兒童哮喘糖皮質激素受體基因bcl-Ⅰ多態(tài)性及其對激素療效的影響

陳海燕

(勝利油田中心醫(yī)院，山東東營257034)

兒童哮喘是一種由肥大細胞、中性粒細胞等炎性細胞及組分參與的異質性氣道疾病，臨床表現以過敏性喘息等癥狀為主，發(fā)病機制較復雜，發(fā)病誘因多與環(huán)境及遺傳因素有關[1,2]。目前,吸入糖皮質激素是兒童哮喘患者治療的首選藥物，然而不同患者對吸入糖皮質激素的療效具有明顯的個體差異，這種個體敏感性的不同與糖皮質激素受體基因的多態(tài)性有關[3,4]。本研究擬以山東東營地區(qū)兒童哮喘患者為對象，分析糖皮質激素受體基因bcl-Ⅰ單核苷酸多態(tài)性(SNP)及其是否對激素療效有影響，為探討兒童哮喘發(fā)病機制及治療策略提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 隨機選取2014年10月～2017年6月在勝利油田中心醫(yī)院兒科門診就診的哮喘患兒285例(哮喘組)，符合2006年GINA兒童哮喘診斷標準。其中男185例、女100例，年齡3～12(4.7±1.5)歲，患兒1個月內未使用糖皮質激素。家長均簽署知情同意書。對照組選取勝利油田衛(wèi)生學校223例本人及三代以內直系親屬中無哮喘史、無肺部其他疾病史、無變態(tài)反應史的健康學生志愿者，其中男113例、女110例，年齡3～12(4.7±1.5)歲。

1.2 治療方法 根據患兒跟蹤隨訪，選取具有良好依從性哮喘組患兒120例，初始霧化吸入布地奈德混懸液1 mg+特布他林霧化液2.5 mg(或5 mg)霧化吸2次，持續(xù)治療15 d。維持期治療根據前1、3、6個月評估降階梯治療，調整布地奈德吸入量，最低劑量維持0.25 mg/d。

1.3 觀察指標與療效評定 分別在吸入布地奈德治療滿1、3、6個月時對入組患兒進行門診或電話隨訪，觀察哮喘患兒的日間癥狀、夜間癥狀、急性發(fā)作情況、應急藥物的使用、活動受限情況。評定標準：根據3次隨訪情況，按照哮喘急性發(fā)作次數進行分組，分為低效：出現>1次急性發(fā)作；高效：出現≤1次急性發(fā)作。

1.4 糖皮質激素受體基因bcl-Ⅰ SNP分析 分別采集哮喘組受試患兒與對照組口腔頰黏膜拭子，利用試劑盒提取基因組DNA，測定DNA濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用Taqman探針法對患兒基因組DNA樣本糖皮質激素受體基因bcl-Ⅰ SNP位點進行基因分型。根據位點的RS序號設計并合成Taqman引物與MGB探針各2條，探針分別使用FAM和VIC標記。采用PCR反應混合體系10 μL進行PCR擴增反應，然后在ABI 7900實時熒光定量PCR儀中進行終點讀板，由ABI SDS 2.3軟件判斷得出基因型。

1.5 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗研究樣本的群體代表性；計數資料以頻次或百分比表示，比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗 對bcl-Ⅰ SNP位點在哮喘組與對照組中進行Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗，P>0.05，表明糖皮質激素受體基因bcl-Ⅰ SNP位點在受試群體中處于遺傳平衡狀態(tài)，具有群體代表性。

2.2 兩組糖皮質激素受體基因bcl-Ⅰ基因型頻率及等位基因頻率比較 糖皮質激素受體基因bcl-Ⅰ共有3種基因型：CC純合型、GG純合型和CG雜合型。哮喘組中CC純合型基因型頻率高于其余兩種，GG純合型基因型頻率、G等位基因頻率高于對照組(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組糖皮質激素受體基因bcl-Ⅰ基因型頻率及等位基因頻率比較

2.3 不同bcl-Ⅰ基因型哮喘患兒的治療效果 對120例不同基因型哮喘患兒進行治療后發(fā)現，CC型患者高效52例、低效11例，高效率82.5%；GG型患者分別為10、16例，高效率38.5%；CG型患者分別為15、16例，高效率48.4%。CC型患者高效率高于GG型患者與CG型患者(χ2值分別為16.92、11.84，P均<0.05)。

3 討論

兒童哮喘是由多種細胞及其組分參與的氣道反應性炎癥疾病，其發(fā)病機制多與關鍵調控因子的基因突變有關[5,6]。目前吸入糖皮質激素是兒童哮喘患者長期治療的首選藥物，可有效控制哮喘癥狀、改善肺功能、降低氣道高反應性，減少患者急診和住院次數，并可望防止兒童哮喘遷延為終身疾患。然而糖皮質激素受體基因的變異可降低該受體對糖皮質激素的敏感性，形成激素依賴，這是難治性哮喘的一個重要原因[7]。SNP是人類細胞增殖發(fā)育過程中基因組DNA最常見的變異形式之一，因此對糖皮質激素受體關鍵基因的SNP分析是探討兒童哮喘及治療策略的重要方法[8]。

糖皮質激素的生物學作用需通過其受體介導實現。糖皮質激素受體是一種由配體激活的核轉錄因子，其編碼基因包含有10個外顯子，所表達的糖皮質激素受體可與擴散進入胞質內的糖皮質激素相結合形成復合物，進而進入細胞核中，結合并調控靶基因的轉錄活性，發(fā)揮生物學效應[9]。而糖皮質激素受體編碼基因的突變則會導致受體蛋白結構或表達異常，從而影響其與糖皮質激素的結合活性，降低糖皮質激素治療的敏感性，產生激素抵抗效應[10,11]。

目前，國內外學者對于糖皮質激素受體基因SNP的研究主要集中于bcl-Ⅰ、ER22/23EK與N3635等3處位點，不同區(qū)域不同人種間研究結果不盡相同[11]。bcl-Ⅰ位點多態(tài)性是指位于糖皮質激素受體基因外顯子2下游646核苷酸處的位點突變，C突變?yōu)镚(TGATCA突變?yōu)門GATGA)[12]。對于糖皮質激素受體bcl-Ⅰ位點多態(tài)性的研究最早出現于胰島素抵抗相關研究中，隨后的研究表明，bcl-Ⅰ SNP也與氣道阻塞及肺纖維化等疾病相關[13,14]。Anja等[15]發(fā)現，bcl-Ⅰ SNP與吸煙人群氣道變異嚴重程度有關。同時，bcl-Ⅰ SNP也與肺組織纖維化病變過程中炎性反應的發(fā)生及肺功能的惡化有關[13]。云哲琳等[12]研究表明，糖皮質激素受體基因bcl-Ⅰ多態(tài)性也與哮喘發(fā)生存在相關性。本文以山東東營地區(qū)兒童哮喘患者為對象，證實了糖皮質激素受體基因bcl-Ⅰ基因型頻率分布與正常兒童存在差異，其中G等位基因頻率較高，表明糖皮質激素受體基因bcl-Ⅰ G等位基因突變與該地區(qū)兒童哮喘相關。

此外，本文對糖皮質激素受體基因bcl-Ⅰ不同基因型的哮喘患兒進行了激素治療，發(fā)現CC型患者治療效果好于GG型患者與CG型患者。由此認為，哮喘患兒對糖皮質激素治療敏感性降低的主要原因可能是糖皮質激素受體基因bcl-Ⅰ G等位基因的突變導致了糖皮質激素受體蛋白結構或表達量發(fā)生改變。哮喘的發(fā)生受基因突變及環(huán)境因素共同影響，糖皮質激素受體基因的多態(tài)性研究對于哮喘易感及治療方式的選擇等均具有指導作用，具體臨床應用還需以后進一步多中心大樣本研究進行確認。

綜上所述，山東東營地區(qū)兒童哮喘糖皮質激素受體基因bcl-Ⅰ G等位基因突變；CC基因型哮喘患兒對于激素治療的敏感性高于GG與CG基因型。該發(fā)現為探討兒童哮喘發(fā)病機制及治療策略提供了依據。