干擾KISS1基因?qū)ωi卵巢顆粒細(xì)胞功能的影響

陸思羽，何穎婷，周小楓，辛?xí)云?，張愛玲，袁曉龍，張哲，李加?/p>

干擾KISS1基因?qū)ωi卵巢顆粒細(xì)胞功能的影響

陸思羽1，何穎婷1，周小楓1，辛?xí)云?，張愛玲2，袁曉龍1，張哲1，李加琪1

（1廣東省農(nóng)業(yè)動物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實驗室/國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣州 510642；2廣東高校應(yīng)用生態(tài)工程技術(shù)開發(fā)中心/廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣州 510310）

卵泡是卵巢的基本結(jié)構(gòu)和功能單位，其主要功能是排卵和分泌激素。顆粒細(xì)胞能促進(jìn)卵泡發(fā)育，其過度凋亡能抑制卵泡發(fā)育，誘導(dǎo)卵泡閉鎖，進(jìn)而降低雌性動物發(fā)情頻率，影響雌性動物繁殖力?，F(xiàn)已有研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢組織中發(fā)揮著重要作用?！尽垦芯客ㄟ^干擾，以闡釋對豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡、周期及分泌雌激素能力的影響，為完善在豬顆粒細(xì)胞中的分子調(diào)控機(jī)制提供一定的依據(jù)。設(shè)計的干擾片段KISS1-siRNA，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的母豬卵巢顆粒細(xì)胞，通過實時定量PCR（quantitative real time PCR, qRT-PCR）檢測干擾對母豬卵巢顆粒細(xì)胞中磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase, PI3K）信號通路部分基因轉(zhuǎn)錄水平的影響；采用流式檢測法、Annexin V- FITC及ELISA技術(shù)，分別探究干擾對顆粒細(xì)胞周期、凋亡及雌二醇（estradiol, E2）分泌量的影響，最后使用qRT-PCR技術(shù)檢測對雌激素受體及雌激素信號通路關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。在豬顆粒細(xì)胞內(nèi)，干擾后，PI3K通路激活相關(guān)基因、、及轉(zhuǎn)錄水平下降，其中關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低（＜0.05），PI3K通路激活抑制相關(guān)基因、及轉(zhuǎn)錄水平也有所降低；干擾后，顆粒細(xì)胞周期在細(xì)胞分裂間期（G0/ G1）阻斷，細(xì)胞的凋亡率顯著上升，細(xì)胞中E2的濃度顯著降低（＜0.01），雌激素受體和及雌激素通路的基因、、、和轉(zhuǎn)錄水平也相應(yīng)顯著下降（＜0.05）。能夠參與豬顆粒細(xì)胞PI3K和雌激素通路，干擾能夠使卵巢顆粒細(xì)胞阻滯在細(xì)胞分裂間期，促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡，降低顆粒細(xì)胞分泌雌激素的能力，表明對于卵巢顆粒細(xì)胞的分裂與生長、雌激素分泌具有重要作用。

母豬；顆粒細(xì)胞；；PI3K；E2

0 引言

【研究意義】卵巢是母畜繁育的基礎(chǔ)，其主要功能是產(chǎn)生和排出成熟的卵子。卵巢卵泡中的顆粒細(xì)胞能夠分泌性激素，促進(jìn)母畜性征的發(fā)育及維持，卵巢能否健康發(fā)育關(guān)系著母畜繁殖能力的強(qiáng)弱及利用年限的長短[1]。卵泡生長發(fā)育的本質(zhì)是顆粒細(xì)胞增殖和分化[2]，卵泡閉鎖的主要標(biāo)志是顆粒細(xì)胞凋亡，顆粒細(xì)胞能夠為卵巢和卵泡的生長發(fā)育提供促性腺激素受體、類固醇激素、細(xì)胞因子、生長因子等物質(zhì)[3]，顆粒細(xì)胞過度凋亡會導(dǎo)致雌激素分泌減少，孕激素分泌增加[4]等。綜上所述，顆粒細(xì)胞作為卵泡的重要組成部分，其功能會直接影響卵泡的生長發(fā)育，進(jìn)而影響雌性動物的繁殖能力。本研究將顆粒細(xì)胞作為探究卵泡體外發(fā)育的細(xì)胞模型，通過設(shè)計的干擾片段，基于實時定量PCR（quantitative real time PCR, qRT- PCR）試驗證明干擾能夠影響PI3K/AKT通路的信號傳導(dǎo)，并進(jìn)一步在細(xì)胞水平和分子水平探究了干擾對豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡、周期及雌激素分泌能力的影響，為完善調(diào)控顆粒細(xì)胞功能的機(jī)制研究提供了一定的理論基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】1997年Lee通過原位雜交和差異顯示技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)并命名了，該基因位于人類1號染色體1q32-41區(qū)，能夠抑制腫瘤生長[5]，因此可作為區(qū)分轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和非轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的標(biāo)志物[6]。近年來有研究表明，基因在母畜發(fā)情、卵泡生長發(fā)育、排卵等生理過程中起著重要的作用[7]。對成年大鼠使用Kisspeptin治療后，的表達(dá)量與大鼠的排卵數(shù)成正相關(guān)[8-9]，而突變，會導(dǎo)致大鼠和小鼠的卵巢功能衰退，卵泡發(fā)育異常，進(jìn)而阻礙卵泡成熟，影響小鼠卵巢黃體組織的形成[9-10]。此外，當(dāng)小鼠到達(dá)初情期時，和在下丘腦-垂體-性腺軸中的表達(dá)量顯著增高，表明信號可由性腺軸傳導(dǎo)，在哺乳動物中樞和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)中發(fā)揮作用[8]。這些研究結(jié)果表明，在一定程度上影響著母畜的繁殖性能。前期研究已經(jīng)證實過表達(dá)能夠促進(jìn)卵巢卵泡的發(fā)育和排卵[8]，且在卵泡生長發(fā)育的過程中起到重要性作用[7]，但目前干擾在豬卵泡顆粒細(xì)胞中的作用尚不清楚。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase, PI3K）可以磷酸化磷脂酰肌醇[11]，其作為細(xì)胞中典型的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[12-13]，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、增殖和凋亡。PI3K/AKT是調(diào)控原始卵泡激活和發(fā)育的經(jīng)典信號通路，是PI3K/AKT通路的終止信號，在初級和次級卵泡中敲除卵母細(xì)胞的該基因，PI3K/AKT信號通路仍能夠正常激活[14]，敲除成年小鼠卵母細(xì)胞中的，小鼠的原始卵泡在卵泡池就會發(fā)生早衰，且FSH和LH分泌異常，使小鼠喪失生育能力[15]，但是敲除顆粒細(xì)胞中的，能夠減緩顆粒細(xì)胞凋亡[16]，并促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖。此外蔡競等證實等表達(dá)水平下調(diào)能夠抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的活性，抑制顆粒細(xì)胞增殖，進(jìn)而影響卵泡發(fā)育[17]，綜上可知卵巢卵泡的發(fā)育與PI3K/AKT通路活性相關(guān)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】PI3K信號通路與卵巢卵泡的生長發(fā)育密切相關(guān)，筆者前期研究表明過表達(dá)能夠顯著降低豬卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡率，促進(jìn)顆粒細(xì)胞分泌雌二醇（estradiol, E2），顯著上調(diào)PI3K信號通路關(guān)鍵基因及雌激素受體和的mRNA水平[18]，基于干擾豬卵巢顆粒細(xì)胞中基因的表達(dá)，能夠影響PI3K信號通路部分標(biāo)志基因的表達(dá)，我們推測干擾同樣也能夠影響顆粒細(xì)胞功能，因此本研究擬通過干擾，進(jìn)一步闡釋對豬卵巢顆粒細(xì)胞功能的影響機(jī)制。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以長大二元雜母豬卵巢卵泡顆粒細(xì)胞為試驗材料，在轉(zhuǎn)錄水平證實干擾能夠影響PI3K信號通路相關(guān)基因的表達(dá)，并擬在細(xì)胞和分子水平研究干擾對顆粒細(xì)胞凋亡、周期及E2分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

母豬卵巢顆粒細(xì)胞：采集廣州市嘉禾望崗?fù)涝讏龅拈L大二元雜母豬卵巢，迅速置于4℃含2%雙抗（青霉素和鏈霉素）的PBS中，盡快返回實驗室，并迅速分離卵巢顆粒細(xì)胞。

主要試劑：DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、含EDTA的胰酶稀釋液、PBS緩沖液、胎牛血清、青霉素和鏈霉素購自Hyclone（美國）；Lipofectamine?3000轉(zhuǎn)染試劑盒、Opti-MEM?試劑購自Invitrogen（美國）；的干擾片段KISS1-siRNA（CAACAAGAAGTGGGA GCAGAA）及對照Scrambled- siRNA由廣州銳博生物科技有限公司（中國）合成；Trizol、PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒購自TAKARA（日本）；無水乙醇、4%甲醛、氯仿、異丙醇購自廣州鼎國生物有限公司（中國）；SYBR Green qPCR Mix購自Thermo（美國）；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和細(xì)胞周期檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司（中國）；豬雌二醇試劑盒購自江蘇酶免實業(yè)有限公司（中國）；其他均為常規(guī)化學(xué)試劑。

1.2 原代顆粒細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

從屠宰場采集的母豬卵巢，迅速置于4℃含2%雙抗（青霉素和鏈霉素）的PBS試劑中，迅速帶回實驗室，在準(zhǔn)備室用PBS清洗數(shù)次。在細(xì)胞房超凈臺取5 mL DMEM于15 mL離心管，使用鑷子夾取母豬卵巢，用1 mL注射器小心多次吸取卵泡液共2 mL于15 mL離心管（卵泡直徑為3—5 mm）；25℃ 800 r/min離心5 min，棄上清，再加入預(yù)熱的PBS（含1%雙抗），輕柔吹打以重懸沉淀細(xì)胞，清洗沉淀細(xì)胞兩次。先加入10 mL完全培養(yǎng)基（含10%小牛血清和1%雙抗）于75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，再加入5 mL細(xì)胞懸液，輕柔搖晃均勻。將培養(yǎng)瓶置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱，48 h后觀察顆粒細(xì)胞的生長狀況，用PBS清洗顆粒細(xì)胞兩次，加入15 mL的完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h可進(jìn)行后續(xù)相關(guān)試驗。

1.3 顆粒細(xì)胞的接種和轉(zhuǎn)染

鋪板：觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右，用預(yù)熱的PBS（含1%雙抗）清洗顆粒細(xì)胞兩次；使用5 mL 0.25%的胰蛋白酶消化75 cm2培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞3—5 min，快速加入5 mL不完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液）終止消化，25℃ 800 r/min離心5 min；用預(yù)熱的PBS（含1%雙抗）清洗細(xì)胞兩次。將細(xì)胞懸液均勻加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，用完全培養(yǎng)基補(bǔ)充體積，輕柔地?fù)u晃均勻，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

轉(zhuǎn)染：鋪板后細(xì)胞的匯合度達(dá)到80%左右，即可轉(zhuǎn)染。用預(yù)熱的PBS清洗顆粒細(xì)胞兩次，轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamine? 3000試劑盒說明書（每個試驗組設(shè)計4個重復(fù)，使用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行），步驟如下：在滅菌的1.5 mL離心管中加100 μL Opti-MEM和4 μL Lipofectamine? 3000試劑，離心混勻；在新的離心管中依次加入95 μL Opti-MEM、5 μL稀釋好的Scrambled-siRNA和KISS1-siRNA（此時干擾片段及其對照終濃度為50 nmol·L-1）及4 μL P3000TM，離心混勻；將Lipofectamine? 3000混合液加到P3000TM混合液中，離心混勻，在室溫下孵育10 min；在每孔細(xì)胞中加入450 μL不完全培養(yǎng)基及50 μL混合液；轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，6—12 h后換液（防止轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞影響過大）。

1.4 顆粒細(xì)胞RNA抽提

從細(xì)胞中抽提RNA，不需要對細(xì)胞進(jìn)行消化，直接加入Trizol（10 cm2·mL-1）在冰上放置10—15 min，4℃12 000 r/min離心5 min，將含RNA的上清轉(zhuǎn)移至新的RNase-free管，加入氯仿（氯仿﹕Trizol為 1﹕5），激烈震蕩，室溫下放置5 min，4℃12 000 r/min離心15 min，將上層水相小心移至新的RNase- free管，加入異丙醇（異丙醇﹕Trizol為1﹕2），輕微顛倒混勻，室溫下放置10 min，4℃12 000 r/min離心15 min，去上清。加入與Trizol等量的75%乙醇，清洗抽提的RNA，4℃12 000 r/min離心15 min，去上清，此步驟重復(fù)兩次。將RNA于室溫干燥5—10 min，加入30 μL的DEPC水溶解RNA沉淀。

RNA質(zhì)檢：制備濃度為1%的瓊脂糖凝膠，將2 μL RNA樣品與2 μL Loading Buffer混勻，15 V/cm電壓電泳20 min，使用凝膠成像儀拍照，觀察條帶，使用紫外分光光度計檢測樣品OD260/OD280的比值；-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 檢測關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平

RNA反轉(zhuǎn)錄參照TAKARA的PrimerScriptTMRT Reagent Kit說明書。RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（10 μL）：5×PrimeScriptRT Master Mix，2 μL；Total RNA≤500 ng；補(bǔ)充RNase Free dH2O至總體積達(dá)10 μL。RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃15 min，85℃5 s。

參照NCBI公布的序列信息，使用Primer primer 5.0設(shè)計qRT-PCR引物（表1）。以母豬卵巢顆粒細(xì)胞的cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參。qPCR反應(yīng)體系（20 μL）：2×SYBR Green PCR Master Mix，10 μL；PCR Forward Primer，0.6 μmol·L-1；PCR Reverse Primer，0.6 μmol·L-1；cDNA，2 μL；補(bǔ)充dd H2O至總體積達(dá)20 μL。qPCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 min；95℃預(yù)變性5 s，60℃延伸1 min，42個循環(huán)。引物由上海捷瑞生物科技有限公司合成。

表1 定量引物

1.6 顆粒細(xì)胞凋亡檢測

參照江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司的Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行顆粒細(xì)胞凋亡檢測。取細(xì)胞接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右，轉(zhuǎn)染Scrambled-siRNA和KISS1-siRNA于顆粒細(xì)胞培養(yǎng)24 h，PBS清洗細(xì)胞，使用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，再次用PBS溶液清洗細(xì)胞。取0.5 mL 細(xì)胞懸液（約5×105個細(xì)胞），加入500 μL 1×Binding Buffer，加入5 μL Annexin V-FITC，再加入室溫預(yù)熱的5 μL Propidium Iodide，室溫避光孵育5 min，立即用流式細(xì)胞儀檢測分析（每個試驗組設(shè)計3個重復(fù)）。

1.7 顆粒細(xì)胞周期檢測

使用江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司的流式檢測細(xì)胞周期試劑盒，取細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞板，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右，轉(zhuǎn)染Scrambled-siRNA和KISS1-siRNA于顆粒細(xì)胞培養(yǎng)24 h，PBS清洗細(xì)胞，使用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，再次用PBS溶液清洗細(xì)胞。使用70%的乙醇溶液固定細(xì)胞，4℃固定細(xì)胞4 h以上，將固定好的顆粒細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗兩次，室溫2 000 r/min離心5 min，用400 μL的碘化丙啶輕柔重懸細(xì)胞，加入100 μL RNase，4℃避光孵育30 min。24 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測分析（每個試驗組設(shè)計3個重復(fù)）。

1.8 顆粒細(xì)胞上清中E2含量檢測

使用ELISA檢測細(xì)胞上清中E2的含量，參照江蘇酶免實業(yè)有限公司的豬雌二醇ELISA試劑盒說明書。確定標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；取細(xì)胞接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右，轉(zhuǎn)染Scrambled-siRNA和KISS1- siRNA于顆粒細(xì)胞培養(yǎng)24 h，吸取細(xì)胞上清1 000 r/min離心20 min，取50 μL于96孔板即為樣本孔，空白孔不加；用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃孵育30 min，棄去液體，在吸水紙上拍干，每孔加入350 μL的洗滌液，靜置1 min，棄去液體，在吸水紙上拍干，該步驟重復(fù)5次；每孔加入100 μL的辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體（除空白孔），用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃孵育30 min，棄去液體，在吸水紙上拍干；每孔加入350 μL的洗滌液，室溫靜置1 min，棄去液體，在吸水紙上拍干，該步驟重復(fù)5次；每孔加入各50 μL A和B底物，用錫箔紙包裹以避光，37℃孵育15 min；每孔加入50 μL的終止液，在15 min內(nèi)用酶標(biāo)儀A450測定OD值。

1.9 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

每個試驗3—4個生物學(xué)重復(fù)，數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并經(jīng)雙尾T-test檢驗差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。**代表＜0.01，*代表＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 干擾豬KISS1的效果

轉(zhuǎn)染Scrambled-siRNA和KISS1-siRNA（序列：CAACAAGAAGTGGGAGCAGAA）至顆粒細(xì)胞后的qRT-PCR結(jié)果如圖1，KISS1-siRNA組的的表達(dá)水平顯著低于Scrambled-siRNA對照組（＜0.01），結(jié)果表明干擾片段KISS1-siRNA具有良好的干擾效果，可以用于后續(xù)試驗。

* P＜0.05，** P＜0.01。下同 The same as below

2.2 干擾KISS1抑制PI3K信號通路

干擾后，激活PI3K信號通路的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低（＜0.05），轉(zhuǎn)錄水平降低，但差異不顯著（圖2-A）；抑制PI3K通路的和轉(zhuǎn)錄水平顯著降低（＜0.05），的mRNA表達(dá)水平降低，但差異不顯著（圖2-B）。結(jié)果表明，干擾能夠抑制PI3K信號通路部分標(biāo)志基因的表達(dá)。

A. PI3K信號通路激活相關(guān)基因的表達(dá)；B. PI3K信號通路抑制相關(guān)基因的表達(dá)

2.3 干擾KISS1的表達(dá)促進(jìn)顆粒細(xì)胞的凋亡

顆粒細(xì)胞Annexin FITC/PI檢測結(jié)果如圖3，其中Q1區(qū)域為機(jī)械損傷細(xì)胞，Q2（FITC+/PI+）區(qū)域為晚期凋亡或壞死細(xì)胞，Q3（FITC+/PI-）區(qū)域為早期凋亡細(xì)胞，Q4（FITC-/PI-）區(qū)域為活細(xì)胞（圖3-A和B）。KISS1-siRNA組顆粒細(xì)胞的凋亡率顯著高于Scrambled- siRNA對照組（＜0.01）（圖3-C），結(jié)果表明，干擾促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡。

A.轉(zhuǎn)染KISS1-siRNA的流式檢測結(jié)果；B.轉(zhuǎn)染Scrambled-siRNA的流式檢測結(jié)果；C.干擾KISS1促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡

2.4 干擾KISS1的表達(dá)影響顆粒細(xì)胞的細(xì)胞周期

為探究對顆粒細(xì)胞周期的影響，流式檢測結(jié)果如圖4，單因素方差分析證實KISS1-siRNA組處于G1/G0期的顆粒細(xì)胞比例顯著高于Scrambled- siRNA對照組的顆粒細(xì)胞（＜0.01），即干擾后，顆粒細(xì)胞阻滯在分裂間期。

2.5 干擾KISS1的表達(dá)抑制顆粒細(xì)胞分泌E2

顆粒細(xì)胞的主要功能之一是分泌E2，為研究對顆粒細(xì)胞分泌E2能力的影響，ELISA法檢測結(jié)果如圖5，KISS1-siRNA組細(xì)胞上清中E2的濃度顯著低于Scrambled-siRNA對照組（＜0.01），即干擾的表達(dá)，可以抑制顆粒細(xì)胞分泌E2。

圖4 干擾KISS1能夠?qū)㈩w粒細(xì)胞阻滯在分裂間期

2.6 干擾KISS1的表達(dá)能影響雌激素信號通路相關(guān)基因的表達(dá)

干擾能夠影響顆粒細(xì)胞的凋亡和周期，并影響顆粒細(xì)胞分泌E2的能力，為進(jìn)一步探究能否影響雌激素合成相關(guān)基因及雌激素受體的轉(zhuǎn)錄水平，qRT-PCR結(jié)果證實，干擾，雌激素受體的轉(zhuǎn)錄水平顯著低于Scrambled-siRNA組（＜0.05），的轉(zhuǎn)錄水平低于Scrambled-siRNA組，差異不顯著（圖6-A），說明干擾能夠抑制和表達(dá)。此外，qRT-PCR結(jié)果證實，干擾后，雌激素合成通路基因（＜0.05）、（＜0.01）、（＜0.05）和（＜0.05）轉(zhuǎn)錄水平顯著低于Scrambled-siRNA組，的轉(zhuǎn)錄水平低于Scrambled-siRNA組（圖6-B），說明干擾能夠影響雌激素合成通路基因轉(zhuǎn)錄水平。

圖5 干擾KISS1抑制顆粒細(xì)胞分泌E2

3 討論

3.1 KISS1與PI3K信號通路的聯(lián)系

豬的位于9號染色體[19]，包含2個外顯子，CDS區(qū)長度約為417 bp，編碼138個氨基酸[20]，廣泛分布于人和動物的各個組織中，在人的胎盤中表達(dá)量最高[6, 21]，在大鼠的下丘腦中表達(dá)量最高[22]，在豬的下丘腦、垂體、卵巢等組織中都有不同水平的表達(dá)[20]。早期有關(guān)的研究主要集中在癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移抑制[23]，之后的研究更多集中在對哺乳動物中樞調(diào)節(jié)和神經(jīng)內(nèi)分泌的作用[24]，近期已有研究證實，在哺乳動物的卵巢中表達(dá)，但關(guān)于在豬卵巢中表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究較少。此外，PI3K/AKT信號通路是調(diào)控原始卵泡激活和發(fā)育的經(jīng)典信號通路，于是本研究首先探究了干擾對PI3K信號通路中部分基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。又因為卵泡是卵巢的組成單位，圓形泡狀卵泡位于卵巢皮質(zhì)部，主要由卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞組成，根據(jù)卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞不同時期的生長狀況，可將卵泡分為原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、三級卵泡及成熟卵泡。原始卵泡的卵母細(xì)胞僅包裹著單層扁平狀的顆粒細(xì)胞，隨著卵泡的發(fā)育，包裹卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞逐漸增至數(shù)層，形態(tài)也由扁平狀變?yōu)橹鶢睿⒃诼雅菖怕亚爸饾u分化為包裹卵母細(xì)胞的卵丘顆粒細(xì)胞和緊貼卵泡內(nèi)壁的壁層顆粒細(xì)胞[25-27]。顆粒細(xì)胞的發(fā)育優(yōu)先于卵母細(xì)胞的發(fā)育[28]，因而顆粒細(xì)胞的生長分化是原始卵泡生長和啟動的關(guān)鍵因素，而顆粒細(xì)胞的凋亡是卵泡閉鎖的主要標(biāo)志，于是本研究將母豬卵巢顆粒細(xì)胞作為探究卵泡體外發(fā)育的細(xì)胞模型。干擾后，發(fā)現(xiàn)能夠激活PI3K信號通路的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低（＜0.05），抑制PI3K信號通路激活的轉(zhuǎn)錄水平也顯著降低（＜0.05），該結(jié)果初步說明干擾可能微調(diào)PI3K信號通路的基因轉(zhuǎn)錄水平，并影響PI3K信號通路活性。

A. 干擾KISS1抑制ESR1和ESR2表達(dá)；B. 干擾KISS1抑制雌激素通路基因的表達(dá)

3.2 KISS1與顆粒細(xì)胞功能的聯(lián)系

基于干擾能夠影響PI3K/AKT信號通路標(biāo)志基因的表達(dá)量，于是進(jìn)一步檢測干擾對顆粒細(xì)胞功能的影響。前期研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)能夠促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖，抑制顆粒細(xì)胞凋亡[18]；本研究發(fā)現(xiàn)，干擾，凋亡的顆粒細(xì)胞比例顯著增加，這部分結(jié)果與前期研究結(jié)果相呼應(yīng)，證明的轉(zhuǎn)錄水平能夠影響顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡，于是進(jìn)一步研究干擾對顆粒細(xì)胞周期的影響。已知細(xì)胞周期分為G0/G1、S和G2/M期，其中G0/G1期為細(xì)胞處于阻留的狀態(tài)，細(xì)胞在未受刺激時會暫時停止分裂，但DNA合成與細(xì)胞分裂的潛力仍然存在，在一定適宜刺激下，又可進(jìn)入周期進(jìn)行分裂增殖[29]，G0/G1期阻滯是機(jī)體調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的重要手段[30]。S期為DNA合成時期，DNA數(shù)目在此時期加倍，一般情況下細(xì)胞一旦進(jìn)入S期，細(xì)胞分裂就會繼續(xù)進(jìn)行下去，直到下一周期[31]。本研究發(fā)現(xiàn)干擾，阻滯在G0/G1期的顆粒細(xì)胞顯著高于對照組（＜0.01），而處于S期的顆粒細(xì)胞則低于對照組，但差異不顯著，細(xì)胞周期結(jié)合細(xì)胞凋亡的結(jié)果，也說明干擾能夠顯著影響顆粒細(xì)胞的功能。

3.3 KISS1與顆粒細(xì)胞E2分泌的聯(lián)系

信號傳導(dǎo)是下丘腦回路的一部分，該信號能夠促性腺激素釋放，進(jìn)而促進(jìn)卵巢中E2釋放[32]、性器官發(fā)育[33]等，于是本研究擬通過干擾，探究與顆粒細(xì)胞E2分泌的聯(lián)系，結(jié)果表明體外干擾顆粒細(xì)胞中的，培養(yǎng)基上清中E2的濃度顯著降低（＜0.01），該部分結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。

同時已有研究表明，雌激素受體和在動物機(jī)體內(nèi)具有重要的生理作用[34-35]，E2與受體和結(jié)合才能發(fā)揮作用[36]，且在卵巢發(fā)育的過程中，隨著顆粒細(xì)胞的生長，的表達(dá)水平也隨之增加[37-38]。當(dāng)雌激素受體與其配體結(jié)合時，可協(xié)同PI3K通路，激活原始卵泡，促進(jìn)卵泡成熟[39]，但當(dāng)小鼠體內(nèi)的雌激素受體缺失時，小鼠血清中FSH、LH、E2等含量顯著高于正常小鼠，小鼠排卵功能發(fā)生障礙[40]。綜上所述，和基因的轉(zhuǎn)錄水平，能夠反映顆粒細(xì)胞分泌E2的能力。此外，雌激素受體的表達(dá)除了可以調(diào)節(jié)相關(guān)激素的分泌，還能夠升高雌激素合成相關(guān)基因和的轉(zhuǎn)錄水平，促進(jìn)排卵[41]。于是本研究將Scrambled-siRNA和KISS1-siRNA轉(zhuǎn)染至顆粒細(xì)胞，抽取細(xì)胞RNA，并使用qRT-PCR分析顆粒細(xì)胞中雌激素受體及E2信號通路關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果證實，干擾，E2受體表達(dá)量顯著下調(diào)，E2信號通路關(guān)鍵基因、、和也顯著下調(diào)，該結(jié)果與ELISA結(jié)果一致，從分子水平佐證了干擾能夠抑制顆粒細(xì)胞E2分泌。

4 結(jié)論

干擾能夠抑制豬卵巢顆粒細(xì)胞中PI3K信號通路的激活，同時能夠促進(jìn)顆粒細(xì)胞的凋亡，將顆粒細(xì)胞阻滯于分裂間期。干擾能夠抑制顆粒細(xì)胞中雌激素受體和及雌激素合成信號通路基因、、和的轉(zhuǎn)錄水平，抑制E2的分泌。

[1] VANDERHYDEN B C, ARMSTRONG D T. Role of cumulus cells and serum on thematuration, fertilization, and subsequent development of rat oocytes., 1989, 40(4): 720-728.

[2] MAALOUF S W, LIU W S, PATE J L. MicroRNA in ovarian function., 2016, 363(1). DOI: 10. 1007/s00441-015- 2307-4.

[3] EPPIG J J. Oocyte control of ovarian follicular development and function in mammals., 2001, 122(6): 829-838.

[4] UDA M, OTTOLENGHI C, CRISPONI L.disruption causes mouse ovarian failure by pervasive blockage of follicle development., 2004, 13(11): 1171-1181.

[5] WEST A, VOJTA P J, WELCH D R. Chromosome localization and genomic structure of themetastasis suppressor gene ()., 1998, 54(1): 145-148.

[6] LEE J H, MIELE M E, HICKS D J., a novel human malignant melanoma metastasis-suppressor gene.1996, 88(23): 1731-1737.

[7] HU K L, ZHAO H, CHANG H M. Kisspeptin/Kisspeptin receptor system in the ovary., 2017, 8: 365.

[8] GAYTAN F, GAYTAN M, CASTELLANO J M.in the mammalian ovary: distribution of kisspeptin in human and marmoset and alterations inmRNA levels in a rat model of ovulatory dysfunction., 2009, 296(3): E520-531.

[9] 郭美君. 高泌乳素血癥通過/系統(tǒng)影響小鼠卵泡發(fā)育及排卵[D]. 南昌: 南昌大學(xué), 2016.

GUO M J. Hyperprolactinemia affects the follicles development and ovulation by Kiss1/GPR54 system in mice[D]. Nanchang: Nanchang University. 2016. (in Chinese)

[10] 賴麗丹. 高泌乳素血癥通過/系統(tǒng)對大鼠卵巢黃體細(xì)胞內(nèi)分泌功能的影響及其機(jī)制[D]. 南昌: 南昌大學(xué), 2016.

LAI L D. The effect and mechanism of hyperprolactinemia on endocrine function of rat luteal cell by Kiss1/GPR54 system[D]. Nanchang: Nanchang University, 2016. (in Chinese)

[11] 王笑, 王甄真, 陳雁. PI3K/AKT信號通路在維持血糖平衡中的作用. 生命科學(xué), 2013, 25(2): 133-139.

WANG X, WANG Z Z, CHEN Y. The functions of PI3K/AKT signaling pathway in glucose homeostasis.2013, 25(2): 133-139. (in Chinese)

[12] CANTLEY L C. The phosphoinositide 3-kinase pathway., 2002, 296(5573): 1655-1657.

[13] ENGELMAN J A, LUO J, CANTLEY L C. The evolution of phosphatidylinositol 3-kinases as regulators of growth and metabolism., 2006, 7(8): 606-619.

[14] JAGARLAMUDI K, LIU L, ADHIKARI D. Oocyte-specific deletion of Pten in mice reveals a stage-specific function of PTEN/PI3K signaling in oocytes in controlling follicular activation., 2009, 4(7): e6186.

[15] REDDY P, LIU L, ADHIKARI D. Oocyte-specific deletion of Pten causes premature activation of the primordial follicle pool., 2008, 319(5863): 611-613.

[16] FAN H Y, LIU Z, CAHILL N. Targeted disruption of Pten in ovarian granulosa cells enhances ovulation and extends the life span of luteal cells., 2008, 22(9): 2128-2140.

[17] 蔡競. 基于PI3K/AKT信號通路研究新加歸腎丸促卵泡發(fā)育的分子機(jī)制[D]. 成都: 成都中醫(yī)藥大學(xué). 2013.

CAI J. Based on PI3K/AKT signaling pathway to study the molecular mechanism of Xinjiaguishen pill promoting follicular development[D]. Chengdu: Chengdu University of TCM. 2013. (in Chinese)

[18] XIN X, LI Z, ZHONG Y. KISS1 Suppresses apoptosis and stimulates the synthesis of E2 in porcine ovarian granulosa cells., 2019, 9(2). DOI: 10. 3390/ani9020054.

[19] TOMIKAWA J, HOMMA T, TAJIMA S. Molecular characterization and estrogen regulation of hypothalamicgene in the pig., 2010, 82(2): 313-319.

[20] 臧猛, 晁利剛, 張志強(qiáng), 臺玉磊, 王靜, 武宇曉, 楊國宇. 豬基因克隆、序列分析. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2008, 20(11): 5-7.

ZANG M, CHAO L G, ZHANG Z Q, TAI Y L, WANG J, WU Y X, YANG G Y. Molecular cloning and sequence analysis of porcine gene KISS-1., 2008, 20(11): 5-7. (in Chinese)

[21] OHTAKI T, SHINTANI Y, HONDA S. Metastasis suppressor geneencodes peptide ligand of a G-protein-coupled receptor., 2001, 411(6837): 613-617.

[22] IRWIG M S, FRALEY G S, SMITH J T. Kisspeptin activation of gonadotropin releasing hormone neurons and regulation ofmRNA in the male rat., 2004, 80(4): 264-272.

[23] FUNES S, HEDRICK J A, VASSILEVA G. Thereceptor GPR54 is essential for the development of the murine reproductive system., 2003, 312(4): 1357-1363.

[24] PAPAOICONOMOU E, MSAOUEL P, MAKRI A. The role of kisspeptin/GPR54 in the reproductive system., 2011, 25(3): 343-354.

[25] HUNTER M G. Oocyte maturation and ovum quality in pigs., 2000, 5(2): 122-130.

[26] MCGEE E A, HSUEH A J. Initial and cyclic recruitment of ovarian follicles., 2000, 21(2): 200-214.

[27] SIMPSON E R, CLYNE C, RUBIN G. Aromatase-A brief overview., 2002, 64: 93-127.

[28] 魏澤輝, 賈存靈. 家禽卵泡選擇過程中顆粒細(xì)胞的分子調(diào)控機(jī)制. 中國家禽, 2017, 39(21): 1-5.

WEI Z H, JIA C L. The molecular regulation mechanism of granulosa cells in the process of poultry follicle selection., 2017, 39(21): 1-5. (in Chinese)

[29] MISHIMA T, TODA S, ANDO Y. Rapid proliferation of activated lymph node CD4(+) T cells is achieved by greatly curtailing the duration of gap phases in cell cycle progression., 2014, 19(4): 638-648.

[30] CHEN H, XU X, WANG G. CDK4 protein is degraded by anaphase-promoting complex/cyclosome in mitosis and reaccumulates in early G1 phase to initiate a new cell cycle in HeLa cells., 2017, 292(24): 10131-10141.

[31] CROSSEN P E, PATHAK S, ARRIGHI F E. A high resolution study of the DNA replication patterns of Chinese hamster chromosomes using sister chromatid differential staining technique., 1975, 52(4): 339-347.

[32] GOTTSCH M L, CUNNINGHAM M J, SMITH J T. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse., 2004, 145(9): 4073-4077.

[33] FINDLAY J K, BRITT K, KERR J B. The road to ovulation: The role of oestrogens., 2001, 13(7/8): 543-547.

[34] TORAN-ALLERAND C D. Minireview: A plethora of estrogen receptors in the brain: Where will it end?, 2004, 145(3): 1069-1074.

[35] BAKER L, MELDRUM K K, WANG M. The role of estrogen in cardiovascular disease., 2003, 115(2): 325-344.

[36] 杜彥博. 雌激素及其相關(guān)炎癥因子對卵泡發(fā)育的影響[D]. 上海: 復(fù)旦大學(xué), 2012.

DU Y B. The effects of estrogen and related inflammatory factors on the development of follicle[D]. Shanghai: Fudan University, 2012. (in Chinese).

[37] 屈超, 劉中洋, 襲榮剛, 王曉波. 雌激素信號通路概述. 生物技術(shù)通訊, 2014, 25(3): 448-450.

QU C, LIU Z Y, XI R G, WANG X B. Estrogen signaling review., 2014, 25(3): 448-450. (in Chinese)

[38] 岳占碰, 張學(xué)明, 馬琳. 雌激素對哺乳動物卵泡發(fā)育的影響研究進(jìn)展. 中國畜牧雜志, 2007(1): 41-43.

YUE Z P, ZHANG X M, MA L. The production of estrogens in mammalian follicle and its effect on follicular development., 2007(1): 41-43. (in Chinese)

[39] 羅峰, 謝琪璇, 秋山泰身, 秦俊文. 調(diào)節(jié)卵子發(fā)育成熟的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路. 生殖與避孕, 2011, 31(7): 495-501.

LUO F, XIE Q X, QIUSHAN T S, QIN J W. Signal transduction pathways that regulate egg development and maturation., 2011, 31(7): 495-501. (in Chinese)

[40] 詹曉慶, 王鮮忠, 張家驊. 雌激素受體和雌性生殖研究進(jìn)展. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2005(12): 35-39.

ZHAN X Q, WANG X Z, ZHANG J H. Progress on estrogen receptor and female reproduction., 2005(12): 35-39. (in Chinese)

[41] 艾芳, 丘彥. 雌激素受體亞型與多囊卵巢綜合征. 國際生殖健康/計劃生育雜志, 2009, 28(3): 190-193.

AI F, QIU Y. Estrogen receptor subtypes and polycystic ovarian syndrome., 2009, 28(3): 190-193. (in Chinese)

Effect ofInterference on the Function of Porcine Granulosa Cells in Porcine Ovary

Lu SiYu1, HE YingTing1, Zhou XiaoFeng1, Xin XiaoPing1, Zhang AiLing2, Yuan XiaoLong1, ZHANG Zhe1, Li JiaQi1

（1Guangdong Provincial Key Laboratory of Agro-animal Genomics and Molecular Breeding/National Engineering Research Center for Breeding Swine Industry/College of Animal Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642；2Guangdong Development Center of Applied Ecology and Ecological Engineering in Universities/Biology and Food Engineering Institute,Guangdong University of Education,Guangzhou 510310）

【】As the basic structural and functional unit of ovary, the main functions of follicles are ovulation and hormone secretion. Granulosa cells proliferation can promote the development of follicles, while the excessive apoptosis of granulosa cells will inhibit the development of follicles, induce follicular atresia, reduce the estrus frequency and affect the reproductive capacity of female animals. Recent studies have found that theplays an important role in ovary. 【】This study was aimed to explore the effects ofon apoptosis, cell cycle and estrogen secretion of porcine granulosa cells, through interfering the expression of, so as to provide some useful information in molecular regulation mechanism ofon porcine granulosa cells. 【】To investigate the effect of knockdownon the transcription of key genes on phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway in porcine granulosa cells, KISS1-siRNA were designed and transfected to porcine granulosa cells, and then quantitative real time PCR (qRT PCR) was applied to detect the transcription ofThen, flow cytometry, Annexin V-FITC, and ELISA were utilized to explore the effects of KISS1-siRNA on granulosa cell cycle, apoptosis, and secretion of E2, respectively. Finally, qRT-PCR was applied to explore the effects of KISS1-siRNA on estrogen receptor and estrogen signaling pathway. 【】 In porcine granulosa cells, interferinggene could significantly decrease the transcription of(＜0.05), while,anddecreased with no significant difference (＞0.05). The mRNA levels of the genes, involving in activation of PI3K signaling pathway like,andwere also decreased with no significant difference (＞0.05). Transfecting KISS1-siRNA to porcine granulosa cells could significantly promote cell apoptosis (＜0.01), arrest cell cycle at G0/G1 phase (＜0.01), and decrease the E2secretion (＜0.01). After knockdown, the transcription of estrogen receptorand, as well as,,,andof estrogen pathway were also decreased significantly (＜0.05). 【】 This study confirmed thatgene could participate in PI3K and estrogen signaling pathways. Interferingcould promote porcine granulosa cells apoptosis, arrest cell cycle at G0/G1 phase (＜0.01), and decrease the E2secretion. It suggested thatplayed an important role in the division, growth and estrogen secretion of porcine granulosa cells.

sows; granulosa cells;; PI3K; E2

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.23.018

2019-11-28；

2020-10-29

國家生豬現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-35）、國家自然科學(xué)基金青年項目（31902131）、廣東省自然科學(xué)基金面上項目（2019A1515010676）、廣東省揚(yáng)帆計劃（2014YT02H042）、廣東省普通高校青年創(chuàng)新人才項目（2018KQNCX019）、廣州市科技計劃項目（201707010001）

陸思羽，E-mail：siyu_lu19@163.com。通信作者李加琪，E-mail：jqli@scau.edu.cn

（責(zé)任編輯 林鑒非）