狀調查 分別于苗期、蕾期、開花期、成熟期，調查植株的葉型、葉色、葉的大小，葉片表面有無蠟粉、刺毛性狀，花蕾形態(tài)，雌雄蕊發(fā)育情況，并進行拍照記錄。

1.2.2 花粉的可染性 晴天采集雜交后代新開的2朵花，取其長、短雄蕊各1枚，將花粉均勻涂在載玻片上，用1 %醋酸洋紅染液染色，輕輕蓋上蓋玻片，在顯微鏡的10倍鏡頭下觀察計數(shù)。大、圓且被染為紅色的為可育花粉，小而癟且未能染色的為不育花粉。

1.2.3 雜交親和性試驗 正交：嚴小村芥×青油14號；反交：青油14號×嚴小村芥。

每個雜交組合選取4～8株，記錄授粉花蕾數(shù)與雜交時間，成熟時單獨收取，調查結角數(shù)，結籽率，計算結角率與親和指數(shù)，參照劉忠松、徐愛遐等[21-22]，以衡量雜交結實力高低。

結角率=收獲的角果數(shù)/授粉花朵數(shù)×100 %

親和指數(shù)=飽滿的籽粒數(shù)/授粉花朵數(shù)

1.2.4 細胞學觀察 有絲分裂觀察。于晴天上午8:30-10:30在田間取幼嫩花蕾(2～3 mm)，置于冰盒帶回挑取子房，用 8-羥基喹啉避光暗處理3.5 h后，置于卡諾固定液(乙醇與冰醋酸體積比為3∶1)中固定24 h以上。觀察時挑取固定好的子房于1 mol/L 的鹽酸中60 ℃水浴6 min左右，單蒸水中漂洗后，用改良的卡寶品紅染色壓片，于顯微鏡下觀察并記錄體細胞染色體數(shù)目。

減數(shù)分裂觀察。于盛花期取幼嫩花蕾置于卡諾固定液中，固定并換洗花蕾直至褪色為白色，4 ℃冰箱保存。挑取幼嫩花蕾的花藥于1 mol/L 的鹽酸中 60 ℃水浴3 min，取出后放置于單蒸水中漂洗后，用卡寶品紅染色壓片，在顯微鏡下觀察花粉母細胞(Pollen Mother Cells)減數(shù)分裂各時期的染色體行為。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 利用Excel和SAS軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 芥甘雜交親和性分析

以芥菜型油菜嚴小村芥與甘藍型油菜青油14號為親本分別做正反交，統(tǒng)計雜交后的結角數(shù)與所得種子數(shù)(表1)，芥×甘雜交共授粉175朵花蕾獲得1320粒種子，親和指數(shù)7.54，甘×芥雜交共授粉139朵花蕾獲得13粒種子，親和指數(shù)為0.09，較前人研究報道的0.1～0.5低，說明本試驗中兩種材料反交時可交配性較差。以芥菜型油菜作母本與甘藍型油菜雜交，雜交親和性顯著高于以甘藍型油菜作母本的反交，與前人報道結論相一致[23-24]。

表1 芥菜型油菜與甘藍型油菜雜交親和性分析

2.2 雜種F1和F2代形態(tài)學分析

2.2.1 雜種F1形態(tài)學分析 以芥菜型油菜嚴小村芥與甘藍型油菜青油14號為親本，分別做正反雜交試驗獲得F1種子，其正反交得到的真雜種植株形態(tài)如圖1，植株形態(tài)為介于雙親的中間型，基部葉面有刺毛，莖稈粗壯，葉片大，羽狀半深裂，分枝性強，且株高均高于雙親。以青油14號為母本得到的雜種苗期葉片羽裂較深，而母本為嚴小村芥的雜種植株的分枝數(shù)比反交雜種多，且花的形態(tài)更偏向母本，花瓣不重疊，呈四瓣分離，反交雜種的花更偏向父本，花瓣有部分重疊，正反交雜種無較大的差異。

2.2.2 雜種F2形態(tài)學分析 如圖2所示,F2群體植株表型分離明顯，每株材料形態(tài)都不同，大部分植株偏甘藍型，占總群體的64.8 %，中間型占總群體的28.2 %，偏芥菜型占總群體的7.7 %。偏甘藍型的植株葉片表面較光滑平展，有缺刻或全緣，偏芥菜型與中間型的植株基部葉片具有刺毛，葉面稍有皺縮。同時，F(xiàn)2花色也出現(xiàn)了淡黃色及乳白色，且花為乳白色的植株雄蕊沒有花粉，表現(xiàn)為雄性不育。

2.3 芥甘雜交后代花粉育性分析

對芥甘雜交后代F1和F2代材料進行花粉可染性分析(表2)，F(xiàn)1代中共調查了10株，其花粉可染率范圍為17.09 %～45.81 %；F2中共調查了22株，花粉可染率范圍為0～91.88 %，其中有一株沒有花粉，表現(xiàn)雄性不育。

2.4 雜種F1和F2代細胞遺傳學分析

2.4.1 F1細胞遺傳學分析 正反交F1染色體組成均為AABC，2n=37(圖3)，F(xiàn)1減數(shù)分裂終變期(圖4-A)染色體配對以二價體為主，正交F1二價體數(shù)目變化為8～16個，出現(xiàn)12Ⅱ頻率最高，除二價體外，絕大部分PMCs均還出現(xiàn)1～3個數(shù)目不定的單價體、多價體。反交F1二價體數(shù)目變化為8～16個，出現(xiàn)14Ⅱ頻率最高，除二價體外，絕大部分PMCs均出現(xiàn)1～4個數(shù)目不定的單價體，多價體。正反交PMCs均在中期Ⅰ(圖4-B)、后期Ⅰ(圖4-C，圖5-C)出現(xiàn)異常，染色體落后的頻率高，還出現(xiàn)染色體橋。后期Ⅰ(表2)染色體分離方式主要以18：19，其余以17∶20、21∶16、17∶1∶19等。正交中觀察到處于四分體時期的PMCs 368個，多分孢子占14.13 %，其中五分孢子較多，還出現(xiàn)較少六分和七分孢子，反交中五分孢子占PMCs總數(shù)的5.26 %，六分孢子出現(xiàn)2個。中期Ⅱ、后期Ⅱ也出現(xiàn)許多滯后(圖4-I，圖4-J)，微核(圖4-K，圖5-L，圖5-F，)等現(xiàn)象。

A～D，E～H和I～L分別為親本以及雜種F1植株的幼苗，花和花蕾。從左至右依次為嚴小村芥、嚴小村芥×青油14號F1、青油14號×嚴小村芥F1以及青油14號。M～N分別為嚴小村芥×青油14號F1、青油14號×嚴小村芥F1盛花期植株 A-D, D-H and I-L are young plant, flower, and flower bud of parents and their reciprocal hybrids. The first one is YanXiaoCunJie, and followed by B. juncea × B. napus F1, B. napus× B. juncea F1and Qingyou 14. M-N are mature plants of B. juncea × B. napus F1 and B. napus× B. juncea F1圖1 芥甘雜交親本及正反交雜種F1植株形態(tài)Fig.1 Morphological characters of B. juncea, B. napus and their orthgonal and reciprocal hybrids

A～G為芥甘雜交F2，H～L為BC1；表型觀察，M～P為F2花觀察 A-G are F2 plants, H-L are BC1, M-P are flowers of F2圖2 F2表型及花觀察Fig.2 Phenotype and flower investigation of F2 and BC1

表2 F1和F2代花粉可育性分析

2.4.2 F2細胞遺傳學分析 對F2群體進行子房觀察，24株植株的體細胞染色體數(shù)目均在38條附近(表4)，介于33～45條之間(圖6)。F2減數(shù)分裂終變期染色體配對構型以二價體為主，并且細胞同時有出現(xiàn)不同程度的單價體、三價體、四價體和五價體，部分細胞還出現(xiàn)了六價體。F2PMCs均在減數(shù)第一次分裂和第二次分裂中期、后期出現(xiàn)異常，染色體落后的頻率高。體細胞染色體數(shù)目不同的細胞后期Ⅰ分離方式不同(表5)，終變期平均配對規(guī)律不同(表6)。

染色體數(shù)與甘藍型油菜染色體數(shù)目38 條相同的后代，減數(shù)分裂后期Ⅰ染色體分離方式主要以 18∶20，其終變期染色體行為包括(1-3)Ⅰ+(14-19)Ⅱ+1Ⅲ+1Ⅳ+1Ⅴ+1Ⅵ，出現(xiàn)頻率最高的是1Ⅰ+17Ⅱ+1Ⅲ(26 %)，染色體平均配對規(guī)律為1.07Ⅰ+16.72Ⅱ+0.59Ⅲ+0.26Ⅳ+0.1Ⅴ+0.03Ⅵ。

圖3 F1體細胞染色體Fig.3 Chromosome of F1

A 終變期;B 中期Ⅰ;C 后期Ⅰ;D～H 后期Ⅰ;I 中期Ⅱ;J 后期Ⅱ; K～L 小孢子時期 A Diakinesis;B MetaphaseⅠ;C AnaphaseⅠ;D-H AnaphaseⅠ;I MetapaseⅡ;J AnaphaseⅡ;K-L Microspore stage圖4 正交雜種F1花粉母細胞減數(shù)分裂觀察Fig.4 Observation on meiosis in the pollen mother cells of orthgonal F1 hybrid

A 終變期;B 后期Ⅰ;C 后期Ⅰ;D 中期Ⅱ;E 后期Ⅱ;F 小孢子時期 A Diakinesis;B AnaphaseⅠ;C AnaphaseⅠ;D MetapaseⅡ;E AnaphaseⅡ;F Microspore stage圖5 反交雜種F1花粉母細胞減數(shù)分裂觀察Fig.5 Observation on meiosis in the pollen mother cells of reciprocal F1 hybrid

3 討 論

以芥菜型油菜嚴小村芥與甘藍型油菜青油14號為親本，以正反雜交試驗得到的F1和正交雜種所得F2代為供試材料，對其進行了形態(tài)學和細胞學分析，并且進行了花粉可染性觀察以及雜交親和性分析。

表3 正反交雜種F1 PMCs后期Ⅰ分離方式

A.36 條染色體；B.38 條染色體；C.42條染色體；D.43條染色體 A.36 chromosomes; B.38 chromosomes; C.42 chromosomes; D.43 chromosomes圖6 F2體細胞染色體數(shù)目Fig.6 Chromosome of F2

A. 終變期；B. 終變期；C. 中期Ⅰ；D. 中期Ⅱ；E.后期Ⅰ；F.后期Ⅱ A. Diakinesis; B. Diakinesis; C. MetaphaseⅠ;D. MetapaseⅡ;E. AnaphaseⅠ;F. AnaphaseⅡ 圖7 雜種F2減數(shù)分裂Meiosis in the F2 hybridFig.7 Pollen stainability rate and chromosome number

表4 植株花粉可染率和染色體數(shù)目

表5 芥甘雜種F2減數(shù)分裂染色體行為

表6 芥甘雜種F2終變期染色體平均配對規(guī)律

芥菜型油菜嚴小村芥與甘藍型油菜青油14號為親本得到的雜種F1代和F2代表型差異較大，以芥菜型油菜為母本的雜種和與甘藍型油菜為母本的雜種F1在形態(tài)學上基本一致，大部分形態(tài)性狀超出或介于雙親之間，但在花瓣和葉片等方面表現(xiàn)有些不同，它們分別更偏向于母本。在苗期，F(xiàn)2植株葉片多數(shù)偏中間型，但在開花期，表型又偏向于甘藍型，葉柄抱莖，頂部葉片與甘藍型相似。F2代染色體數(shù)目均在38條左右，表型也接近甘藍型油菜，連續(xù)自交或以甘藍型油菜回交，可以較快得到新型甘藍型油菜。

以芥菜型油菜嚴小村芥與甘藍型油菜青油14號為親本分別做正反交，芥×甘雜交親和指數(shù)7.54，甘×芥雜交親和指數(shù)為0.09，說明以甘藍型油菜為母本不易得到種子，這一結論與陳紀鵬[25]人工合成甘藍型油菜與黑芥種間雜種的結論一致。趙洪朝等[26]以1份芥菜型多室油菜與6份甘藍型油菜雜交，得出為獲得較多飽滿種子，應采用芥×甘的結論。同時，不同基因型的甘藍型油菜品種與不同品種的芥菜型油菜雜交的親和性不同，如甘藍型油菜×埃塞俄比亞芥[27]，但是在甘藍型油菜遠緣雜交中，熊秋芳等[28]證明母本甘藍型油菜的基因型影響較大。

以芥菜型油菜嚴小村芥與甘藍型油菜青油14號為親本分別做正反交，F(xiàn)1體細胞染色體數(shù)目為37條，符合理論值，但是也有2n=38或34、36的報道[29]，其花粉敗育程度高。雜種后代F2表型顯著分離，染色體數(shù)目不定，但大多在38條左右，同時花粉育性有所提高，推測隨著世代的增加花粉育性隨之提高直至恢復正常，提高了選育新型甘藍型油菜的成功率。F2出現(xiàn)了不同于親本的花色，推測可能是因為染色體分布不平衡，同源或部分同源染色體間重組[30]，McClintock[31]在煙草種間雜種的研究中對這一推測進行了證實。該研究中F1、F2世代減數(shù)分裂終變期均有單價體，多價體等異常配對情況，不排除A、B、C部分同源染色體之間在雜種早期世代存在部分同源配對，從而導致遺傳物質在染色體間交換，為創(chuàng)制新型甘藍型油菜、拓寬其遺傳基礎提供了可能。

4 結 論

以芥菜型油菜嚴小村芥與甘藍型油菜青油14號為親本進行正反交，正交相比反交更容易獲得雜交種子，正反交F1體細胞均具有37條染色體，正反雜種植株形態(tài)介于雙親之間，而正交F1植株相比反交F1具有更多的分枝數(shù)。以芥菜型油菜為母本雜種F1自交獲得的F2表型顯著分離，偏甘藍型較多，染色體數(shù)目介于33～45條之間。F2花粉育性提高，自交更易獲得種子，F(xiàn)2植株連續(xù)自交或以甘藍型油菜回交、配合細胞學檢測，可較快獲得新型甘藍型油菜資源。