一種高效提取干燥植物樣品DNA的方法

任夢云　陳彥君　王建軍　王美興　黃益峰　杜龍崗　關(guān)瀟

摘要：野外采集樣品通常采用硅膠干燥的方法，但會不同程度降解DNA影響提取效果。為解決干燥植物樣品DNA難提取的問題，提出CTAB法與全式金植物基因組DNA提取試劑盒相結(jié)合的方法，并以4種中藥材為試驗材料，利用改良CTAB法、傳統(tǒng)CTAB法及試劑盒法等進(jìn)行鑒定，并用PCR擴增和酶切驗證檢測提取DNA的質(zhì)量。結(jié)果表明，CTAB法與全式金植物基因組DNA提取試劑盒相結(jié)合的方法能夠有效去除多酚和糖類物質(zhì)對DNA提取的干擾，并有效富集DNA，尤其適用于臨近干燥或枯萎的植物干燥葉片，PCR擴增和酶切反應(yīng)進(jìn)一步證明利用該方法提取DNA能夠達(dá)到下游試驗的要求。本研究有效解決了傳統(tǒng)方法提取干燥樣品DNA低效的問題，能為接下來分子標(biāo)記的開發(fā)、遺傳多樣性和后續(xù)遺傳學(xué)分析提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：干燥植物;DNA提取方法;DNA產(chǎn)率;瓊脂糖凝膠;電泳;PCR擴增;酶切試驗

中圖分類號：Q94-34+1;S184 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）19-0048-04

收稿日期：2019-10-08

基金項目：浙江省農(nóng)業(yè)（糧食）新品種選育重大科技專項（編號：2016C02050-9-2）。

作者簡介：任夢云（1991—），女，安徽淮北人，博士，助理研究員，從事分子生物學(xué)研究。E-mail：916103207@qq.com。

通信作者：關(guān) 瀟，博士，高級工程師，從事轉(zhuǎn)基因作物風(fēng)險評估工作，E-mail：cynthia815@126.com;杜龍崗，碩士，副研究員，從事鮮食玉米新品種選育及相關(guān)耕作制度研究，E-mail：dlg138@163.com。

從植物組織中提取高質(zhì)量的基因組DNA是進(jìn)行分子生物學(xué)研究的第1步和必要條件[1]。高質(zhì)量的基因組DNA是進(jìn)行如簡單重復(fù)序列標(biāo)記（SSR）、限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（RFLP）、隨機擴增多態(tài)性DNA標(biāo)記（RAPD）、簡單重復(fù)序列間擴增（ISSR）等后續(xù)遺傳多樣性分析的基礎(chǔ)[2]。迄今為止，人們提出了諸多提取DNA的方法，目前最常用的提取方法是十二烷基苯磺酸鈉（SDS）法、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[3]。遠(yuǎn)距離采樣一般無法對材料即刻提取DNA，通常采用硅膠脫水干燥保存。然而有研究表明，從硅膠保存的植物樣品中提取的基因組DNA會出現(xiàn)不同程度的降解現(xiàn)象，而且DNA的質(zhì)量和濃度不及從新鮮樣品中提取到的DNA[4]。尤其枯萎的植物樣品中DNA易被核酸內(nèi)源酶降解，硅膠干燥后DNA降解程度更加嚴(yán)重，造成DNA提取質(zhì)量下降[5]。因此，亟待開發(fā)一種能夠適用于臨近枯萎植物干燥樣品的基因組DNA提取通用方法以適應(yīng)研究要求。

本研究以山莨菪（Anisodus tanguticus）、桃兒七（Sinopodophyllum hexandrum）、四數(shù)獐牙菜（Swertia tetraptera）、橢圓葉花錨（Halenia elliptica）4種中草藥為材料，分別從紫外吸光度、凝膠電泳、PCR擴增、酶切驗證等方面對傳統(tǒng)CTAB法、改良CTAB法和試劑盒法3種DNA基因組的提取方法進(jìn)行比較，以期尋找能提取干燥樣品較好質(zhì)量DNA的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

山莨菪、桃兒七、四數(shù)獐牙菜、橢圓葉花錨分別來源于甘肅省門源縣、碌曲縣神山山、臨潭縣貢巴寺和貢巴寺，樣本均于2016年9月采集。

本研究中的改良CTAB法裂解緩沖液與常規(guī)配方相同，具體如下：CTAB 20 mg/mL，NaCl 1.4 mol/L，二胺四乙酸（EDTA）0.01 mol/L，三羥甲基氨基甲烷（Tris）0.1 mol/L，調(diào)節(jié)pH值至8.0。

1.2 DNA提取

分別采用傳統(tǒng)CTAB法、北京全式金生物技術(shù)有限公司提供的DNA提取試劑盒（目錄號為EE111）法（簡稱試劑盒法）以及改良CTAB法（即利用傳統(tǒng)CTAB法與試劑盒法相結(jié)合的方法）提取4種植物的基因組DNA。改良CTAB法中所述的EB、BB1、CB1、WB1、RnaseA均來自北京全式金生物技術(shù)有限公司提供的DNA提取試劑盒（目錄號為EE111），根據(jù)該試劑盒說明書的記載，EB、BB1、CB1、WB1分別為溶解液、結(jié)合液1、清洗液1、洗液1。

取90 mg干燥植物材料，粉碎，分裝，分別用上述3種方法提取DNA，DNA提取試劑盒的方法嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行。改良CTAB法步驟：（1）稱取30 mg干燥植物干材料，粉碎（如前所述）;（2）加入已預(yù)熱CTAB裂解緩沖液和一定體積的RnaseA，渦旋振蕩，于65 ℃下水浴30～50 min，每隔5 min上下顛倒混勻;（3）轉(zhuǎn)移上清至干凈的離心管中，加入等體積的三氯甲烷-異戊醇（體積比為24 ∶1，下同），顛倒混勻，15 ℃，12 000 r/min，離心10 min，取上清;（4）轉(zhuǎn)移上清至干凈的離心管中，加入上清液2/3體積的預(yù)冷至-20 ℃的異丙醇，輕顛倒混勻，于-20 ℃下靜置30 min;（5）靜置液于15 ℃、12 000 r/min條件下離心10 min，倒掉上清，在離心管中加入400 μL EB溶液溶解沉淀，同時加入 400 μL 的三氯甲烷-異戊醇混合液，上下顛倒混勻，于15 ℃、12 000 r/min條件下離心 10 min，取上清;（6）轉(zhuǎn)移上清至干凈的離心管中，加入等體積的BB1，顛倒混勻，將混合液轉(zhuǎn)移至干凈的離心柱中，于15 ℃、12 000 r/min條件下離心 5 min;（7）棄液體，加入500 μL CB1，靜置5 min，于15 ℃、12 000 r/min 條件下離心5 min;（8）棄液體，加入500 μL WB1，于15 ℃、12 000 r/min條件下離心 5 min，重復(fù)本步驟至少1次;（9）棄液體，于15 ℃、12 000 r/min條件下離心5 min，徹底去除殘留的WB1;（10）棄離心管，將離心柱放置在干凈濾紙上風(fēng)干5 min;（11）將離心柱轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中，向離心柱中心膜上加入40 μL預(yù)熱至60～70 ℃的EB，靜置2 min，于15 ℃、12 000 r/min條件下離心 2 min，重復(fù)本步驟至少1次;（12）棄離心柱，收集所得離心液，即得植物基因組DNA;（13）測定DNA的濃度和純度，-20 ℃保存。

1.3 DNA產(chǎn)率和質(zhì)量檢測

1.3.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測

比較不同方法提取DNA的得率，瓊脂糖凝膠電泳時每個樣品上樣3 μL DNA溶液。配制1%瓊脂糖凝膠，電泳液為1×TBE緩沖液[生工生物工程（上海）股份有限公司]，GoldView（北京賽百盛基因技術(shù)有限公司）染色，于100 V條件下電泳30 min。利用UPV紫外成像系統(tǒng)（EC3 system，美國）掃描成像。

1.3.2 分光光度計檢測

采用紫外分光光度計（Merinton，SMA4000）分別測量DNA溶液在230、260、280 nm處的吸光度。通過計算D260 nm/D280 nm和D230 nm/D260 nm的值分別獲得DNA溶液中蛋白、多糖、酚類的含量以及RNA的污染度，從而估算DNA濃度，公式為DNA樣品濃度（μg/μL）=D260 nm×稀釋倍數(shù)×50。

1.3.3 PCR檢測

通過PCR（德國Biometra公司）反應(yīng)驗證改良CTAB法所獲得的DNA的質(zhì)量，25 μL PCR反應(yīng)體系包含12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix、上下游引物各0.5 μL、2 μL基因組DNA（濃度約為40 ng/μL）、9.5 μL ddH2O。用于擴增ITS序列的1對通用引物的序列為ITS1（5′-AGAAGTCGTAACAAGGTTTC-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTTATATGC-3′）[6]。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min 40 s，35個循環(huán);72 ℃終延伸10 min，16 ℃，停止反應(yīng)。

1.3.4 酶切驗證

20 μL酶切體系包括：5 μL DNA模板（200 ng/μL），2 μL 10×FlyCutTM Buffer，0.5 μL EcoRⅠ酶（20 U/μL），12.5 μL ddH2O。PCR程序為37 ℃ 10 min，65 ℃ 20 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA得率和質(zhì)量

用3種不同的方法提取樣品基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1、圖2所示，DNA條帶清晰，無明顯降解拖尾現(xiàn)象，尤其改良CTAB法提取的DNA條帶清晰、明亮（圖1）。

根據(jù)D260 nm/D280 nm的檢測值（表1）發(fā)現(xiàn)，改良CTAB法提取的DNA質(zhì)量較好，傳統(tǒng)CTAB法和試劑盒法略差（D260 nm/D280 nm<1.7），說明這2種方法抽提的DNA中可能含有蛋白質(zhì)雜質(zhì)。改良CTAB法提取的DNA的濃度明顯高于其他2種提取方法，除山莨菪試劑盒法提取的DNA濃度最低。

2.2 PCR驗證和酶切試驗

DNA的提取是分子生物學(xué)研究中至關(guān)重要的第1步，因此DNA提取方法的適用性還需要下游試驗的驗證。本研究通過PCR和酶切進(jìn)一步驗證該提取方法所獲得的DNA的質(zhì)量。

利用ITS引物以本研究提取獲得的上述4種植物基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴增，結(jié)果見圖3。

4個樣品中都擴增出了清晰的目的條帶。PCR試驗結(jié)果證明，改良CTAB提取法獲得的植物基因組DNA符合下游試驗的要求。

EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶酶切電泳結(jié)果如圖4所示，酶切獲得的條帶在凝膠上呈均勻的彌散狀分布，這表明改良CTAB法的DNA純度良好，符合酶切試驗及下游試驗的要求。

3 討論與結(jié)論

在正常條件下，傳統(tǒng)CTAB法以及試劑盒法都可以用于植物基因組DNA的抽提，但是如果從DNA的濃度、純度和質(zhì)量上綜合考慮來說，本試驗改良CTAB法提取干燥樣本植物基因組DNA效率最好。在實際工作中，仍然須要根據(jù)植物本身的特性和不同的試驗要求來選擇合適的提取方法[7-8]。

目前最好的植物基因組DNA提取材料是鮮樣或者是-80 ℃凍存保留的樣本材料[9-13]。但是當(dāng)采樣地位于野外時，野外采樣一般無法對材料即刻提取DNA，通常采用硅膠干燥，而經(jīng)過硅膠干燥保存的植物樣品的基因組DNA會發(fā)生不同程度的降解，提取的DNA質(zhì)量和濃度遠(yuǎn)比從鮮樣中提取的差。尤其枯萎的植物樣品中DNA易被核酸內(nèi)源酶降解，硅膠干燥后DNA降解程度更加嚴(yán)重，提取質(zhì)量下降。因此，針對長期遠(yuǎn)距離采樣難保存樣品的問題，應(yīng)尋找一種新的、簡便經(jīng)濟實用的干燥樣本DNA提取方法。

本研究利用全式金基因組DNA提取試劑盒所改良的CTAB法，能夠有效去除多酚和糖類物質(zhì)對DNA提取的干擾，尤其適應(yīng)于臨近干燥或枯萎的植物干燥葉片，能夠有效地富集DNA，并消除顏色對DNA的影響。PCR試驗結(jié)果證明，改良CTAB法獲得的DNA能夠達(dá)到下游試驗的要求。與現(xiàn)有技術(shù)相比，該方法具有以下優(yōu)點：（1）利用該方法從干燥植物樣品組織中獲得的DNA量顯著高于普通提取方法獲得的DNA，且DNA純度符合下游應(yīng)用的要求。（2）經(jīng)PCR和酶切試驗證明最終獲得的DNA能夠達(dá)到一般分子生物學(xué)研究的要求。（3）該提取方法具有通用、高效和簡便的特點。從表1和圖4可以看出，傳統(tǒng)CTAB法以及試劑盒法均不能從上述樣品中成功提取出DNA，紫外分光光度計檢測結(jié)果表明提取獲得的DNA純度較差，不符合下游試驗要求。本研究的改良CTAB法適合干燥樣本，干燥樣本操作方便，不受太多地理及環(huán)境因素的限定，適用于遠(yuǎn)距離樣品的采集。

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