玉米穗腐病致病禾谷鐮孢復(fù)合種的遺傳多樣性、致病力與毒素化學(xué)型分析

王寶寶，郭成，孫素麗，夏玉生，朱振東，段燦星

玉米穗腐病致病禾谷鐮孢復(fù)合種的遺傳多樣性、致病力與毒素化學(xué)型分析

王寶寶1，郭成2，孫素麗1，夏玉生1，朱振東1，段燦星1

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/國家農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學(xué)工程，北京 100081；2甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，蘭州 730070）

【】明確中國玉米穗腐病致病禾谷鐮孢復(fù)合種（species complex，F(xiàn)GSC）的菌群遺傳結(jié)構(gòu)、致病力、毒素化學(xué)型及其相互關(guān)系，為玉米鐮孢穗腐病防控提供參考信息。從中國玉米主產(chǎn)區(qū)采集玉米穗腐病樣本，經(jīng)單孢分離鑒定，選取代表性的禾谷鐮孢復(fù)合種，利用22對SSR和10對VNTR引物，使用Popgen32、NTsys2.1、STRUCTURE2.3.4群體遺傳學(xué)研究軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)合、-和基因測序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析7個(gè)地理區(qū)域禾谷鐮孢復(fù)合種的遺傳多樣性，采用花絲通道注射接種法測定各鐮孢菌的致病力，利用產(chǎn)毒基因特異性引物進(jìn)行毒素化學(xué)型的檢測。在禾谷鐮孢復(fù)合種中共檢測到等位位點(diǎn)數(shù)48個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)39個(gè)，多態(tài)性條帶比率為81.25%，每對引物擴(kuò)增出多態(tài)性條帶2—4條；禾谷鐮孢復(fù)合種7個(gè)地理群體平均Shannon’s信息指數(shù)和Nei’s遺傳多樣性指數(shù)分別為0.41和0.29，7個(gè)地理區(qū)域遺傳相似度集中在0.6677—0.8797，遺傳距離為0.1282—0.4039，表明菌群間具有較豐富的遺傳多樣性。依據(jù)Nei’s遺傳距離對7個(gè)地理種群進(jìn)行UPGMA聚類分析，可劃分為3個(gè)類群；STRUCTURE2.3.4群體結(jié)構(gòu)分析表明，禾谷鐮孢復(fù)合種菌群被分為2個(gè)大類群最合適，西北地區(qū)絕大部分屬于類群A，華中地區(qū)和華南地區(qū)菌株均屬于類群B，東北地區(qū)50%以上菌株屬于類群B。、-和基因序列分析表明禾谷鐮孢復(fù)合種由禾谷鐮孢（）、亞洲鐮孢（）、布氏鐮孢（）和南方鐮孢（）構(gòu)成，上述鐮孢菌中存在142個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNP），通過這些差異序列構(gòu)建的聚類圖能清楚顯示出各個(gè)種內(nèi)與種間的遺傳分化情況，各鐮孢種內(nèi)遺傳多樣性十分豐富。禾谷鐮孢致病力最強(qiáng)，平均發(fā)病面積百分比為20.79%；亞洲鐮孢、布氏鐮孢和南方鐮孢的平均發(fā)病面積百分比分別為15.79%、11.77% 和 8.12%。統(tǒng)計(jì)分析表明，不同鐮孢種所引起的穗腐病平均發(fā)病面積占比存在顯著差異。禾谷鐮孢毒素化學(xué)型為15ADON、3ADON、NIV和3ADON+15ADON+NIV 4種，以15ADON為主；布氏鐮孢毒素化學(xué)型為15ADON、3ADON、NIV、3ADON+15ADON和3ADON+15ADON+NIV 5種，以15ADON為主；亞洲鐮孢毒素化學(xué)型只有3ADON；南方鐮孢毒素化學(xué)型為15ADON、3ADON、15ADON+NIV 3種，15ADON為優(yōu)勢類型。此外，15ADON、NIV和3ADON毒素類型菌株平均發(fā)病面積百分比分別為17.87%、17.20%和12.37%。我國不同地理區(qū)域尤其是相鄰區(qū)域禾谷鐮孢復(fù)合種菌群間存在較為頻繁的基因交流與交換。本研究中禾谷鐮孢復(fù)合種的主要毒素化學(xué)型為15ADON，致病力由強(qiáng)到弱依次為禾谷鐮孢＞亞洲鐮孢＞布氏鐮孢＞南方鐮孢。整體看來，毒素化學(xué)型與菌種類型相關(guān)性不顯著，致病力主要與菌種類型有關(guān)。

玉米穗腐??；禾谷鐮孢復(fù)合種；遺傳多樣性；毒素化學(xué)型；致病力

0 引言

【研究意義】玉米是我國重要的糧食作物、飼料作物和能源植物，而穗腐病是玉米生產(chǎn)上最為重要的病害之一，嚴(yán)重影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。我國玉米穗腐病致病菌復(fù)雜多樣，真菌和細(xì)菌均可引起穗腐病，在真菌中，尤以禾谷鐮孢復(fù)合種（species complex，F(xiàn)GSC）和擬輪枝鐮孢（）引起的穗腐病分布最廣，危害最重[2]。2018年我國玉米產(chǎn)量25 717.4萬噸（http://www.stats.gov.cn/tjsj/ndsj/2019/indexch.htm），作為食用和飼用消費(fèi)占2/3以上。穗腐病致病鐮孢菌產(chǎn)生的真菌毒素對玉米籽粒的污染給糧食安全帶來極大隱患。因此，對來自中國玉米主產(chǎn)區(qū)不同區(qū)域的穗腐病致病禾谷鐮孢復(fù)合種進(jìn)行遺傳多樣性、致病力和毒素化學(xué)型分析，可為穗腐病的防控提供基礎(chǔ)信息，為保障玉米安全生產(chǎn)提供風(fēng)險(xiǎn)警示。【前人研究進(jìn)展】禾谷鐮孢復(fù)合種是引起我國玉米穗腐病的優(yōu)勢種[2-6]，其不僅能侵染玉米引起穗腐病、莖腐病、鞘腐病和苗枯病等[7]，還侵染小麥、大豆和水稻等農(nóng)作物，引起小麥赤霉病[8]、大豆根腐病[9]和水稻赤霉病[10]等重要病害。更重要的是，禾谷鐮孢復(fù)合種能產(chǎn)生多種有害真菌毒素，例如雪腐鐮刀菌烯醇（NIV）、黃色鐮刀菌素、玉米赤霉烯酮（ZEN）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）及其衍生物15ADON和3ADON[4,11]，嚴(yán)重影響了玉米籽粒的產(chǎn)量和品質(zhì)，一旦被毒素污染的玉米產(chǎn)品流入市場，進(jìn)入食物鏈，將對人畜健康造成嚴(yán)重威脅[12-13]。利用分子標(biāo)記對植物和病原菌進(jìn)行遺傳多樣性分析，已經(jīng)取得了良好的結(jié)果。GAI等[14]利用ISSR分子標(biāo)記分析了東北地區(qū)40株莖腐病和穗腐病禾谷鐮孢復(fù)合種菌株的遺傳多樣性和致病力，通過聚類分析，在遺傳相似系數(shù)為0.62時(shí)菌株被分為兩組；馬紅霞等[15]采用ISSR引物分析來自11個(gè)省的禾谷鐮孢復(fù)合種，發(fā)現(xiàn)菌株群體內(nèi)存在豐富的遺傳變異，不同地理種群間存在一定的基因交流，遺傳多樣性與地理來源有關(guān)；Yerkovich等[16]采用ISSR分子標(biāo)記分析了禾谷鐮孢復(fù)合種遺傳多樣性（GD=0.999—1.000）；Sneideris等[17]用10對VNTR分子標(biāo)記分析了57株禾谷鐮孢菌株群體，發(fā)現(xiàn)較高的遺傳多樣性；任旭[18]采用VNTR和SSR標(biāo)記對擬輪枝鐮孢和禾谷鐮孢復(fù)合種的部分菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析，明確其具有豐富的基因變異，證實(shí)了VNTR和SSR標(biāo)記的實(shí)用性；李新鳳等[19]依據(jù)擬輪枝鐮孢的EST序列，開發(fā)出25對SSR引物，并證明可用于擬輪枝鐮孢及其近緣種的遺傳多樣性分析。【本研究切入點(diǎn)】目前，在中國報(bào)道能引起玉米穗腐病的禾谷鐮孢復(fù)合種已達(dá)10個(gè)種（禾谷鐮孢、亞洲鐮孢、布氏鐮孢、南方鐮孢、九州鐮孢、梨孢鐮孢、擬枝孢鐮孢、黃色鐮孢等）。不同地理區(qū)域禾谷鐮孢復(fù)合種菌群構(gòu)成、產(chǎn)毒素潛力及致病力、遺傳變異等方面差異較大。SSR、VNTR分子標(biāo)記技術(shù)在進(jìn)行鐮孢菌遺傳分析上應(yīng)用廣泛且成熟，結(jié)合運(yùn)用、-和基因序列分析禾谷鐮孢復(fù)合種遺傳多樣性的研究報(bào)道較少，將二者結(jié)合，互為補(bǔ)充，更能準(zhǔn)確地對鐮孢菌進(jìn)行遺傳分化與多樣性分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】分析我國7個(gè)地理區(qū)域（華北、華中、華東、東北、華南、西北和西南地區(qū)）禾谷鐮孢復(fù)合種的遺傳多樣性、致病力和毒素化學(xué)型，為玉米穗腐病的綜合防控、鐮孢菌致病機(jī)理相關(guān)研究以及玉米品種的抗病鑒定相關(guān)工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2014—2018年，在中國13個(gè)省（直轄市、自治區(qū)）（河北、河南、安徽、山東、陜西、重慶、四川、云南、北京、遼寧、廣西、貴州、黑龍江）采集玉米病穗樣本，并用組織分離法對采集到的玉米樣品進(jìn)行病原菌分離鑒定[2,5-6]，確定菌種的構(gòu)成。為分析分離致病菌中禾谷鐮孢復(fù)合種的遺傳多樣性，從不同?。ㄖ陛犑小⒆灾螀^(qū)）選取具代表性的禾谷鐮孢復(fù)合種45株，根據(jù)地理來源將其分為7大類群，分別為華北、華中、華東、東北、華南、西北和西南地區(qū)。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：DifcoTMPotato Dextrose Agar 39 g、蒸餾水1.0 L；合成低營養(yǎng)瓊脂（spezieller nahrstoffarmer agar，SNA）液體培養(yǎng)基：KH2PO41.0 g、KNO31.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、蔗糖0.2 g、葡萄糖0.2 g、蒸餾水1.0 L。

真菌基因組DNA提取試劑盒（索萊寶科技有限公司，北京）；超微量核酸蛋白測定儀（Q5000，美國QUAWELL公司）；凝膠成像系統(tǒng)（Tanon 4100，南京）；2×TaqPCR Master Mix、100 bp DNA Ladder（天根生化科技有限公司，北京）；玉米穗腐病圖像采集與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（國家農(nóng)業(yè)信息化工程技術(shù)研究中心定制）；水平電泳槽（DYCP-36A，北京）；立式壓力蒸汽滅菌器（LS-75HD型，濟(jì)南）；錐形瓶（150 mL）、超凈工作臺(tái)、顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、無菌注射器。

1.2 DNA提取

將選取的單菌株轉(zhuǎn)移到貼有玻璃紙的PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)5—7 d，刮取菌絲并自然晾干，取3—5 g干菌絲體裝于2.0 mL離心管中。用真菌基因組DNA提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）提取DNA。用Q5000超微量核酸蛋白測定儀測定提取DNA的濃度。

1.3 分子標(biāo)記和基因測序引物

使用22對SSR引物、10對VNTR引物（表1）對所選鐮孢菌進(jìn)行遺傳多樣性分析。25 μL反應(yīng)體系：DNA 模板2 μL、上下游引物各1 μL，12.5 μL 2×TaqPCR Master Mix，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s，退火溫度（視不同引物而定）45 s，72℃延伸1 min，36個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。

表1 本試驗(yàn)所用引物

續(xù)表1 Continued table 1

采用、-以及基因序列（表1）對所選菌株進(jìn)行分析。的50 μL PCR反應(yīng)體系：DNA模板2 μL、上下游引物各2 μL、2×TaqPCR Master Mix 25 μL、ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 5 min；95℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，36個(gè)循環(huán)：72℃延伸10 min，4℃保存產(chǎn)物。

-的反應(yīng)體系同上，PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 4 min；95℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸 1 min，36個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃保存產(chǎn)物，DNA擴(kuò)增片段大小約380 bp。

反應(yīng)體系同上，PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃保存產(chǎn)物，DNA 擴(kuò)增片段大小約800 bp。于1.2%瓊脂糖凝膠電泳后檢驗(yàn)有條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，測序拼接結(jié)果在NCBI的BLAST模塊進(jìn)行比對分析。

1.4 致病力測定

田間種植：于2019年6月在北京順義田間種植150行玉米自交品系掖478，每行留10株苗，行距60 cm，株距25 cm，重復(fù)兩次。

孢子懸浮液的制備：配備合成低營養(yǎng)瓊脂（SNA）液體培養(yǎng)基，并倒入60 mL于錐形瓶中，于立式壓力蒸汽滅菌器中滅菌，在超凈工作臺(tái)上分別將培養(yǎng)好的禾谷鐮孢刮取菌絲，轉(zhuǎn)移至上述錐形瓶中，記下菌株信息，連續(xù)光照12 h，25℃下振動(dòng)培養(yǎng)3—5 d。在顯微鏡下鏡檢，使用血球計(jì)數(shù)板將濃度調(diào)至1×106個(gè)分生孢子/mL，待用。待田間玉米花絲吐出7—10 d，用無菌注射器吸取孢子懸浮液，每株玉米主穗通過花絲通道接種法[28]注射菌液2 mL，每個(gè)菌株注射接種兩行玉米，去除主穗外的其他穗并在每行玉米行頭做好標(biāo)記。在玉米蠟熟后期，收集所有接種的玉米果穗，去除苞葉，利用玉米穗腐病圖像采集與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（國家農(nóng)業(yè)信息化工程技術(shù)研究中心定制），測定每個(gè)果穗的發(fā)病籽粒區(qū)域占整個(gè)果穗籽粒表面積的百分比，并計(jì)算每個(gè)菌株所接種果穗（共計(jì)20個(gè)）的平均發(fā)病面積占比。

發(fā)病面積（m）百分比計(jì)算公式：m=（d/e）×100%，其中d為玉米穗部出現(xiàn)穗腐癥狀的籽粒表面積，e為玉米穗部全部籽粒的面積。

平均發(fā)病面積（me）百分比計(jì)算公式：me=（∑mi）/n×100%，n為接種果穗數(shù)，mi中i選值從1到n，是每個(gè)玉米穗的發(fā)病面積百分比。

1.5 毒素化學(xué)型測定

對禾谷鐮孢復(fù)合種進(jìn)行毒素化學(xué)型分子檢測，選用引物Tri13a/b。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min；95℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，36個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃保存產(chǎn)物，15ADON、3ADON和NIV毒素化學(xué)型的菌株擴(kuò)增片段分別為583、644和859 bp[25]，PCR反應(yīng)程序同上。分別采用Tri13F/R，擴(kuò)增片段415 bp，退火溫度57℃進(jìn)行NIV毒素化學(xué)型的重復(fù)性檢測[26]；采用Tri303F/R，退火溫度為52℃，擴(kuò)增片段586 bp，進(jìn)行3ADON毒素化學(xué)型的重復(fù)性檢驗(yàn)[27]；采用Tri315F/R，退火溫度為58℃，擴(kuò)增片段864 bp，進(jìn)行15ADON毒素化學(xué)型的重復(fù)性檢驗(yàn)[27]，以鑒定特異性引物的有效性。

1.6 數(shù)據(jù)處理

穗腐病致病力數(shù)據(jù)先通過玉米穗腐病圖像采集與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)處理，得到個(gè)體的表型數(shù)據(jù)，利用Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與處理，計(jì)算各組的平均表型值，并進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星引物的SSR擴(kuò)增

SSR引物在45株禾谷鐮孢復(fù)合種中共檢測到等位位點(diǎn)數(shù)48個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)39個(gè)，多態(tài)性條帶比率為81.25%，每對引物擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶為2—4條。對于不同菌株相同引物擴(kuò)增出的條帶，同一片段大小記為‘1’，在同一位置沒有擴(kuò)增條帶的記為‘0’。統(tǒng)計(jì)條帶信息，利用NTsys2.1采用非加權(quán)對數(shù)算術(shù)平均法（UPGMA）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.2 不同地理種群的遺傳多樣性

對中國7個(gè)地理種群的禾谷鐮孢復(fù)合種菌群進(jìn)行遺傳多樣性分析（表2）。東北地區(qū)菌群的遺傳多樣性最為豐富，多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為39，有效等位基因數(shù)1.79，Shannon’s信息指數(shù)為0.62，Nei’s遺傳多樣性指數(shù)為0.43。禾谷鐮孢復(fù)合種7個(gè)地理種群的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)在10—39，平均Shannon’s信息指數(shù)為0.41，平均Nei’s遺傳多樣性指數(shù)為0.29，表明禾谷鐮孢復(fù)合種具有較豐富的遺傳多樣性。7個(gè)地理種群禾谷鐮孢復(fù)合種的Nei’s遺傳相似度為0.6677—0.8797，其中東北和西北地區(qū)的最高，而華中與西南地區(qū)的最低，表明華中和西南地區(qū)的菌群表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性；遺傳距離為0.1282—0.4039，表明7個(gè)區(qū)域間的種群分布較為分散（表3）。

表2 禾谷鐮孢復(fù)合種的遺傳多樣性

表3 禾谷鐮孢復(fù)合種遺傳相似度和遺傳距離

2.3 禾谷鐮孢復(fù)合種地理種群的聚類分析

依據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果用NTsys2.1對禾谷鐮孢復(fù)合種7個(gè)地理種群遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類分析，菌群在相似系數(shù)為0.77時(shí)，被聚類為3個(gè)大的分支，華北地區(qū)的菌株單獨(dú)聚為一類，東北、西北、西南、華南地區(qū)的菌株聚為一大類群，華中和華東地區(qū)的同在一分支（圖1）。

圖1 禾谷鐮孢復(fù)合種7個(gè)地理種群的聚類分析圖

2.4 STRUCTURE群體結(jié)構(gòu)分析

使用結(jié)構(gòu)分析STRUCTURE2.3.4軟件的貝葉斯聚類法對禾谷鐮孢復(fù)合種地理種群的群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，參數(shù)Length of Bunrin Period設(shè)為25 000，Numbers of MCMC Reps after Bunrin設(shè)為1 000 000，將K設(shè)置為1—10，K重復(fù)次數(shù)Number of Iterations設(shè)為10，將運(yùn)行結(jié)果轉(zhuǎn)換成壓縮包文件在網(wǎng)站Structure Harvest（http://taylor0.biology.ucla.edu/structure Harvester/）中利用Evanno等[29]ΔK方法計(jì)算LnP（K）值、ΔK值和K的最大可能值，結(jié)果圖2所示，LnP（K）值隨著K值增大而增大，表明鐮孢菌群體間存在遺傳分化，當(dāng)K值為2時(shí)，ΔK取最大為150，表明7個(gè)地理群體的禾谷鐮孢復(fù)合種分為兩個(gè)類群最合適。

進(jìn)一步研究STRUCTURE軟件分析得到的菌群和地理區(qū)域間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，禾谷鐮孢復(fù)合種在兩個(gè)類群中，西北地區(qū)絕大部分屬于類群A，華中地區(qū)和華南地區(qū)菌株均屬于類群B，東北地區(qū)50%以上菌株屬于類群B（圖3）。

圖2 禾谷鐮孢復(fù)合種取不同K值時(shí)的ΔK值曲線圖

圖3 禾谷鐮孢復(fù)合種群體結(jié)構(gòu)圖（當(dāng)K值為2時(shí)）

2.5 基于基因序列構(gòu)建禾谷鐮孢復(fù)合種樹形圖

通過、和基因測序?qū)坦如犳邚?fù)合種的3個(gè)基因片段序列按相同順序拼接起來，并用MEGA7.0軟件構(gòu)建樹形圖進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析（圖4）。最終，禾谷鐮孢復(fù)合種被分為4大類群，分支標(biāo)記為紅色的以亞洲鐮孢為主，包括廣西、四川、陜西等相鄰地區(qū)；分支標(biāo)記為淺綠色的以布氏鐮孢為主，分布在甘肅、黑龍江、北京等相鄰地區(qū)；分支標(biāo)記為藍(lán)色的以南方鐮孢為主，包括貴州、重慶、云南、廣西和陜西等地區(qū)；分支標(biāo)記為黑色（藍(lán)色分支的下部）的以禾谷鐮孢為代表，包括黑龍江、河南、遼寧、陜西、山東和北京地區(qū)。各地區(qū)之間菌種組成不盡相同，禾谷鐮孢和布氏鐮孢多分布在北方冷涼地區(qū)，亞洲鐮孢和南方鐮孢多分布于南方溫濕地區(qū)，在北方地區(qū)也鮮有分布，從樹形圖來看，各鐮孢菌種內(nèi)部也存在小的分支，表明無論種間、種內(nèi)遺傳多樣性均較為豐富。各地區(qū)間存在著豐富的遺傳變異，尤其是相鄰地區(qū)種間存在較頻繁的基因交流與交換。使用MEGA7.0軟件分析3個(gè)基因的序列，在全長1 800 bp的片段上，發(fā)現(xiàn)了142個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNP）。

2.6 鐮孢菌致病力測定與毒素化學(xué)型分析

禾谷鐮孢復(fù)合種以15ADON毒素化學(xué)型為主，共32株，3ADON次之，共15株，NIV 5株；3ADON主要在西北、華南、西南地區(qū)分布，有兩株菌能同時(shí)產(chǎn)生15ADON和3ADON，兩株菌能同時(shí)產(chǎn)生3種毒素化學(xué)型，一株菌能同時(shí)產(chǎn)生15ADON和NIV；15ADON、NIV和3ADON平均發(fā)病面積百分比分別為17.87%、17.20%和12.37%，能同時(shí)產(chǎn)生3種毒素化學(xué)型的菌株平均發(fā)病面積百分比為16.36%，略高于3種類型總平均發(fā)病面積百分比。禾谷鐮孢平均發(fā)病面積百分比最大，為20.79%；亞洲鐮孢、布氏鐮孢和南方鐮孢的平均發(fā)病面積百分比分別為15.79%、11.77%和8.12%，禾谷鐮孢的致病力在4種鐮孢菌中最強(qiáng)。禾谷鐮孢復(fù)合種在東北、華東、西南、華南、華北、華中和西北地區(qū)平均發(fā)病面積百分比分別為20.85%、18.00%、9.81%、15.22%、13.74%、13.65%和12.33%。禾谷鐮孢毒素化學(xué)型為15ADON、3ADON、NIV和3ADON+ 15ADON+NIV 4種，以15ADON為主；布氏鐮孢毒素化學(xué)型為15ADON、3ADON、NIV、3ADON+15ADON和3ADON+15ADON+NIV 5種，以15ADON為主；亞洲鐮孢毒素化學(xué)型只有3ADON；南方鐮孢毒素化學(xué)型為15ADON、3ADON、15ADON+NIV 3種，15ADON為優(yōu)勢類型（表4）。不同鐮孢種引起的穗腐病平均發(fā)病面積占比存在顯著差異（=0.011＜0.05），表明不同鐮孢種之間的致病力存在較大差異（表5、表6）。禾谷鐮孢復(fù)合種在7大地理區(qū)域的菌群構(gòu)成、致病力和毒素化學(xué)型分布不均勻。

圖4 禾谷鐮孢復(fù)合種RPB2+TEF-1α+β-tubulin基因聚類圖

3 討論

玉米穗腐病是一種在世界各玉米種植區(qū)頻繁發(fā)生的真菌病害，主要病原真菌為鐮孢菌。禾谷鐮孢復(fù)合種可侵染玉米根、莖、穗、葉，引起根腐病、莖腐病、穗腐病、葉斑病等病害，其產(chǎn)生多種真菌毒素嚴(yán)重影響玉米籽粒的品質(zhì)和安全，給生產(chǎn)者造成巨大損失[30-31]。目前，禾谷鐮孢復(fù)合種至少包括16個(gè)種，我國已鑒定出10個(gè)種，本研究中的禾谷鐮孢復(fù)合種由禾谷鐮孢、布氏鐮孢、南方鐮孢和亞洲鐮孢組成。禾谷鐮孢在南北方均有分布；布氏鐮孢主要分布在東北、西北和華北等較冷涼地區(qū)；亞洲鐮孢多分布于華南地區(qū)，在東北、西南和西北地區(qū)也有少量分布；南方鐮孢則主要分布在西南、華南等較溫暖地區(qū)，與前人相關(guān)的研究結(jié)果基本一致[5]。本研究首次利用玉米穗腐病圖像采集與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（國家農(nóng)業(yè)信息化工程技術(shù)研究中心定制）進(jìn)行穗腐病發(fā)病面積調(diào)查與數(shù)據(jù)自動(dòng)化處理，穗部發(fā)病面積占比由該系統(tǒng)通過AI識別測定后自動(dòng)生成，結(jié)果比較精確；而以往玉米穗腐病發(fā)病情況調(diào)查均由人工觀察估測，同一份材料由不同的人調(diào)查或同一個(gè)人調(diào)查不同材料的發(fā)病情況時(shí)，不可避免地產(chǎn)生不同程度的誤差。通過該系統(tǒng)測定處理的數(shù)據(jù)，消除了人為造成的誤差，能真實(shí)反映出不同鐮孢菌株所致穗腐病的發(fā)病嚴(yán)重程度。

馬紅霞等[15]報(bào)道在中國春玉米區(qū)和夏玉米區(qū)禾谷鐮孢復(fù)合種的毒素化學(xué)型主要為DON和15ADON，溫暖地區(qū)如長江流域則以3ADON和NIV為主；本研究組[2]于2018—2019年全面分析了黑龍江地區(qū)禾谷鐮孢復(fù)合種的毒素化學(xué)型，發(fā)現(xiàn)禾谷鐮孢與布氏鐮孢均以產(chǎn)DON毒素衍生物為主，僅1株亞洲鐮孢產(chǎn)NIV毒素；Aamot等[32]報(bào)道了挪威小麥赤霉病病原菌禾谷鐮孢以3ADON類型占主導(dǎo)；Sneideris等[17]在57株禾谷鐮孢中發(fā)現(xiàn)47株能產(chǎn)生15ADON。在本研究中，禾谷鐮孢復(fù)合種的毒素化學(xué)型較為豐富，禾谷鐮孢、布氏鐮孢和南方鐮孢均能產(chǎn)生15ADON、3ADON和NIV 3種毒素化學(xué)型，亞洲鐮孢只發(fā)現(xiàn)3ADON型，總體以15ADON和3ADON型占主導(dǎo)，其中15ADON類型的最多，產(chǎn)生NIV的菌株較少，與前人相關(guān)研究對比不難發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢產(chǎn)毒類型的菌群已發(fā)生一定程度的變化。

有關(guān)禾谷鐮孢復(fù)合種的致病力分析在小麥上報(bào)道較多，在玉米穗腐病上報(bào)道很少。Ward等[33]研究發(fā)現(xiàn)，小麥赤霉病病原菌禾谷鐮孢產(chǎn)3ADON的菌株與產(chǎn)15ADON的菌株相比，單端孢霉烯含量更高，且繁殖力更強(qiáng)、生長速率更快；李偉等[34]利用30株小麥赤霉病的亞洲鐮孢和1株禾谷鐮孢進(jìn)行致病力測定及毒素化學(xué)型分析，結(jié)果表明在長江流域，產(chǎn)3ADON的亞洲鐮孢致病力最強(qiáng)，產(chǎn)15ADON的亞洲鐮孢菌株在小麥品種上表現(xiàn)的致病力很弱；杜青等[35]對廣西地區(qū)禾谷鐮孢復(fù)合種進(jìn)行毒素化學(xué)型分析未檢測到產(chǎn)3ADON的菌株。本研究表明，對于玉米穗腐病而言，產(chǎn)15ADON毒素化學(xué)型菌株比產(chǎn)3ADON毒素化學(xué)型菌株的致病力強(qiáng)，結(jié)論有所不同，可能與李偉等[34]的研究中產(chǎn)15ADON的菌株樣本量太少（僅1株）有關(guān)，也可能與寄主植物本身的特性有關(guān)。GAI等[14]對40株禾谷鐮孢菌復(fù)合種致病力測定中，得到各菌株的病情指數(shù)在58.9—89.3，且致病力不存在地域性差異；但本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)北方區(qū)域菌株致病力較南方的強(qiáng)，總體而言，由北向南禾谷鐮孢復(fù)合種致病力逐漸減弱。樣本的數(shù)量選取對試驗(yàn)結(jié)果影響較大，尤其是遺傳多樣性分析，樣本群體數(shù)量足夠大，可能包含的基因越豐富，毒素化學(xué)型也更全面，本研究囿于材料等的限制（結(jié)合前人的研究，特定菌株在一些地區(qū)的玉米穗腐樣本上分離頻率比較低[2,5-6,15]，本試驗(yàn)也如此，例如南方鐮孢主要在南方地區(qū)分布，布氏鐮孢主要在北方地區(qū)有分布，一些地區(qū)雖然分離了大量的禾谷鐮孢，但為了保證試驗(yàn)均衡及代表性，去掉了同一地理來源的菌株），在樣本選取上最大限度地保證禾谷鐮孢復(fù)合種菌種的多樣化以及每個(gè)菌株地理來源的差異性，因此，盡管菌株數(shù)量偏少，但所選菌株具有較好的代表性。下一步可以擴(kuò)大樣品的采集數(shù)目并對樣本數(shù)量最優(yōu)選取進(jìn)行探討，以選出最適合試驗(yàn)的菌群數(shù)。

表4 禾谷鐮孢復(fù)合種致病力與毒素化學(xué)型

表5 不同鐮孢種引起的穗腐病發(fā)病面積占比統(tǒng)計(jì)分析

表6 不同鐮孢種致病力方差分析

禾谷鐮孢復(fù)合種存在大量的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，具有高度適應(yīng)環(huán)境的潛力，將遺傳變異與表型變化聯(lián)系起來仍然具有挑戰(zhàn)性。Laurent等[36]使用全基因組重測序在單核苷酸水平上研究了6個(gè)法國禾谷鐮孢的基因組多樣性，共檢測到242 756個(gè)高度可信遺傳變異位點(diǎn)，其中96%為單核苷酸多態(tài)性，約80%的禾谷鐮孢編碼蛋白的基因上產(chǎn)生了多態(tài)性。本研究通過SSR+VNTR分子標(biāo)記結(jié)合、和基因測序?qū)坦如犳邚?fù)合種進(jìn)行遺傳多樣性分析，通過比較3個(gè)基因序列，共發(fā)現(xiàn)142個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，說明禾谷鐮孢遺傳變異具有高度的適應(yīng)性。與傳統(tǒng)的利用分子標(biāo)記特異性擴(kuò)增來分析鐮孢菌的遺傳多樣性相比，利用基因測序，通過這些差異序列構(gòu)建的聚類圖能清楚顯示出各種內(nèi)與種間的遺傳分化情況，構(gòu)建樹形圖更精細(xì)，分支更多而精準(zhǔn)，甚至還能比較任意兩個(gè)菌株的單核苷酸多態(tài)性，但其不能覆蓋菌株所有的染色體，將二者結(jié)合，進(jìn)行局部和整體的全面分析，有利于深入研究。

馬紅霞等[15]研究發(fā)現(xiàn)，相同地理來源例如同屬春玉米區(qū)或夏玉米區(qū)的菌株有較近的親緣關(guān)系，且不同地理種群間存在基因交流，遺傳多樣性水平與地理來源有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)在7大地理區(qū)域，菌群構(gòu)成、致病力和毒素化學(xué)型分布都不均勻，華中和華東地區(qū)菌群親緣關(guān)系較近，西南和東南、東北和西北地區(qū)菌群親緣關(guān)系較近。Aamot等[32]研究了挪威45株禾谷鐮孢復(fù)合種的平均遺傳多樣性指數(shù)（H）在0.17—0.43，發(fā)現(xiàn)近些年采集的菌株要比前些年收集菌群的遺傳多樣性數(shù)值高。隨著人們農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)多元化，致病菌間的基因交流會(huì)愈加頻繁，遺傳多樣性水平也會(huì)因此上升，是否會(huì)導(dǎo)致侵染性更強(qiáng)，需要多年持續(xù)跟蹤的研究。

4 結(jié)論

禾谷鐮孢復(fù)合種包括禾谷鐮孢、布氏鐮孢、亞洲鐮孢和南方鐮孢，其毒素化學(xué)型含15ADON、3ADON、NIV及其組合型，以15ADON和3ADON為主，禾谷鐮孢的致病力在4種鐮孢菌中最強(qiáng)，且致病力強(qiáng)弱與毒素化學(xué)型有關(guān)?；赟SR和VNTR分子標(biāo)記結(jié)合、和基因測序分析，表明在7個(gè)地理區(qū)域內(nèi)部或各區(qū)域之間，禾谷鐮孢復(fù)合種群體各鐮孢菌種間和種內(nèi)均存在豐富的遺傳變異，相鄰區(qū)域間鐮孢菌的基因交流與交換發(fā)生頻繁；遺傳多樣性水平與地理來源、菌種構(gòu)成、毒素化學(xué)型以及樣本量均有關(guān)。

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WANG BaoBao1, GUO Cheng2, SUN SuLi1, XIA YuSheng1, ZHU ZhenDong1, DUAN CanXing1

(1Institute of Crop Sciences/National Key Facility of Crop Gene Resources and Genetic Improvement, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;2Institute of Plant Protection, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070)

【】The objective of this study is to clarify the genetic structure, pathogenicity, toxigenic chemotypes, and their relationship ofspecies complex (FGSC) causing maize ear rot in China, and to provide reference information for prevention and control of Fusarium ear rot of maize.【】The samples were collected from the main maize producing areas in China. Twenty-two pairs of SSR and 10 pairs of VNTR primers, along with,andgene sequences were used for genetic diversity and Popgen32, NTsys2.1, and STRUCTURE2.3.4 software were used to analyze the data and construct the phylogenetic tree. The pathogenicity of FGSC was determined using the silk channel injection inoculation method, and the specific primers were used to detect the toxigenic chemotypes.【】A total of 48 alleles were detected by SSR and VNTR primers, 39 polymorphic sites were found, with a polymorphic band ratio of 81.25% among 45 strains, the polymorphic bands ranged from 2 to 4. The average Shannon’s information index and Nei’s genetic diversity index of the 7 FGSC geographic populations were 0.41 and 0.29, respectively, the genetic similarity in 7 regions was 0.6677-0.8797, and the genetic distance was 0.1282-0.4039, indicating that there existed rich genetic diversity among the flora. Based on the Nei’s genetic distance, 7 FGSC geographical populations were divided into 3 groups by UPGMA clustering. The population structure of FGSC stains could be divided into two different groups by STRUCTURE2.3.4.Most of the strains from Northwest China belonged to group A, those in Central China and South China belonged to group B, and more than 50% of the strains in Northeast China belonged to group B. Based on the sequences of,-and, FGSC was composed of,,, and.There were 142 single nucleotide polymorphisms (SNPs) among thesestrains. The dendrogram constructed by these differential sequences could clearly show the genetic differentiation within and between species. The genetic diversity within eachspecies was rich. Among fourspecies, the pathogenicity ofwas the strongest, with an average diseased ear area of 20.79%. The average diseased areas of,, andwere 15.79%, 11.77%, and 8.12%, respectively. The difference in the percentage of average diseased area was significant betweenspecies. The toxigenic chemotypes ofwere 15ADON, 3ADON, NIV, and 3ADON + 15ADON + NIV,contained 15ADON, 3ADON, NIV, 3ADON + 15ADON, and 3ADON + 15ADON + NIV chemotypes, the toxigenic chemotypesofwere 15ADON, 3ADON, and 15ADON+ NIV, the 15ADON chemotype was the most frequently detected, whilemerely contained 3ADON chemotype. In addition, the average diseased ear areas of 15ADON, NIV and 3ADON type strains were 17.87%, 17.20%, and 12.37%, respectively.【】There existed frequent gene exchanges between different FGSC geographical populations, especially in adjacent regions. 15ADON type is the predominant toxigenic chemotype of FGSC in 7 geographic regions. The pathogenicity ofis the strongest, followed by,,andaccording to the percentage of the diseased area caused by differentspecies. In this study, the correlation between toxigenic chemotypes andspecies is not significant, and the pathogenicity is mainly related tospecies.

maize ear rot;species complex (FGSC); genetic diversity; toxigenic chemotype; pathogenicity

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.23.005

2020-03-26；

2020-05-06

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0100103）、農(nóng)作物種質(zhì)資源保護(hù)與利用專項(xiàng)（2020NWB036-12）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程

王寶寶，E-mail：1443094080@qq.com。通信作者段燦星，E-mail：duancanxing@caas.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）