代謝組學(xué)在胰腺外分泌疾病中的研究進(jìn)展

唐曦平

廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院內(nèi)鏡中心，南寧 530021

【提要】 胰腺疾病可導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重的代謝紊亂，而反映生物信息終端事件的代謝組學(xué)研究則能夠系統(tǒng)、全面地體現(xiàn)疾病狀態(tài)下機(jī)體發(fā)生的變化。因此，應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)研究胰腺外分泌疾病的發(fā)病機(jī)制，有助于疾病的早期診斷及治療。

代謝組學(xué)(metabolomics 或metabonomics)是后基因組時(shí)代發(fā)展起來的一門新興的組學(xué)技術(shù)，最早于20世紀(jì)末由Nicholson等[1]和Fiehn等[2]相繼提出，其與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)共同構(gòu)成系統(tǒng)生物學(xué)整體。代謝組學(xué)的具體定義是指定量測(cè)定生物系統(tǒng)對(duì)病理生理刺激以及基因改變產(chǎn)生的多參數(shù)代謝的動(dòng)態(tài)應(yīng)答，分析對(duì)象是細(xì)胞、組織或器官中低分子量(50～2 000)代謝產(chǎn)物的集合[3-4]。由于代謝產(chǎn)物處于生物信息傳遞的終端，反映的是已經(jīng)發(fā)生了的生物學(xué)事件，基因表達(dá)和蛋白質(zhì)的變化對(duì)系統(tǒng)產(chǎn)生的影響都可在代謝物水平上得到體現(xiàn)，因此代謝組學(xué)強(qiáng)調(diào)的是機(jī)體整體的變化，是所有代謝應(yīng)答的全貌和動(dòng)態(tài)變化的過程。與基因組學(xué)和蛋白組學(xué)相比，代謝組學(xué)不僅更能表現(xiàn)出生物體系整體功能或狀態(tài)的最終結(jié)果，并且放大了基因和蛋白表達(dá)的微小變化，從而使檢測(cè)更容易；研究不需進(jìn)行全基因組測(cè)序或建立大量表達(dá)序列標(biāo)簽的數(shù)據(jù)庫；代謝產(chǎn)物的種類遠(yuǎn)少于基因和蛋白質(zhì)的數(shù)目，且代謝產(chǎn)物在各個(gè)生物體系中都是相似的，研究中采用的技術(shù)更通用[5]。代謝組學(xué)的基本研究方法是通過高通量高分辨率的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定，得到海量數(shù)據(jù)集，再通過數(shù)據(jù)分析得到有差異的代謝物質(zhì)，并尋找其代謝通路，解釋其生物學(xué)意義。

一、代謝組學(xué)技術(shù)

目前代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用最廣泛的是核磁共振技術(shù)(nuclear magnetic resonance，NMR)、色譜法和質(zhì)譜法及其聯(lián)用技術(shù)，包括氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometer, GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatograph-mass spectrometer, LC-MS)。

1．NMR：NMR是代謝組學(xué)的常用檢測(cè)技術(shù)之一，特別是1H-NMR。其優(yōu)點(diǎn)是樣品前處理簡(jiǎn)單，樣品用量少，無損傷性，無偏向性，對(duì)所有化合物的靈敏度一樣，能完成代謝產(chǎn)物中大多數(shù)化合物的檢測(cè)。但其缺點(diǎn)是靈敏度、分辨率較低，不適用于大量低豐度代謝物的分析。近年13C-NMR的應(yīng)用提高了其分辨率[6]，進(jìn)一步拓寬了NMR 技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域，廣泛應(yīng)用于藥物毒性、生理病理過程機(jī)制研究以及疾病的臨床診斷。

2．色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)：與NMR相比，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有較高的靈敏度和專屬性，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)化合物的同時(shí)快速分析與鑒定，兼?zhèn)渖V的高分離度、高通量及質(zhì)譜的普適性、高靈敏度和特異度等特點(diǎn)，具有檢測(cè)分離模式多樣、變量與代謝物直接相關(guān)等優(yōu)勢(shì)，逐漸成為代謝組學(xué)研究中最主要的分析工具之一。(1) GC-MS技術(shù)：GC的高效分離結(jié)合MS的結(jié)構(gòu)鑒定功能，使GC-MS具有高精密度、高靈敏度及經(jīng)久耐用性[7]，可以同時(shí)測(cè)定幾百個(gè)化學(xué)性質(zhì)不同的化合物。與LC-MS相比，GC-MS的優(yōu)勢(shì)在于可以從標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫中獲得化合物結(jié)構(gòu)信息，對(duì)代謝物易于定性，適合對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)的研究；缺點(diǎn)是樣品需做衍生化處理才能得到較多的代謝組分信息[8]，從而使得樣本前處理過程不僅復(fù)雜繁瑣，可能也會(huì)導(dǎo)致某些物質(zhì)信號(hào)的丟失。(2)LC-MS技術(shù)：相對(duì)于GC-MS，LC-MS能分析更高極性和更高相對(duì)分子質(zhì)量的化合物，主要應(yīng)用于臨床疾病診斷、部分疾病生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)等，并可通過對(duì)代謝物結(jié)構(gòu)的鑒定，對(duì)樣本進(jìn)行針對(duì)性和細(xì)致的分析，非常適合于生物樣本中復(fù)雜代謝產(chǎn)物的檢測(cè)和潛在標(biāo)志物的鑒定，已被越來越多地用于代謝組學(xué)研究[9-10]。尤其是超高效液相色譜(ultra performance liquid chromato-graphy，UPLC)技術(shù)的樣品前處理簡(jiǎn)單，對(duì)待測(cè)組分的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性沒有要求，不需繁瑣的衍生化步驟，可進(jìn)行快速高效的檢測(cè)[11]。其缺點(diǎn)是缺少可以參考的標(biāo)準(zhǔn)譜圖數(shù)據(jù)庫，代謝物鑒定需借助標(biāo)準(zhǔn)品，鑒別相對(duì)困難。但LC-MS 雖然缺少可以參考的標(biāo)準(zhǔn)譜圖數(shù)據(jù)庫，卻可以通過它獲得代謝物精確的分子質(zhì)量數(shù)，再通過數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢測(cè)確定分子的結(jié)構(gòu)信息[12]。

3．多種分析平臺(tái)的聯(lián)合應(yīng)用：代謝物本身具有多樣性與復(fù)雜性的特點(diǎn)，而每種分析平臺(tái)都存在自身的局限性，目前并沒有一個(gè)單一的技術(shù)可以同時(shí)測(cè)定和識(shí)別樣品中所有的代謝物，所以需綜合各分析平臺(tái)的數(shù)據(jù)以得到更全面的代謝物信息[13]。例如，為了覆蓋更廣泛的代謝物，Naz等[14]首次將多種互補(bǔ)分析技術(shù)成功應(yīng)用于患有敗血癥的大鼠肺組織，并且證明了在代謝組學(xué)研究和生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)中應(yīng)用多平臺(tái)方法的重要性。Jung等[15]應(yīng)用NMR和UPLC-MS 相結(jié)合的分析方法分別測(cè)定了兩種不同處理方式的黃芪根樣本，結(jié)果顯示去皮根的某些主要代謝物顯著損失，表明該技術(shù)為中藥材采收及處理后評(píng)估分析有效成分提供有力工具。Ibanez等[16]運(yùn)用多平臺(tái)分析技術(shù)研究膳食多酚對(duì)人類結(jié)腸癌細(xì)胞的抗增殖作用，發(fā)現(xiàn)多酚類代謝產(chǎn)物呈現(xiàn)顯著差異，同時(shí)證明了這種多分析平臺(tái)由于其互補(bǔ)性質(zhì)而提供了廣泛的代謝信息和覆蓋范圍。因此，將多種分析技術(shù)的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，既可提供更全面的代謝物輪廓信息，使結(jié)果更完善，也使不同分析技術(shù)的結(jié)果得到互相驗(yàn)證，達(dá)到分析平臺(tái)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)[17]。

二、代謝組學(xué)在胰腺外分泌疾病中的相關(guān)研究

胰腺是重要的消化器官，與蛋白質(zhì)、糖類、氨基酸、脂類代謝密切相關(guān)，一旦胰腺發(fā)生疾病，會(huì)引起人體營養(yǎng)物質(zhì)代謝嚴(yán)重紊亂。因此，應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)研究胰腺疾病的發(fā)病機(jī)制，有利于實(shí)現(xiàn)早期診斷或進(jìn)行藥物療效觀察。

1．代謝組學(xué)在AP中的相關(guān)研究：AP是消化內(nèi)科常見疾病，起病急，如不及時(shí)干預(yù)治療，常發(fā)生SIRS，從而引發(fā)高分解代謝狀態(tài)，導(dǎo)致能量需求和蛋白質(zhì)分解代謝增加[18]，因此AP患者伴有嚴(yán)重的代謝紊亂，而代謝紊亂狀況會(huì)進(jìn)一步擾亂氨基酸、葡萄糖和脂質(zhì)代謝，從而導(dǎo)致組織和器官損傷的并發(fā)癥。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明即使在組織損傷發(fā)生之前，胰腺炎癥的存在也會(huì)引起代謝物(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脂質(zhì)和?；撬?水平的改變，因此檢測(cè)代謝物水平有助于更好地了解患者病理生理狀況，從而有助于早期診斷疾病[19]。不同的代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于檢測(cè)大鼠AP模型尿液[20]、小鼠高脂血癥性AP模型血清[21]，表明模型構(gòu)建后血尿中代謝物的主要成分發(fā)生了變化；高分辨液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)被應(yīng)用于中藥治療前后AP模型大鼠血清的研究，發(fā)現(xiàn)了一些顯著差異的可能生物標(biāo)志物，包括甘油、谷氨酸、低密度脂蛋白、飽和脂肪酸、丙氨酸和谷氨酸酰胺等[22-23]。在臨床研究中，GC-MS被用于檢測(cè)AP患者血清并確定了一些潛在生物標(biāo)志物[24]；應(yīng)用超高效液相色譜-高分辨率質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry, UPLC-HRMS)分析顯示8種代謝產(chǎn)物(鞘氨醇、辛酰膽堿、甘氨膽酸、肉豆蔻酸、癸酰膽堿、十二烷醇、2-十四烷酮和L-甲狀腺素)在MAP患者血清中明顯增高，且其中4種還可隨著病情好轉(zhuǎn)而下降，從而可用作病情變化的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)指標(biāo)[25]；Villasen等[26]應(yīng)用NMR同時(shí)分析AP患者尿液和血漿的代謝表型，證實(shí)由鳥嘌呤、馬尿酸或肌酸(尿液)以及纈氨酸、丙氨酸、脂蛋白(血漿)組成的組合生物標(biāo)志物在AP中具有很強(qiáng)的診斷和預(yù)后潛力。以上研究表明，代謝組學(xué)在AP中的新發(fā)現(xiàn)，尤其是氨基酸與脂類代謝的變化為未來AP機(jī)制的研究提供了可能方向。

2．代謝組學(xué)在胰腺癌和CP中的相關(guān)研究：胰腺癌是癌癥相關(guān)死亡的第四大常見原因，5年生存率<5%[27]。由于診斷延遲和治療方案進(jìn)展緩慢，預(yù)計(jì)到2030年胰腺癌將成為癌癥相關(guān)死亡的第三大原因[28]。其致死性可歸因于晚期診斷以及對(duì)常規(guī)放、化療的幾乎完全抵抗性，因此為了能夠早期診斷胰腺癌，對(duì)可靠診斷生物標(biāo)志物的研究和定義仍然是一個(gè)受到極大關(guān)注的主題。胰腺腫瘤細(xì)胞的生長可以引起胰腺內(nèi)外分泌功能異常，導(dǎo)致機(jī)體能量、脂肪及氨基酸代謝狀態(tài)的改變，同時(shí)為適應(yīng)腫瘤組織引起的代謝異常，機(jī)體又出現(xiàn)一定的代償，最終引起血液、尿液及組織在代謝組分上的改變。通常在癌變過程中，基因和代謝物的異常變化都先于組織形態(tài)變化的發(fā)生，因此檢測(cè)這些異常變化將有助于腫瘤的早期診斷。迄今為止，國內(nèi)外已開展了多項(xiàng)關(guān)于代謝組學(xué)與胰腺癌的研究。Michálková等[29]通過應(yīng)用1H-NMR光譜對(duì)胰腺癌患者和健康對(duì)照者的血漿樣品進(jìn)行檢測(cè)，研究胰腺癌誘導(dǎo)的代謝變化，結(jié)果提示，3-羥基丁酸鹽和乳酸鹽的水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該結(jié)果(100%靈敏度，90%特異度)清楚地顯示了1H-NMR光譜在胰腺癌診斷中的潛力。Schmahl等[30]應(yīng)用NMR光譜比較5、11、15月齡的對(duì)照組及胰腺癌組小鼠尿液、血清、糞便提取物和胰腺組織提取物的代謝特征，檢測(cè)胰腺癌的癌前胰腺上皮內(nèi)瘤變，確定了潛在的生物標(biāo)志物(尿液：3-吲哚氧基硫酸鹽、苯甲酸鹽和檸檬酸鹽減少；血液：葡萄糖、膽堿、乳酸鹽、苯丙氨酸和苯甲酸鹽減少；糞便：乙偶姻增加)。Shu等[31]對(duì)226例胰腺癌患者及其匹配的健康對(duì)照者搜索胰腺癌風(fēng)險(xiǎn)的循環(huán)代謝生物標(biāo)志物，確定了4種與胰腺癌相關(guān)的代謝物，并且進(jìn)一步表明甘油磷脂的失調(diào)可能在胰腺癌發(fā)展中起重要作用。

CP是胰腺癌的高風(fēng)險(xiǎn)因素，約5%的CP患者發(fā)展為胰腺癌[32-33]，但兩者均以過度反應(yīng)性的基質(zhì)或結(jié)締組織為特征。在影像學(xué)的診斷過程中兩者經(jīng)常相互混淆，給疾病的鑒別和診斷帶來了很大困難。代謝組學(xué)為尋找早期區(qū)分二者的非侵入性診斷性標(biāo)志物開拓了更廣闊的前景。在一項(xiàng)大規(guī)模研究中，包括271例胰腺癌和282例CP在內(nèi)的914例受試者的血清和血漿經(jīng)過LC-MS和GC-MS檢測(cè)與驗(yàn)證分析，確定了29個(gè)代謝產(chǎn)物在CP和胰腺癌之間存在明顯差異，且預(yù)測(cè)CP患者中胰腺癌的發(fā)生率可以達(dá)到1.95%，其優(yōu)化預(yù)測(cè)值達(dá)到99.9%[34-35]。Lindahl等[36]使用基于LC-MS的代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)甘氨膽酸、N-棕櫚酰谷氨酸和己?；鈮A3種單一代謝產(chǎn)物以及加上苯乙酰谷氨酰胺、鵝去氧甘構(gòu)成的一個(gè)5種代謝物組合在兩個(gè)獨(dú)立的隊(duì)列中可以作為區(qū)分CP和胰腺癌的標(biāo)志物。

三、結(jié)語

AP、CP及胰腺癌發(fā)病率逐年提高、胰腺癌早期診斷方法有限、CP與胰腺癌鑒別困難以及這些胰腺外分泌疾病與機(jī)體代謝改變關(guān)系密切等因素，使代謝組學(xué)在胰腺疾病中的研究成為勢(shì)不可擋的新方向。代謝組學(xué)作為一種新興的系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)，因其簡(jiǎn)便無創(chuàng)、高通量、高精確性及高靈敏度的特點(diǎn)而迅速成為多學(xué)科、多領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，近年在胰腺疾病的研究中也有了一些新的進(jìn)展，但目前仍然具有一些不足之處，例如分析技術(shù)還不夠成熟、不同檢測(cè)分析技術(shù)的缺陷、收集的生物信息量過于龐大、數(shù)據(jù)建模和挖掘不充分等。隨著多種技術(shù)的進(jìn)一步革新發(fā)展，更高通量、高靈敏度的檢測(cè)技術(shù)與更高效的數(shù)據(jù)分析方法的整合應(yīng)用，以及代謝組學(xué)與各組學(xué)技術(shù)的聯(lián)用等，相信代謝組學(xué)技術(shù)在胰腺外分泌疾病的診斷、發(fā)生發(fā)展機(jī)制及治療中的應(yīng)用將會(huì)有突破性的進(jìn)展。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突