結腸癌中氨磷汀對順鉑的增敏作用及其腎臟的保護作用

劉夢潔,王文娟,姜麗麗(西安交通大學第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,西安 710061;通信作者,E-mail:lingyinnancy@163.com)

結腸癌是常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在男性中位于第三,在女性中位于第二[1]。盡管近年來靶向治療在結腸癌中得到了長足的進展,但手術結合術后輔助化療仍為結腸癌的主要治療方式。

順鉑是一種常見的化療藥物,用于多種腫瘤的治療[2,3],它也是除5-氟尿嘧啶外另一種治療結腸癌的常用化療藥物。順鉑具有較強的細胞毒性,可抑制腫瘤細胞的DNA復制過程,并破壞細胞膜結構,有較強的廣譜抗癌作用。但是順鉑具有一定的毒副作用,對于身體虛弱者也會產(chǎn)生較大損傷,比如引發(fā)患者惡性嘔吐、腎功能衰竭、手足抽搐等不良反應[4,5],制約了順鉑在臨床上的應用[6]。因此,尋找增加腫瘤細胞對順鉑的敏感性、降低順鉑對機體的毒性作用的方法十分重要。

目前關于化療藥物毒副作用的研究受到了廣大學者的關注,相應地也提出了不少針對性的化療保護劑,比如谷胱甘肽、硫代硫酸鈉、右丙亞胺、氨磷汀等[2]。谷胱甘肽是一種天然的含疏基三肽,對于人體全身解毒和避免氧化劑損傷有著較強的作用,可以有效減輕順鉑導致的腎功能異常和神經(jīng)毒性[3]。硫代硫酸鈉主要解除患者局部使用大劑量順鉑時引發(fā)的毒副作用。右丙亞胺則主要針對化療藥阿霉素引起的心臟毒性進行防護,且不影響其抗腫瘤作用。氨磷汀又稱阿米福汀,是一種半胱氨酸衍生的廣譜細胞保護藥物。由于在腫瘤患者接受化療的過程中,正常組織細胞也會遭受到活性氧(reactive oxygen species,ROS)引起的損傷,而氨磷汀幾乎可以選擇性保護所有正常組織免受放化療損害,特別是烷化劑、鉑類藥物帶來的不良反應[7]。近期的研究顯示,氨磷汀在盆腔腫瘤患者的放療過程中發(fā)揮著保護腸道和膀胱黏膜的作用[8],可以提高食管癌細胞對順鉑的敏感性[9]。但其對結腸癌細胞發(fā)揮的作用尚不明確。

因此,本研究通過體外細胞實驗和裸鼠皮下移植瘤模型的構建,旨在探討氨磷汀對順鉑的增敏作用及腎臟保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 本實驗選用4周齡的雄性BALB/c裸鼠,共48只,均購買自西安交通大學實驗動物中心。

1.1.2 實驗細胞 小鼠結腸癌細胞CMT93和人結腸癌細胞SW620購買自中國科學院上海細胞庫。

1.1.3 主要試劑及儀器 恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Themo Fisher Scientific公司);超凈工作臺(美國Themo Fisher Scientific公司);多功能酶標儀(德國BMG LABTECH公司);DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司);胎牛血清(以色列Biological Industries公司);胰酶干粉(美國SIGMA公司);CCK-8試劑盒(美國Solarbio公司);肌酐試劑盒(武漢艾美捷科技有限公司);尿素氮試劑盒(上海景源醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn))。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 本研究所用的CMT93細胞和SW620細胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),2-3 d傳代一次。

1.2.2 CCK-8實驗檢測細胞活性 收集對數(shù)生長期的CMT93細胞和SW620細胞,以5 000個/孔的密度接種于96孔板中,待細胞貼壁后,用0,0.02,0.04,0.08,0.16 mg/L的順鉑分別與0,100,200,800 mg/L的氨磷汀聯(lián)合處理CMT93細胞和SW620細胞,于培養(yǎng)24 h時在每孔加入15 μl的CCK-8試劑,再放入培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)4 h,取出96孔板,在450 nm波長處測定吸光度。通過Bliss法,結合各組細胞的OD值,計算氨磷汀與順鉑在體外的聯(lián)合指數(shù)。

1.2.3 裸鼠皮下移植瘤的構建及體內(nèi)驗證 為了明確氨磷汀聯(lián)合順鉑在體內(nèi)的作用,本研究將48只裸鼠隨機分為兩組,分別構建CMT93細胞皮下移植瘤模型和SW620細胞皮下移植瘤模型,每種模型24只;每種模型隨機分為4組,分別為對照組、順鉑組、氨磷汀組、氨磷汀+順鉑組,每組6只。收集對數(shù)生長期的CMT93細胞或SW620細胞1×106個,用100 μl無血清DMEM培養(yǎng)基混勻,注射于裸鼠右側臀部皮下。接種后第4天開始給予不同的處理:對照組腹腔注射250 μl的生理鹽水;順鉑組腹腔注射4 mg/kg順鉑;氨磷汀組腹腔注射200 mg/kg氨磷汀;聯(lián)合組腹腔注射200 mg/kg氨磷汀+4 mg/kg順鉑。四組均于第1,8,15,22天時分別進行上述處理,于第28天脫頸法處死小鼠。從接種開始檢測移植瘤體積,繪制生長曲線,直至處理完畢處死小鼠,收集皮下移植瘤,稱取移植瘤和裸鼠的質(zhì)量;收集裸鼠腎臟并稱取質(zhì)量,計算腎臟指數(shù)(腎臟指數(shù)=腎臟質(zhì)量/裸鼠質(zhì)量×100%);收集外周血,檢測血清中的肌酐及尿素氮。

1.2.4 統(tǒng)計學分析 本研究在SPSS22.0軟件中進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以平均數(shù)±標準差表示,兩組數(shù)據(jù)差異性比較采用獨立樣本t檢驗。將P<0.05作為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 氨磷汀在體外協(xié)同增強順鉑對結腸癌細胞的抑制作用

CCK-8檢測各組細胞活性,結果顯示:隨著順鉑和氨磷汀單藥濃度的增加,CMT93細胞和SW620細胞的活性逐漸降低,呈劑量依賴性;對于單藥處理組,兩藥聯(lián)合處理組CMT93細胞和SW620細胞的增殖抑制作用更加強烈(見圖1)。通過Bliss方法計算得到兩藥聯(lián)合指數(shù)分別為25.698(SW620細胞)和27.65(CMT93細胞),結果如圖2所示:順鉑聯(lián)合氨磷汀可以在體外協(xié)同抑制CMT93細胞和SW620細胞的增殖。

2.2 氨磷汀聯(lián)合順鉑有效地抑制結腸癌細胞裸鼠皮下移植瘤的生長

繪制各組小鼠移植瘤生長曲線,結果顯示,順鉑組和聯(lián)合組移植瘤生長較對照組受到了顯著抑制;聯(lián)合組移植瘤生長顯著慢于順鉑組(見圖3,4)。順鉑組和聯(lián)合組移植瘤體積顯著小于對照組(P<0.001);聯(lián)合組移植瘤體積顯著小于順鉑組(P<0.01,見圖5);氨磷汀組移植瘤體積稍小于對照組,差異不具有統(tǒng)計學意義。順鉑組和聯(lián)合組移植瘤質(zhì)量顯著小于對照組(P<0.001);聯(lián)合組移植瘤質(zhì)量顯著小于順鉑組(P<0.001,見圖6);氨磷汀組移植瘤質(zhì)量稍小于對照組,差異不具有統(tǒng)計學意義。

A.SW620細胞皮下移植瘤大體標本B.CMT93細胞皮下移植瘤大體標本圖3 各組皮下移植瘤大體標本Figure 3 The gross specimen of subcutaneou transplantation tumors in each group

與空白對照組相比,aP<0.01,bP<0.001;與順鉑組相比,cP<0.01,dP<0.001圖4 各組皮下移植瘤生長曲線Figure 4 The growth curve of subcutaneou transplantation tumors in each group

與空白對照組相比,***P<0.001;與順鉑組相比,##P<0.01圖5 各組皮下移植瘤體積Figure 5 The volume of subcutaneou transplantation tumors in each group

與空白對照組相比,***P<0.001;與順鉑組相比,###P<0.001圖6 各組皮下移植瘤質(zhì)量Figure 6 The weight of subcutaneou transplantation tumors in each group

2.3 氨磷汀減輕順鉑對裸鼠的腎損傷

采用腎臟指數(shù)和外周血尿素氮、肌酐水平評估氨磷汀對順鉑誘導小鼠腫瘤模型腎損傷的作用。結果顯示,順鉑組小鼠腎臟指數(shù)較對照組顯著增加(P<0.001);氨磷汀組小鼠腎臟指數(shù)與對照組無統(tǒng)計學差異;聯(lián)合組小鼠腎臟指數(shù)較順鉑組顯著下降(P<0.001,見表1)。順鉑組小鼠血肌酐和尿素氮的水平較對照組顯著上升(P<0.001);氨磷汀組小鼠血肌酐和尿素氮的水平較對照組無統(tǒng)計學差異;聯(lián)合組小鼠血肌酐和尿素氮的水平較順鉑組顯著下降(P<0.001,見表2)。

表1 氨磷汀對小鼠腎臟指數(shù)的影響

表2 氨磷汀對小鼠外周血肌酐及尿素氮的影響 (mmol/L)

3 討論

順鉑是臨床上常用的非特異性抗腫瘤化學藥物,使用的劑量越大,對腫瘤細胞的殺傷力越強,但因此而產(chǎn)生的毒性也越大。當順鉑進行人體后會由于腎臟器官的存儲功能滯留造成腎毒性,所以常因發(fā)生急性腎損傷或腎衰竭而限制其臨床應用。因此,如何在保證順鉑發(fā)揮正常療效的同時并減緩乃至防止其誘發(fā)腎毒性是當前臨床非常關注的問題[10]。

本研究首先在體外實驗中選擇了小鼠結腸癌細胞CMT93和人結腸癌細胞SW620,運用CCK-8實驗評估了氨磷汀能否在細胞學水平上增強順鉑的抗腫瘤效果,結果顯示氨磷汀與順鉑兩藥體外的聯(lián)合指數(shù)分別為25.689(SW620細胞)和27.650(CMT93細胞),提示兩藥協(xié)同抑制結腸癌細胞的增殖。這說明,在達到同樣抑制率的前提下,氨磷汀的使用可以減少順鉑的用量。

接著,本研究通過腎功能指標尿素氮、肌酐、腎臟指數(shù)來評估氨磷汀在順鉑對小鼠腫瘤模型腎損傷中的作用,結果顯示順鉑組的尿素氮、肌酐、腎臟指數(shù)顯著高于對照組(P<0.001),氨磷汀組尿素氮、肌酐、腎臟臟指數(shù)與對照組無顯著性差異(P>0.05),氨磷汀聯(lián)合順鉑組尿素氮、肌酐、腎臟指數(shù)顯著小于順鉑組(P<0.001),這表明氨磷汀單獨作用不會影響小鼠腫瘤模型腎臟功能,在與順鉑聯(lián)合用藥時可以有效改善順鉑引發(fā)的腎功能損傷,保護腎臟細胞的正常功能。

綜上所述,本研究從動物水平和細胞學水平上分析了氨磷汀在小鼠結腸癌化療中順鉑誘發(fā)腎損傷的保護作用及抗腫瘤效應。但是本研究還存在一些不足之處,所選取的小鼠樣本量偏少,仍需要后續(xù)研究的驗證。總而言之,化療保護劑氨磷汀能夠有效改善順鉑引發(fā)的腎功能損傷,提高正常細胞的存活率,并且能夠協(xié)同增強順鉑在結腸癌細胞中的抗腫瘤效果。