LC-MS/MS法測(cè)定人血漿中肌苷濃度的不確定度評(píng)估

金冠欽，孫 黎，王玉洪，夏玲紅，林厚文(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200127；通信作者,E-mail:linhouwen@renji.com)

肌苷是人體內(nèi)重要物質(zhì)(ATP、輔酶A、核糖核酸及脫氧核糖核酸)的組成部分之一，為嘌呤從頭合成時(shí)腺苷酸和鳥(niǎo)苷酸的前體，在人體的物質(zhì)代謝及能量代謝過(guò)程中起關(guān)鍵作用。肌苷作為輔酶類藥物收錄于2020版《中國(guó)藥典》，用于白細(xì)胞減少癥、血小板減少癥、急性及慢性肝炎，以及肝硬化等疾病的輔助治療。近年來(lái)，肌苷越來(lái)越多的藥理作用被逐步發(fā)現(xiàn)，有研究顯示肌苷具有修復(fù)外周組織損傷及腦損傷[3-6]、抗抑郁等作用。各種證據(jù)顯示，該藥在保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。

不確定度分析是國(guó)際上推薦的用于定量評(píng)估檢測(cè)結(jié)果的重要手段之一，用于改進(jìn)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的方案，提高檢測(cè)質(zhì)量。已有報(bào)道[9,10]使用HPLC法測(cè)定肌苷注射液含量及肌苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備的不確定度評(píng)價(jià)，而使用LC-MS/MS法測(cè)定人血漿中肌苷含量的不確定度方法還尚未被報(bào)道。本研究首次根據(jù)計(jì)量技術(shù)規(guī)范《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》(JJF 1059.1-2012)[11]、《測(cè)量不確定度的要求》(CNAS-CL01-G003)[12]及《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室—測(cè)量不確定度的評(píng)定與表達(dá)》(CNAS-TRL-001:2012)[13]的要求，分析測(cè)定過(guò)程中不確定因素來(lái)源，計(jì)算不確定度分量，對(duì)LC-MS/MS法測(cè)定人血漿中肌苷濃度的方法進(jìn)行了不確定度評(píng)價(jià)，為方法的改進(jìn)提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料

3200QTrap質(zhì)譜儀(美國(guó)AB Sciex公司)串聯(lián)LC-20AD液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司)，AE240雙量程(量程40 g/200 g；精度0.01 mg/0.1 mg)分析天平(美國(guó)Mettler-Toledo公司)，Eppendorf手動(dòng)單道可調(diào)式移液器(德國(guó)Eppendorf公司)，Avanti30型高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)BECKMAN公司)，XW-80A渦旋混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)。肌苷對(duì)照品(批號(hào)：140669-201104，中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度99.1%)，內(nèi)標(biāo)(IS)拉米夫定(批號(hào)：101007-200701，中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度99.7%)，質(zhì)譜純甲醇、磷酸、氨水、乙酸均購(gòu)自Merck公司。

2 方法

2.1 人血漿中肌苷測(cè)定方法

2.1.1 色譜和質(zhì)譜條件 色譜條件為等度洗脫，流動(dòng)相為50 mmol/l乙酸銨水溶液(A) ∶甲醇(B)=1 ∶1，色譜柱為XBridgeC18柱(100 mm×2.1 mm,3.5 μm)，流速0.2 ml/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μl，肌苷和IS的保留時(shí)間分別為1.90 min，2.02 min。

肌苷和IS采用ESI+離子化方式，離子源溫度為700 ℃，離子噴霧電壓為5 000 V。在MRM模式下肌苷和IS的定量離子對(duì)分別為m/z269.1→137.1，m/z230.2→112.2。去簇電壓為26 V，碰撞電壓為15 V。

2.1.2 對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱量肌苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.1%)20.08 mg，用蒸餾水定容到100 ml容量瓶，振蕩均勻，得肌苷貯備液199.0 μg/ml。精密稱量肌苷標(biāo)準(zhǔn)品20.28 mg，用蒸餾水定容到100 ml容量瓶，振蕩均勻，得201.0 μg/ml質(zhì)控濃度貯備液。精密稱量9.97 mg拉米夫定(純度99.7%)，定容至500 ml，得內(nèi)標(biāo)物貯備液19.88 μg/ml。振蕩均勻，以上三瓶貯備液，均置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

吸取肌苷貯備液13 ml，使用蒸餾水定容至100 ml量瓶，得25.87 μg/ml溶液；吸取肌苷貯備液5 ml，定容至50 ml量瓶，得19.90 μg/ml溶液。再逐級(jí)稀釋配制濃度為9.95,4.975,2.488,1.244,0.622,0.311,0.155,0.077 μg/ml。質(zhì)量控制溶液濃度為：20.1,10.05,5.025,2.510,1.256,0.628,0.314,0.157,0.079 μg/ml。吸取拉米夫定內(nèi)標(biāo)貯備液5 ml，用蒸餾水定容至10 ml，得9.94 μg/ml；再取2 ml的9.94 μg/ml拉米夫定內(nèi)標(biāo)溶液，用蒸餾水定容至50 ml，得到397.6 ng/ml拉米夫定內(nèi)標(biāo)溶液。

2.1.3 血清樣品前處理 250 μl含藥血漿中加入內(nèi)標(biāo)液25 μl及250 μl的4.25%磷酸溶液，渦旋30 s，混勻后在HLB固相萃取柱上樣，先后使用水1 ml及甲醇1 ml除雜，最后使用流動(dòng)相溶液1 ml收集，離心(20 000 r/min)10 min，取上清液100 μl，按照“2.1.1”項(xiàng)下檢測(cè)。

2.1.4 對(duì)照品及質(zhì)控樣品溶液的配制 900 μl空白血漿中分別加入各濃度的對(duì)照品溶液100 μl，后續(xù)操作同“2.1.3”。

2.2 測(cè)量不確定度分析

在分析生物樣品的過(guò)程中，天平稱量、標(biāo)準(zhǔn)品純度、標(biāo)準(zhǔn)液制備、標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品的制備、血清樣品前處理、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、儀器允差等，均可引入測(cè)量結(jié)果的不確定[14]。測(cè)量不確定度方法有兩種，包括A類不確定度評(píng)定和B類不確定度評(píng)定兩類。A類評(píng)定是指用對(duì)觀測(cè)列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的方法評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)不確定度，即測(cè)量不確定度通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)差表示；B類評(píng)定是指用不同于測(cè)量不確定度A類評(píng)定的方法來(lái)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)不確定度，即測(cè)量不確定度通過(guò)一個(gè)假定的概率密度函數(shù)得到[11]。LC-MS/MS法測(cè)定人血漿中肌苷濃度的不確定度來(lái)源分析見(jiàn)圖2。

圖1 肌苷及內(nèi)標(biāo)物血漿樣品多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Figure 1 Representative multiple reaction monitoring chromatograms of inosine and IS

圖2 不確定度來(lái)源分析圖Figure 2 Analysis of uncertainty sources

3 結(jié)果

3.1 測(cè)量不確定度的A類評(píng)定

精密度引入的不確定度評(píng)定作為A類不確定度評(píng)定。按照“2.1.4”項(xiàng)下的方法制備低、中、高三個(gè)濃度(62.8，502.1，2 010 ng/ml)質(zhì)控樣品各3批(m=3)，每批次平行測(cè)定5次(n=5)。根據(jù)貝塞爾公式計(jì)算合并樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差：

公式中，i為組數(shù)，j為每組平行測(cè)定次數(shù)(i=3，j=5)，c為濃度水平。測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.2 測(cè)量不確定度的B類評(píng)定

3.2.1 稱量肌苷引入的測(cè)量不確定度 肌苷和內(nèi)標(biāo)均采用十萬(wàn)分之一級(jí)電子天平稱量，則天平稱量的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

=0.204 mg

=0.025

3.2.2 樣品配制引入的測(cè)量不確定度

3.2.2.5 肌苷標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品(S)和質(zhì)控樣品(QC)配制引入的不確定度 標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品由空白血漿900 μl及肌苷標(biāo)準(zhǔn)液100 μl渦旋混勻制成，不確定度主要由移液器引入。整個(gè)過(guò)程共使用100-1 000 μl移液器1次，10-100 μl移液器1次，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.2.3 生物樣品處理過(guò)程和基質(zhì)效應(yīng)引入的不確定度 樣品處理過(guò)程引入的不確定度，通過(guò)樣品的提取回收率來(lái)體現(xiàn)。配制低、中、高濃度質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度各5份，按“2.1.3”方法處理后進(jìn)樣。根據(jù)如下公式計(jì)算提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)：

提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 肌苷血漿樣品提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)

則低、中、高肌苷血漿樣品提取回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

urel(5,M)=0.028

urel(5,H)=0.015

低、中、高肌苷血漿樣品基質(zhì)效應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

urel(6,M)=0.032

urel(6,H)=0.019

3.2.5 線性擬合過(guò)程引入的不確定度 使用肌苷峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值對(duì)肌苷濃度進(jìn)行線性擬合，標(biāo)準(zhǔn)曲線共包含10個(gè)濃度，權(quán)重因子為1，采用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線中肌苷與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值見(jiàn)表3，三條標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)見(jiàn)表4，擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線反算出標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品的肌苷濃度見(jiàn)表5。

表3 肌苷與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值

表4 線性擬合回歸曲線方程

表5 標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線后的肌苷濃度 (ng/ml)

自相關(guān)方差為：

殘余標(biāo)準(zhǔn)差為：

=7.635 ng/ml

u(8,xM)=7.150 ng/ml

u(8,xH)=9.388 ng/ml

因此，線性擬合的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度為：

陳雷部長(zhǎng)對(duì)此語(yǔ)重心長(zhǎng)：“水利工作與民生息息相關(guān)，不能簡(jiǎn)單地把民生水利局限于某些具體工程項(xiàng)目上。強(qiáng)調(diào)民生水利，旨在樹(shù)立一種發(fā)展理念，倡導(dǎo)一種價(jià)值取向，確立一種實(shí)踐要求，實(shí)現(xiàn)一種目標(biāo)追求。”

則：urel(8,L)=0.123

urel(8,M)=0.014 5

urel(8,H)=0.004 78

3.2.6 樣品不均勻性和對(duì)照品純度引入的不確定度 肌苷及內(nèi)標(biāo)均未提供不確定度，故將其引入的不確定度視為0。血漿樣品經(jīng)渦旋混勻、上樣及過(guò)濾等過(guò)程，視為混合均勻，故樣品不均勻性引入的不確定度忽略不計(jì)[17]。

3.2.7 溫度引入的不確定度 肌苷對(duì)照品均按說(shuō)明書要求置于105 ℃，2 h烘干后使用，實(shí)驗(yàn)室溫度受控，未出現(xiàn)較大變化，故溫度引入的不確定度忽略不計(jì)[18]。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度的合成及擴(kuò)展

LC-MS/MS測(cè)定人血漿肌苷的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

據(jù)此公式計(jì)算，得肌苷低、中、高濃度質(zhì)控樣品的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度分別為：

ucrel(H)=0.091

肌苷質(zhì)控樣品的合成標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度為：

則低、中、高濃度質(zhì)控樣品的合成標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度分別為：ucel(L)=0.14×61.99=8.68 ng/ml，ucrel(M)=45.44 ng/ml，ucrel(H)=178.73 ng/ml。

置信概率為P=95%時(shí)(k=2)，擴(kuò)展不確定度為：

U=k×ucel(QC)

則低、中、高濃度質(zhì)控樣品的擴(kuò)展不確定度分別為17.36，90.88，357.46 ng/ml。

4 討論

不確定度評(píng)定可查明實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的誤差來(lái)源及大小，評(píng)估結(jié)果的準(zhǔn)確度，并以此提升檢測(cè)質(zhì)量。本文建立LC-MS/MS法測(cè)定人血漿中肌苷的濃度，并對(duì)其進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。通過(guò)精密度、稱量、標(biāo)準(zhǔn)液的配制、標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品的配制、生物樣品處理過(guò)程、基質(zhì)效應(yīng)及線性擬合等方面，對(duì)該方法的不確定度來(lái)源進(jìn)行分析。其中，在低、中濃度樣品中，線性擬合對(duì)不確定度的貢獻(xiàn)最大，標(biāo)準(zhǔn)曲線在計(jì)算過(guò)程中，未增加權(quán)重因子進(jìn)行線性擬合，所以造成低、中濃度樣品偏離程度較大，而對(duì)高濃度樣品的影響較小。因此，在符合檢測(cè)范圍的情況下，可以進(jìn)行加權(quán)或者增加低、中濃度點(diǎn)樣品的個(gè)數(shù)，提高測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確度。高濃度樣品為天平稱量引起的合成不確定度貢獻(xiàn)最大。本實(shí)驗(yàn)使用的是十萬(wàn)分之一級(jí)電子天平，當(dāng)對(duì)照品稱量的質(zhì)量較小時(shí)可引起更大的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，可通過(guò)增加肌苷對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)對(duì)照品的稱量質(zhì)量，以減少其對(duì)不確定度的貢獻(xiàn)值。

綜上所述，本研究評(píng)價(jià)了LC-MS/MS法測(cè)定人血漿中肌苷濃度的不確定度，且不確定度主要由天平稱量和線性擬合引入。